Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
GISELLE FERREIRA RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA AUTOFAGIA EM LEVEDURAS DE Paracoccidioides brasiliensis SUBMETIDAS A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE
São José dos Campos, SP 2016
GISELLE FERREIRA RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA AUTOFAGIA EM LEVEDURAS DE Paracoccidioides brasiliensis SUBMETIDAS A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Flavia Villaça Morais.
São José dos Campos, SP.
2016
GISELLE FERREIRA RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA AUTOFAGIA EM LEVEDURAS DE Paracoccidioides brasiliensis SUBMETIDAS A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE
Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas, do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Presidente: Profa. Dra. Flavia Villaça Morais (Univap) Orientadora: Profa. Dra. Flavia Villaça Morais (Univap) Membro Interno: Profa. Dra. Renata de A. Canevari (Univap) Membro Externo: Profa. Dra. Claudia B. L. de Campos (Unifesp)
Prof. Dr. Leandro José Raniero Diretor do IP&D – Univap
São José dos Campos, 16 de dezembro de 2016.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho primeiramente а Deus, por ser o meu guia, socorro presente na hora da angústia, iluminando meu caminho durante toda esta jornada.
A minha família, em especial aos meus pais, Ronaldson e Rosangela, formadores do meu caráter, pelo amor, confiança e incansável apoio em todos os momentos de minha vida, principalmente nas horas mais difíceis, e, incentivo de nunca desistir dos meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Flavia Villaça Morais, minha orientadora, por todo incentivo e exemplos de postura ética e comprometimento com o ensino e a pesquisa e por me receber e orientar em seu laboratório desde a iniciação científica.
Aos meus colegas e parceiros pela troca de experiências, principalmente pela amizade e pelos bons momentos.
A minha colega, Caroline, pela amizade, apoio e companheirismo durante todo o tempo que estivemos no laboratório, contribuindo de forma significativa para o desenvolvimento de nosso trabalho.
A todos os professores e funcionários que estiveram envolvidos de alguma forma, disponibilizando laboratórios, equipamentos e também pelas orientações.
RESUMO
Paracoccidioides spp. são fungos termodimórficos e agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica frequente na América Latina. Esta doença pode se instalar, após a infecção do hospedeiro, por meio da inalação dos conídios do fungo e transição para a forma leveduriforme nos alvéolos pulmonares.
Estudos demonstram que microrganismos patogênicos utilizam fontes de nutrientes durante sua colonização e que, a falta destes, desencadeia vários mecanismos regulatórios, entre eles a autofagia. Autofagia é um mecanismo envolvido em muitos processos biológicos, o que promove a degradação de macromoléculas e organelas em condições normais de crescimento, além da manutenção da homeostase celular sob qualquer tensão metabólica, tais como a temperatura ou a privação de nutrientes. Este trabalho propôs uma melhor compreensão da autofagia para a adaptação e sobrevivência de leveduras do isolado 18 de Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) crescidas em: 1) diferentes concentrações de glicose; 2) na presença de moduladores da autofagia. Por conseguinte, foram avaliadas, a proliferação, viabilidade, alterações morfológicas e formação de autofagossomos e vesículas ácidas, em todas as condições de crescimento. A incubação de leveduras do Pb18 por 72 horas com rapamicina, fármaco estimulador da autofagia, em comparação com a cultura na ausência do fármaco, foi capaz de inibir a formação de pseudo-hifas, tipo celular encontrado nas culturas do fungo. Além disso, promoveu o aumento no diâmetro e no número de brotos das leveduras, ocasionando aumento da massa celular do fungo nessas condições. Já a cultura incubada com MHY1485, inibidor de autofagia, apresentou, em comparação com a cultura na ausência do composto, aumento na quantidade de pseudo-hifas e na massa celular do fungo, após três e seis dias de sua adição. As leveduras de Pb18 crescidas em condições limitadas de glicose apresentaram vacúolos autofágicos e massa celular diminuída, se comparadas com a cultura crescida em 2% de glicose. Nossos resultados sugerem que a autofagia é um mecanismo utilizado pelo fungo para a adaptação de leveduras de P. brasiliensis, mas, em condições limitadas de glicose, não é suficiente para garantir uma sobrevivência prolongada.
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis. Leveduras. Glicose. Autofagia.
Rapamicina. MHY1485.
ABSTRACT
Paracoccidioides spp. are thermodimorphic fungi that cause paracoccidioidomycosis, a frequent systemic mycosis in Latin America. This disease can be installed after inhalation of fungal conidia and its transition to yeast, in the host pulmonary alveoli.
Studies have shown that pathogenic microorganisms found different nutrient sources during its colonization that can trigger regulatory mechanisms, such as autophagy, mainly in starvation conditions. Autophagy is a mechanism involved in many biological processes, which promotes the degradation of macromolecules and organelles under normal growth conditions, besides the maintenance of cellular homeostasis under any metabolic stress, such as temperature or nutrient deprivation.
This work proposes the understanding of autophagy for adaptation and survival of yeasts of Paracoccidioides brasiliensis, isolated 18, growing in 1) different glucose concentrations; 2) in the presence of autophagic modulators compounds. Therefore, were evaluated the proliferation, viability, morphological changes, autophagosomes and acidic vesicles formation, in all growth conditions. Compared to the Pb18 control culture, Pb18 culture added of rapamycin, an autophagy activator, had inhibited the pseudohyphal formation and yeasts had an increase in the diameter and in the number of buds, generating a high cellular mass of the fungi, after three days of treatment. With MHY1485, Pb18 culture presented a high number of pseudohyphal and an increase in cellular mass of the fungi, after three and six days of treatment.
Pb18 yeasts growing in glucose limited conditions, presented autophagic vacuoles and acidic vesicles, but had diminished proliferation, compared to the Pb18 control culture. Our findings suggest that autophagy is required for P. brasiliensis yeasts adaptation but, under glucose limited conditions, is not enough to guarantee P.
brasiliensis prolonged survival.
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis. Yeast. Glucose. Autophagy. Rapamycin.
MHY1485.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Peso seco total e viabilidade celular de leveduras do Pb18. ... 33 Figura 2 – Diferenciação morfológica e mensuração do diâmetro das leveduras do Pb18. .. 36 Figura 3 – Morfologia das células do Pb18. ... 37 Figura 4 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após um dia de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia. ... 39 Figura 5 – Vacúolos autofágicos corados por monodansilcadaverina (MDC), após um dia de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia. ... 40 Figura 6 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após três dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia. ... 41 Figura 7 – Vacúolos autofágicos corados por monodansilcadaverina (MDC), após três dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia. ... 42 Figura 8 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após seis dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia. ... 43 Figura 9 – Vacúolos autofágicos corados por monodansilcadaverina (MDC), após seis dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia. ... 44 Figura 10 – Coloração de autofagossomos e/ou vacúolos autofágicos com anticorpo Anti- Atg8 conjugado com fluoróforo FITC. ... 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Diferença percentual da quantidade de pseudo-hifas do Pb18 nas culturas SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M, em relação ao controle (SD), após um, três e seis dias de cultivo. ... 35 Tabela 2 – Média do diâmetro (µm) das leveduras do Pb18 nas culturas SD, SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M, após um, três e seis dias de cultivo. ... 36
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AMPK Proteína cinase ativada por monofosfato de adenosina ANOVA Análise de variância
AO Laranja de acridina
Atg Proteína relacionada a autofagia ATP Adenosina trifosfato
cAMP adenosina 3',5'-monofosfato cíclico E1 Enzina ubiquitina tipo 1
E2 Enzina ubiquitina tipo 2 FLO11 Proteína de floculação 11 LC3II Proteína de cadeia leve 3 MDC Monodansilcadaverina mTOR TOR de mamíferos
MHY1485 4,6-dimorpholino-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine PAS Sítio de iniciação do fagóforo
Pb18 Isolado 18 de Paracoccidioides brasiliensis PBS Tampão fosfato-salino
PCM Paracoccidioidomicose PKA Proteína quinase A PS1 Espécie filogenética 1 PS2 Espécie filogenética 2 PS3 Espécie filogenética 3 PS4 Espécie filogenética 4 S1 Espécie 1
Sch9 Proteína serina/treonina cinase SD Meio sintético definido
SNARE Receptor de proteína de ligação de fator sensível a N-etilmaleimida solúvel Snf1 Sacarose não-fermentante 1
TOR Alvo da rapamicina TORC1 Complexo TOR 1 TORC2 Complexo TOR 2
YNB Base nitrogenada de levedura
YPD Extrato de levedura-peptona-dextrose
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 15
2.1 Paracoccidioides spp. e a Paracoccidoidomicose ... 15
2.2 A Autofagia e a Privação de Nutrientes ... 20
2.3 Moduladores da autofagia ... 26
3 OBJETIVOS ... 27
3.1 Objetivo Geral ... 27
3.2 Objetivos Específicos ... 27
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 28
4.1 Microrganismos e condições de cultivo de Paracoccidioides brasiliensis. ... 28
4.2 Avaliação da massa celular das culturas de P. brasiliensis ... 29
4.3 Análise da viabilidade celular ... 29
4.4 Morfometria e morfologia de P. brasiliensis ... 29
4.5 Coloração de vesículas ácidas por Acridina Orange ... 30
4.6 Coloração de vacúolos autofágicos por Monodansilcadaverina ... 30
4.7 Ensaio de imunofluorescência ... 31
4.8 Analise estatística ... 31
5 RESULTADOS ... 32
5.1 Massa celular e viabilidade de leveduras de Pb18 ... 32
5.2 Morfologia e morfometria de leveduras de Pb18 ... 34
5.3 Análise da presença de vacúolos autofágicos ... 38
6 DISCUSSÃO ... 46
7 CONCLUSÃO ... 50
REFERÊNCIAS ... 51
1 INTRODUÇÃO
Espécies de Paracoccidioides são fungos termodimórficos e agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica frequente nos países da América Latina, tendo o Brasil 80% dos casos. À temperatura ambiente (25ºC), este fungo apresenta-se na forma de micélio e no hospedeiro, ou quando cultivado a 36ºC em meios enriquecidos, se encontra na forma de levedura. Após a infecção do hospedeiro, por meio da inalação dos conídios, o fungo sofre transição termodimórfica e as leveduras podem se instalar nos alvéolos pulmonares, causando a PCM doença. Dos pulmões, essas células podem se disseminar pela corrente sanguínea e/ou pelo sistema linfático para outros órgãos, como baço e fígado.
Uma das primeiras barreiras de defesa enfrentadas por Paracoccidioides spp. após a infecção do hospedeiro são os macrófagos residentes no pulmão, cujo interior é um meio pobre em nutrientes, como glicose e aminoácidos. Desta forma, a adaptação ao estresse metabólico representa vital atributo para o fungo, levando-o a desencadear vários mecanismos regulatórios, como a autofagia.
Autofagia é um processo altamente regulado e conservado em organismos eucariotos, envolvido na degradação e reciclagem de macromoléculas e organelas em condições de crescimento normal e na manutenção da homeostase celular frente a algum estresse metabólico, seja, alteração de temperatura ou privação de nutrientes, necessários para o crescimento do fungo, tais como carbono, aminoácidos, nitrogênio e íons metálicos.
Considerando que a autofagia é um mecanismo envolvido em diversos processos biológicos como adaptação, diferenciação e desenvolvimento celular, e ainda não descrito em espécies de Paracoccidioides, este trabalho propôs analisar a relevância desse mecanismo para a adaptação das leveduras do fungo em condições de estresse metabólico, limitação e ausência de glicose, bem como o comportamento de leveduras do Pb18 cultivadas na presença de compostos moduladores da autofagia. Com esse propósito as alterações morfológicas, a viabilidade, a formação de vacúolos autofágicos e de vesículas ácidas de leveduras de Pb18, cultivadas em diferentes concentrações de glicose ou presença de
compostos moduladores da autofagia, foram analisadas e comparadas com uma cultura controle.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Paracoccidioides spp. e a Paracoccidoidomicose
Paracoccidioides é o gênero de fungos termodimórficos causadores da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, confinada geograficamente à América Latina. O Brasil detém 80% dos casos registrados de PCM, sendo as regiões Sudeste (Estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Minas Gerais), Centro-Oeste (principalmente nos Estados de Goiás e Mato Grosso do Sul) e Sul (do Paraná para o Norte do Rio Grande do Sul) as mais afetadas (MARTINEZ, 2015). Os outros países mais atingidos são Venezuela, Colômbia e Argentina (MARTINEZ, 2015). Segundo estudos, baseados em intradermorreação com paracoccidioidina, de 11 a 43,8% da população das áreas endêmicas já foi exposta a Paracoccicioides spp. (GÓES et al., 2014).
A ocorrência da PCM é da ordem de um a três novos casos por 100.000 habitantes a cada ano, sendo considerada a oitava causa de morte por doença infecto-parasitária crônica, com taxa de mortalidade de 1,45 casos/1.000.000 de habitantes. De 1996 a 2006, a PCM foi responsável por 51,2% dos óbitos ligados às micoses profundas no Brasil (PRADO et al., 2009), porém por não ser uma doença de notificação compulsória, os dados epidemiológicos relativos à PCM não são totalmente conclusivos (WANKE; AIDÊ, 2009; GÓES et al., 2014; TABORDA et al., 2015;).
A paracoccidioidomicose, também conhecida como blastomicose sul- americana e doenca de Lutz-Splendore-Almeida, foi inicialmente descrita por Adolfo Lutz em 1908, no Instituto Bacteriológico de São Paulo, que verificou, em lesões bucais de dois pacientes, a existência de fungos de natureza dimórfica, distintas do Coccidioiddes immitis. O P. brasilensis, até então frequentemente confundido com C. immitis, foi relacionado, por Lutz, como o patógeno de uma doença qualificada como micose pseudococcídica e, posteriormente, incluída em um grupo denominado de hifoblastomicoses americanas (LUTZ, 1908). O primeiro isolado do agente causal foi obtido em 1912 por Alfonso Splendore, o qual o classificou dentro do gênero Zymonema, propondo a denominação de Zymonema brasiliensis. A classificação definitiva e, consensualmente, aceita foi realizada por Floriano Paulo de Almeida, em 1930, após diversos estudos comparativos entre o agente etiológico da PCM e o C.
immitis. Assim, o gênero Paracoccidioides foi criado e a espécie brasiliensis, descrita anteriormente por Splendore, foi revalidada (ALMEIDA, 1930). A oficialização do termo paracoccidioidomicose só ocorreu em 1971 (MOREIRA, 2008).
À temperatura ambiente (25ºC), as espécies de Paracoccidioides se apresentam sob a forma de colônias brancas e algodonosas, denominadas saprofíticas ou miceliais. Microscopicamente, a essa temperatura, observam-se hifas delgadas, hialinas, septadas, multinucleadas e ramificadas, com produção de clamidoconídios terminais ou intercalares e conídios (SAN-BLAS; NIÑO-VEGA;
ITURRIAGA, 2002). Essa forma é preferencialmente encontrada em solos argilosos ou arenosos, ricos em matéria orgânica e ácido-úrico, entre outras fontes de nitrogênio, em ambientes úmidos, clima tropical e subtropical (BAGAGLI et al., 2008;
MOREIRA, 2008). No hospedeiro ou quando cultivado a 36ºC em meios enriquecidos, Paracoccidioides spp. desenvolvem colônias cremosas e cerebriformes, que microscopicamente apresentam pseudo-hifas e/ou leveduras, células arredondadas ou ovais, multinucleadas, com paredes celulares espessas e multibrotamentos, resultando num típico aspecto de “roda de leme” ou “cabeça de Mickey”. Esta fase do fungo, parasitária, é a encontrada nas lesões nos tecidos do hospedeiro (SAN-BLAS; NIÑO-VEGA; ITURRIAGA, 2002; MOREIRA, 2008).
Os hospedeiros definitivos de Paracoccidioides spp. são o ser humano (Homo sapiens) e algumas espécies de tatus como tatu-de-nove-bandas (Dasypus novemcitus) e, ocasionalmente, tatu-de-rabo-mole (Cabassus centralis), (THEODORO, 2010). O fungo, Também já foi isolado de lesões de cães domésticos (RICCI et al. 2004), bem como da ração desses animais (FERREIRA et al., 1990), em fezes de pinguim (GESUELE, 1989), em trato intestinal de morcegos (GROSE;
TRAMSITT, 1995) e em animais silvestres, como porquinho da índia (Cavia aperea) e porco-espinho (Sphiggurus spinosus) (BAGAGLI et al., 2008).
A infecção por Paracoccidioides spp. ocorre por meio da inalação dos conídios liberados pelo micélio do fungo, mas o estabelecimento da doença só ocorre se houver reversão para forma leveduriforme nos alvéolos pulmonares (MCEWEN et al., 1987). O local inicial da doença é, portanto, os pulmões, contudo o fungo pode se disseminar pela corrente sanguínea e/ou pelo sistema linfático para outras regiões do organismo como pele, baço, fígado, adrenais, linfonodos e medula óssea (PEREIRA et al., 2009). A PCM-infecção é detectada em pacientes com imunidade celular preservada, sem sinais ou sintomas da doença, mas, que
apresentam positividade em testes cutâneos frente à paracoccidioidina (MOREIRA, 2008; GÓES et al., 2014)
A PCM pode se apresentar, clinicamente, em duas formas: forma aguda/subaguda, conhecida como “tipo juvenil”, ou forma crônica, conhecida como
“tipo adulto”. Nesta classificação são consideradas as manifestações clínicas e os parâmetros imunológicos da patologia. Depois de inalar o fungo, o organismo hospedeiro pode resolver a infecção espontaneamente, mas, quando isso não ocorre, o indivíduo pode apresentar sintomas da PCM após algumas semanas, ou mesmo depois de muitos anos. Neste último caso, o fungo permaneceu quiescente nos alvéolos pulmonares e se reativou, principalmente, por imunidade deficiente do hospedeiro (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006; MOREIRA, 2008; MARTINEZ, 2015).
A PCM-Doença de forma aguda é responsável por 5 a 35,5% dos casos de PCM e acomete crianças e adultos jovens de ambos sexos, com menos de 30 anos, na mesma proporção. Nesse caso, os indivíduos afetados apresentam acentuada depressão da resposta imune e a doença caracteriza-se por ter uma evolução rápida (4-12 semanas de instalação da doença) com acometimento de todas as vísceras, frequentemente, afetando a suprarrenal. Essa forma é rara e, quando ocorre, compromete o sistema fagocítico-mononuclear, que leva a disfunção da medula óssea. O indivíduo afetado apresenta linfoadenomegalia, acometimento digestivo e osteo-articular, hepatoesplenomegalia e lesões cutâneas. Mulheres que trabalharam ou tiveram contato com o solo, quando crianças ou até os 20 anos, podem desenvolver PCM na menopausa, ou em caso de imunidade reduzida (SHIKANAI- YASUDA et al., 2006; MOREIRA, 2008; BELLISSIMO-RODRIGUES; MACHADO;
MARTINEZ, 2011).
A PCM-Doença forma crônica acomete, principalmente, homens dos 30 aos 50 anos (90% dos casos) e está relacionada a dois fatores principais. Um deles é a ocupação dos infectados, normalmente por trabalhadores rurais, que geralmente são do sexo masculino. O outro é a reconhecida proteção natural que as mulheres possuem em função do hormônio 17-β-estradiol, capaz de afetar a transição da fase de micélio para levedura desses fungos e induzir os macrófagos a liberarem de óxido nítrico (NO), destruindo as leveduras por eles internalizadas (HONG; ZHU, 2004; SHANKAR et al., 2011). Deve-se ressaltar ainda que a ocorrência de paracoccidioidomicose entre as mulheres vem diminuindo (FABRIS et al., 2014). A forma crônica da PCM progride lenta e silenciosamente, podendo levar anos para
ser diagnosticada. Há acometimento do pulmão em 25% dos casos, podendo ser uni ou multifocal. Além disso, esta forma caracteriza-se pelo comprometimento dos linfonodos cervicais e submandibulares e acometimento perioral, podendo atingir o tecido cerebral (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006; MOREIRA, 2008; FORTES et al., 2011; MARQUES, 2013).
A PCM requer tratamento prolongado, dependendo da droga e da gravidade da doença, levando normalmente, cerca de dois anos para se alcançar a cura. O abandono precoce do tratamento gera recaídas, complicações e sequelas anatômicas e funcionais, tais como a fibrose pulmonar e a insuficiência respiratória (GÓES et al., 2014; SAFE et al., 2014; MARTINEZ, 2015).
Taxonomicamente as espécies de Paracoccidioides pertencem ao Reino Fungi, Filo Ascomycota, Classe Pleomycetes, Ordem Onygenales, Família Ajellomycetaceae, que inclui os gêneros Blastomyces, Histoplasma e Emmonsia, com os quais compartilha um ancestral comum, Lacazia loboi (MOREIRA, 2008;
TEIXEIRA et al., 2014).
Por meio de estudos moleculares, como a análise de Multi Locus Sequence Typing (MLST), a PCM passou a ser vista como uma micose sistêmica causada por pelo menos duas espécies do gênero, P. brasiliensis e P. lutzii (MATUTE et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2009; PIGOSSO et al., 2013). Os isolados de P. brasiliensis foram subdivididos entre quatro espécies crípticas diferentes (S1, PS2, PS3 e PS4).
S1 (Species 1) é um grupo monofilético, composto por isolados amplamente distribuídos na América do Sul e tem sido associados com a maioria dos casos de PCM detectados até o presente momento. PS2 (Phylogenetic Species 2) é um grupo parafilético, composto por isolados identificados até o momento apenas no Brasil e Venezuela. PS3 (Phylogenetic Species 3) é um grupo monofilético, composto por isolados exclusivamente colombianos. Devido à alta similaridade genética entre S1 e PS3, Matute e colaboradores (2006) atribuíram a especiação do grupo PS3 a um possível evento de migração, seguido de isolamento geográfico de isolados do grupo S1 para a Colômbia. PS4 (Phylogenetic Species 4) foi recentemente identificada e é composta de uma população monofilética de isolados clínicos da Venezuela (TEIXEIRA et al., 2014).
No ano de 2009, P. Lutzii foi descrito como sendo o mais divergente do gênero, composto apenas por um grupo monofilético, com isolados semelhantes ao Pb01, encontrados nas regiões, central, sudoeste e norte do Brasil e no Equador.
Essas espécies se diferenciam na cinética de crescimento, na expressão de proteínas, no grau de adesão, em relação à maneira que penetram em diferentes tipos de células e no tipo de doença que causam. Essas diferenças dão suporte à variação da virulência e da patogenicidade entre os isolados (TEIXEIRA et al. 2009;
THEODORO et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2015).
Para obter sucesso em sua colonização, Paracoccidioides spp. precisam aderir à superfície da célula, por meio da interação de moléculas, tais como a Gp43 (VICENTINI et al., 1994; POPI; LOPES; MARIANO, 2002), 14-3-3 (MARCOS et al., 2015; SILVA et al., 2015; GARCIA-RODAS e NOSANCHUK, 2016), PbHAD32 hidrolase (HERNÁNDEZ et al., 2010), enolase (ENO) (DE OLIVEIRA et al., 2014), malato sintase (MLS) (DA SILVA NETO et al., 2009; DE OLIVEIRA et al., 2013;
COSTA et al., 2015), gliceraldeído3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (BARBOSA et al., 2006) e 1,6 bisfosfate aldolase (ALD) ( MARCOS et al., 2014). Essas moléculas são capazes de interagir com diferentes componentes do tecido do hospedeiro como proteínas da matriz extracelular (ECM), incluindo colágeno, plasminogênio (NOGUEIRA et al., 2010), laminina, fibronectina, e fibrinogênio (GONZALEZ et al., 2005) e com células epiteliais e endoteliais (TAMAYO et al. 2013). Muitas dessas adesinas são secretadas ou estão associadas à parede celular fúngica e desempenham funções importantes, tais como a obtenção de nutrientes (WEBER et al., 2012; DE OLIVEIRA et al., 2015).
Para a adaptação ao novo ambiente, de algum modo, Paracoccidioides spp.
precisam superar os diferentes estresses metabólicos (PARENTE-ROCHA et al., 2015), como por exemplo, privação de nutrientes (LIMA et al., 2014), variação de temperatura (TIWARI et al., 2015), disponibilidade de íons metálicos (BAILÃO et al., 2012), hipóxia (LIMA et al., 2015) e pH (DECHANT et al., 2014).
A adaptação ao ambiente e invasão de células do sistema imunológico do hospedeiro (TAVARES et al., 2007) são a chave para a sobrevivência do fungo após a infecção, pois se bem sucedidos, permitirão que os micélios inalados se diferenciem em levedura e se instalem no hospedeiro (COONEY; KLEIN, 2008).
Nos pulmões, conídios e partes de micélio do fungo entram em contato com macrófagos e são fagocitados por essas células de defesa (SOARES et al., 2010), pobres em nutrientes, como glicose e aminoácidos (Lima et al., 2014). Essa internalização gera para o fungo uma situação de estresse nutricional que precisa ser superada para a instalação da doença. Desta forma, a adaptação ao estresse
metabólico representa vital atributo para o fungo conseguir se diferenciar em levedura, se manter e se replicar dentro dos macrófagos. Além disso, como nos pulmões a disponibilidade de nutrientes é limitada, os fungos buscam esses elementos em outros locais por meio da corrente sanguínea ou linfática (OLIVEIRA et al., 2014).
Parente-Rocha e colaboradores (2015) observaram que, durante a interação entre as leveduras de Paracoccidoides brasiliensis e os macrófagos, proteínas relacionadas a estresse oxidativo estão superexpressas no fungo e que, para se adaptar ao ambiente interno do macrófago, as leveduras reprogramam seu metabolismo para produzir glicose, além de inibir a síntese proteica. Nesse trabalho os autores sugerem, por análise de proteoma, que a glicose seja obtida por gliconeogênese, cujos precursores derivam da degradação do esqueleto de carboidratos liberados pela degradação de aminoácidos e que os lipídeos são os combustíveis para a sobrevivência do fungo dentro dessas células. Adicionalmente, estes autores indicaram a superexpressão de proteínas relacionadas à autofagia, mecanismo que seria utilizado pelo fungo na degradação de aminoácidos, entre outros componentes celulares.
2.2 A Autofagia e a Privação de Nutrientes
Estudos demonstram que os fungos, assim como todos os organismos eucarióticos, possuem uma via de reciclagem de nutrientes conhecida como autofagia (BABA; OSUMI; OHSUMI, 1995), que se define como um processo dinâmico e programado, envolvido em degradação de organelas danificadas e reciclagem de proteínas antigas em condições de crescimento normal ou em situações de estresse metabólico, para manutenção da homeostase celular (YANG;
KLIONSKY, 2009). Assim, este mecanismo desempenha um papel importante na diferenciação, adaptação e desenvolvimento celular de diversos eucariotos (ECKER et al., 2010; LOPEZ-BERGES et al. 2010; LIMA et al., 2014).
Existem três mecanismos distintos de autofagia denominados microautofagia, autofagia mediada por chaperonas (CMA) e macroautofagia (HUANG; KLIONSKY, 2002). Microautofagia consiste na direta imersão de componentes citoplasmáticos por lisossomos (SAKAI et al., 1998). A CMA degrada seletivamente proteínas citosólicas com sequências peptídicas específicas, que são
reconhecidas por chaperonas e enviadas até a membrana lisossomal, local em que são desenroladas e translocadas para o lúmen do lisossomo para serem degradadas (FERREIRA et al., 2013).
A forma de autofagia abordada no presente estudo é a macroautofagia, que compreende o engolfamento de componentes citoplasmáticos por uma dupla membrana para a formação do autofagossomo (YANG; KLIONSKY, 2009). A fusão entre as a membranas do autofagossomo e do vacúolo/lisossomo formam o vacúolo autofágico ou autofagolisossomo (KNÆVELSRUD; SIMONSEN, 2012), organela que promove a degradação do autofagossomo e do conteudo em seu interior por hidrolases residentes nos vacúolos ou lisossomas (KUMA; MIZUSHIMA, 2010). Essa degradação gera aminoácidos, nucleotídeos e ácidos graxos, que são translocados para o citoplasma, por meio de transportadores presentes na membrana do vacúolo autofágico ou autofagolisossomo (FENG et al., 2014).
Diversos fatores estimulam a autofagia nas células, como variação da temperatura, privação de nutrientes, estresse oxidativo (CEBOLLERO; REGGIORI, 2009; YANG; KLIONSKY, 2009) e, também, pela inibição da proteína cinase TOR (Target Of Rapamycin), uma das principais moléculas com papel regulatório no controle da indução da autofagia, que está ativada nas células crescidas em condições normais, inibindo a formação dos vacúolos autofágicos (POLLACK;
HARRIS; MARTEN, 2009; MORUNO et al., 2012; STEELE et al., 2013).
O mecanismo de sinalização que induz a macroautofagia é conhecido por funcionar na ausência de nova síntese proteica (ABELIOVICH et al., 2000), enquanto o tamanho dos autofagossomos ou a amplitude da resposta depende da regulação de proteínas, chamadas Atg’s (Autophagy-related proteins) (NAKATOGAWA; ICHIMURA; OHSUMI, 2007; ECKER et al., 2010). Em condições de crescimento normal a autofagia ocorre em nível basal nas células, contudo em condições de privação de nutrientes, há um aumento na produção de proteínas de membrana do autofagossomo, permitindo sua formação em maior número e aumento de seu volume (BACKUES; LYNCH-DAY; KLIONSKY, 2012).
Durante a privação de nutrientes, a autofagia promove a degradação de proteínas não essenciais, inicialmente, liberando aminoácidos livres que são utilizados para síntese de novas proteínas (POLLACK; HARRIS; MARTEN, 2009).
Em leveduras, a autofagia é afetada principalmente pela privação de nitrogênio, mas
na privação de glicose, também, desempenha um papel importante (MORUNO et al., 2012).
Os sinais necessários para ativação do processo autofágico devem ser altamente regulados, pois tanto o excesso quanto a diminuição da autofagia são prejudiciais às células (POLLACK; HARRIS; MARTEN, 2009). O envolvimento da autofagia na fisiopatologia de doenças neurodegenerativas tem atraído um interesse considerável porque o desequilíbrio do processo autofágico tem sido associado a algumas desordens neurodegenerativas. Este interesse é ainda mais acentuado pela demonstração de que as vias autofágicas estão implicadas na reciclagem de proteínas que são propensas à agregação em doenças celulares ou modelos animais (CHEUNG; IP, 2011).
Aung-Htut e colaboradores (2013) demonstraram a importância da autofagia para manutenção da estrutura mitocondrial em leveduras de Saccharomyces cerevisiae cultivadas em concentração elevada de glicose. A autofagia, também, se mostrou essencial para longevidade de leveduras de Saccharomyces cerevisiae frente à privação de aminoácidos (ALVERS et al., 2008).
Em Aspergillus nidulans privado de carbono a autofagia proporcionou a regulação das funções mitocondriais e a respiração aeróbica (KROHN et al., 2014).
Em Aspergillus oryzae, mantidos sob privação de nutrientes, a autofagia apresentou papel essencial para desenvolvimento das hifas (POLLACK; HARRIS; MARTEN, 2009) e em Magnaporthe oryzae foi fundamental para o crescimento de hifas aéreas, conidiação e diferenciação assexuada adequada (DENG; NAQVI, 2010).
Esses exemplos demonstram a importância da autofagia para a diferenciação, adaptação e desenvolvimento e reprodução de eucariotos (BABA; OSUMI; OHSUMI, 1995; LÓPEZ-BERGES et al. 2010).
Os carboidratos são a principal fonte de carbono metabólico para a maioria dos organismos e são usados para a geração de energia e para a produção de biomoléculas. Estudos demonstraram uma correlação entre a adição de glicose e o aumento subsequente nos níveis de ATP (adenosina trifosfato) intracelular. Por outro lado, quando a fonte de energia se esgota ocorre uma diminuição nos níveis de ATP, ativando a AMPK (AMP-activated protein kinase) que, por conseguinte inibe a proteína cinase TOR, promovendo a autofagia (NAZARKO et al., 2008; LIMA et al., 2014).
TOR é uma serina/treonina cinase, altamente conservada em organismos eucarióticos (INOKI; GUAN, 2006), importante na regulação do crescimento (WULLSCHLEGER; LOEWITH; HALL, 2006) e proliferação celular (RALLIS;
CODLIN; BÄHLER, 2013). Essa proteína atua promovendo diversos processos anabólicos, incluindo a biossíntese de proteínas, lipídios e organelas (LAPLANTE;
SABATINI, 2009), e limitando processos catabólicos como a autofagia (NODA;
OHSUMI, 1998). TOR foi identificada em Saccharomyces cerevisiae, por Heitman e colaboradores (1991), como sendo alvo do fármaco imunossupressor rapamicina.
Em leveduras há duas cinases Tor, Tor1p e Tor2p, envolvidas na formação de dois complexos multiproteícos, TorC2 e TorC1, respectivamente (RALLIS;
CODLIN; BÄHLER, 2013) TorC2 é insensível à rapamicina (LOEWITH; HALL, 2011) e contém Tor1p. Esse complexo está envolvido em respostas celulares relacionadas a danos no DNA, silenciamento de genes e comprimento dos telômeros (SCHONBRUN et al., 2009), além de estar envolvido na regulação da morfologia celular, possivelmente pela modulação da polimerização da actina (DÍAZ-TROYA et al., 2008; INOKI; GUAN, 2006). Tor2p é uma proteína essencial e está associada com TorC1, complexo sensível à rapamicina (KIM; GUAN, 2015), que regula diretamente a macroautofagia (NODA; OHSUMI, 1998), além de vários processos relacionados com o crescimento celular (WULLSCHLEGER; LOEWITH; HALL, 2006), tais como síntese proteica (SENGUPTA; PETERSON; SABATINI, 2010) e biogênese de ribossomos (PESTOV; SHCHERBIK, 2012).
A Tor é regulada por influência de fatores nutricionais, estresse, oxigênio, energia e outros sinais, como de drogas moduladoras (LAPLANTE; SABATINI, 2009). Ao ser inibida, TorC1 permite a desfosforilação de Atg1 que juntamente com Atg13 e o subcomplexo Atg17-Atg31-Atg29, formam o complexo Atg1 cinase, responsável por recrutar outras proteínas Atg’s para a formação do fagóforo no PAS (Phagophore Assembly Site). Atg13 pode ligar-se a Atg1 e ao subcomplexo Atg17- Atg31-Atg29 diretamente, porém não existe um sítio de ligação conhecido em Atg1 ao subcomplexo (YANAGISAWA; KIKUMA; KITAMOTO, 2013; REGGIORI;
KLIONSKY, 2013; WEN; KLIONSKY, 2016).
Uma proteína transmembranar, Atg9, desempenha um papel na orquestração dos lipídios das membranas de organelas e os encaminha ao PAS, atuando como um veículo lipídico para expansão do fagóforo. O complexo cinase Atg1, juntamente com os complexos Atg2-Atg18 e PtdIns3K (phosphatidylinositol 3-
kinase), levam a Atg9 até as estruturas periféricas proximais às mitocôndrias. Com o auxilio de Atg11, Atg23, Atg27 e Atg41, a proteína Atg9 regride para o PAS. A quantidade de Atg9 é reflexo da atividade da autofagia, estando diretamente relacionada com a quantidade de autofagossomos presentes nas células (WEN;
KLIONSKY, 2016).
Ren e colaboradores (2017), estudando o fungo patogênico de plantas Botrytis cinerea, verificaram a superexpressão do gene relacionado à autofagia, BcATG1, em condições de privação de nitrogênio ou glicose. Mostraram, também, que a deleção desse gene inibiu a formação de vacúolos autofágicos, prejudicando o crescimento vegetativo e a conidiação do fungo. Além disso, observaram que a maioria dos conídios formados na ausência de BcATG1 era incapaz de formar a estruturas de infecção, não penetrando a epiderme de cebolas.
Para a expansão do fagóforo são requeridas duas proteínas do tipo ubiquitina, Atg8 e Atg12, envolvidas em dois sistemas separados de conjugação.
Ambas são ativadas por Atg7 (uma enzima ubiquitina de tipo ativadora - E1 homólogo) (YANG; KLIONSKY, 2009).
A proteína Atg8 ativada por Atg7 é conjugado por Atg3 (uma segunda enzima de conjugação de ubiquitina E2 Análogo) à fosfatidiletanolamina (PE), um dos principais fosfolipídios da membrana celular, por meio de uma ligação amida. A Atg8-PE pode ser encontrada no fagóforo e nos autofagossomos, pois atua no alongamento da vesícula como componente estrutural (INOUE; KLIONSKY, 2010).
A proteína Atg12 se liga a Atg5 por meio da ação de conjugação da Atg10 (uma enzima ubiquitina de conjugação - E2 análogo) e juntas se ligam a Atg16, formando o complexo Atg12-Atg5-Atg16, que funciona como revestimento do autofagossomo e também age como uma enzima tipo E3 (segunda proteína ubiquitina tipo ligase) para a formação de Atg8-PE, que atua no alongamento da vesícula como componente estrutural (WEN; KLIONKY, 2016).
Logo após a formação do autofagossomo, a maioria das proteínas envolvidas na formação de sua membrana se desliga da superfície da vesícula e pode ser reutilizada. O Atg8-PE presente na superfície exterior da vesícula é clivado pela protease Atg4, desconjugando Atg8 da PE; assim, o Atg8 na superfície do autofagosomo é liberado e pode ser reutilizado, enquanto o Atg8-PE que permanece ligado à superfície interna do autofagossomo é entregue ao vacúolo e degradado (YANG; KLIONSKY, 2009; INOUE; KLIONSKY, 2010; WEN; KLIONKY, 2016).
As proteínas responsáveis pela fusão dos autofagossomos com o vacúolo são as SNARE (Vam3, Vam7, Vti1 e Ykt6) e estão envolvidas em vários eventos de fusão de membranas (YANG; KLIONSKY, 2009).
Além da Tor, as leveduras têm outras duas vias complexas capazes de detectar e responder a alterações nos níveis de nutrientes: a via PKA (protein kinase A) (DECHANT et al., 2014) e a via Sch9 (proteína cinase da família AGC, ortólogo funcional da cinase S6 em mamífero) (CHEN; KLIONSKY, 2011). Essas vias ativadas inibem a macroautofagia (SAMPAIO-MARQUES et al., 2011).
Níveis elevados de glicose nas células promovem produção de cAMP (Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate), que se liga e inativa a proteína Bcy1 (Bypass of CY
A via Sch9, que atua paralelamente a PKA, é um segundo sensor de glicose.
A atividade da quinase Sch9 é, parcialmente, dependente da fosforilação por Tor (MORUNO; PÉREZ-JIMÉNEZ; KNECHT, 2012). A fosforilação de Sch9 por TorC1 é sensível a alterações na disponibilidade de nutrientes (JORGENSEN et al., 2004). A fosforilação deste resíduo é perdida durante a privação de carbono (URBAN, 2007).
clic-AMP requirement), subunidade reguladora da PKA (REGGIORI;
KLIONSKY, 2013). PKA controla uma variedade de processos celulares, incluindo metabolismo (BERMEJO et al., 2013), ciclo celular (DECHANT et al., 2014), resposta ao estresse (SAMPAIO-MARQUES et al., 2011), fase estacionária (SANTOS; SOUSA; LEÃO, 2012) e esporulação (KROHN et al., 2014). A PKA fosforila diretamente a proteína Atg13, impedindo a sua associação com Atg1 e Atg17, reprimindo assim a autofagia (KIM et al., 2011).
Semelhante à PKA, Sch9 quando fosforilada inibe a macroautofagia (SAMPAIO-MARQUES et al., 2011). Sch9 é rapidamente desfosforilada em células privadas de carbono (BROACH, 2012), nitrogênio (SANTOS; SOUSA; LEÃO, 2012), fosfato ou aminoácido (LOEWITH; HALL, 2011; URBAN et al., 2007), bem como durante o tratamento com rapamicina (CHEN; KLIONSKY, 2011).
Um ortólogo de Sch9, FgSCH9, em Fusarium graminearum desempenha um papel importante na regulação da biossíntese de micotoxinas e na virulência do fungo. Além disso, FgSCH9 atua como mediador da via Tor e promove a regulação da diferenciação vegetativa, do metabolismo secundário e das respostas a diferentes estresses em F. graminearum. A deleção de FgSCH9 resultou em defeito no crescimento de hifas aéreas, na ramificação de hifas e na germinação de conídios. O fungo apresentou sensibilidade aumentada a estresses, osmótico e
oxidativo, aos agentes danificadores das paredes celulares e à rapamicina. Por outro lado, F. graminearum apresentou maior tolerância térmica (GU et al., 2015).
2.3 Moduladores da autofagia
A autofagia pode ser induzida por alguns fármacos como a rapamicina (ALVERS et al., 2009), cujo alvo é a proteína cinase Tor. Sua ação sobre Tor promove a inibição da atividade da proteína pela formação de um complexo ternário entre Tor, rapamicina e a peptidil-prolil isomerase FKBP12 (IESMANTAVICIUS;
WEINERT; CHOUDHARY, 2014).
Em Saccharomyces cerevisiae, a inibição de Tor pela rapamicina promoveu a parada irreversível do ciclo celular, em 60 a 70% das leveduras, na fase G1.
Nessas condições, as leveduras apresentaram morfologia peculiar, grandes e sem brotos, e baixa viabilidade (HEITMAN; MOVVA; HALL, 1991).
Takahara e Maeda (2012) mostraram que, embora a rapamicina seja capaz de inibir fortemente o crescimento celular e brotamento das leveduras em Saccharomyces cerevisiae, por meio da inibição de TorC1. Em Saccharomyces pombe a inibição desse complexo pelo fármaco não foi suficiente para causar danos em seu crescimento.
Em 2012, um novo composto, MHY1485, foi sintetizado com a finalidade de inibir Tor, porém, promoveu o efeito oposto e hoje, é utilizado como um ativador dessa proteína (CHOI et al., 2012). Em hepatócitos de ratos, MHY1485 induziu a ativação de Tor, além de impedir a fusão entre autofagossomos e lisossomos (CHOI et al., 2012). Em plantas e fungos, não existe na literatura trabalhos que utilizem esse composto.
Frente a todos as condições capazes de induzir a autofagia, estudos sobre esse mecanismo de adaptação e morte programada em Paracoccidioides spp. são de interesse. Não há, nesse fungo, qualquer estudo relevante sobre esse mecanismo, cujo conhecimento pode elencar novas moléculas candidatas a fatores de virulência e patogenicidade e, desse modo, contribuir para novas estratégias de combate dessa doença de tratamento longo, capaz de provocar sequelas graves e debilitantes.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Este trabalho propôs o estudo da autogafia na adaptação e sobrevivência de leveduras do isolado Pb18 de Paracoccidioides brasiliensis, cultivadas na ausência ou em diferentes concentrações de glicose ou na presença dos moduladores da autofagia, rapamicina e MHY1485.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar a proliferação de leveduras do Pb18 cultivadas na ausência ou em diferentes concentrações de glicose ou na presença de rapamicina ou MHY1485, por meio do peso seco da massa celular.
Avaliar a viabilidade das leveduras cultivadas na ausência ou em diferentes concentrações de glicose ou na presença de rapamicina ou MHY1485, por meio de plaqueamento das células diluídas de forma seriada, em meio sólido YPD;
Avaliar as alterações morfológicas das leveduras cultivadas na ausência ou em diferentes concentrações de glicose ou na presença de rapamicina ou MHY1485, por microscopia óptica, observando se houve aumento ou diminuição do diâmetro, bem como, no número de brotos e na presença de pseudo-hifas;
Analisar o surgimento de vacúolos autofágicos em leveduras cultivadas na ausência ou em diferentes concentrações de glicose ou na presença de rapamicina ou MHY1485, por marcação fluorescente com Acridina Orange (AO) e por Monodansilcadaverina (MDC);
Analisar o surgimento de autofagossomos em leveduras cultivadas na ausência ou presença de rapamicina, por imunofluorescência utilizando anticorpo anti-Atg8, conjugado ao fluoróforo FITC.
4 MATERIAL E MÉTODOS
Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular e Molecular de Fungos do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba.
Foi utilizado o isolado 18 de P. brasiliensis (Pb18) na fase leveduriforme, procedente da micoteca da UNIFESP-SP, sob responsabilidade do Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo. Ressalta-se que, por se tratar de um isolado de coleção, não houve necessidade de aprovação por Comitês de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP).
4.1 Microrganismos e condições de cultivo de Paracoccidioides brasiliensis.
Ao longo deste estudo foi utilizado o isolado 18 de P. brasiliensis (Pb18) em sua fase leveduriforme. As células foram crescidas a 36ºC, por três dias, e mantidas a 4ºC em meio sólido YPD (Yeast Peptone Dextrose, contendo 0,5% de extrato de levedura, 1% de peptona, 0,5% de dextrose e 1,8% de ágar bacteriológico, esterilizado por autoclavação). Para os ensaios, as células foram transferidas para meio líquido SD (Meio Sintético Definido, contendo 0,17% de Yeast Nitrogen Base, 2% de glicose, 0,5% de casaminoácidos, 0,5% de sulfato de amônio, em água destilada, esterilizado por filtração), por cinco dias sob agitação (150 rpm), a 36ºC.
Depois de lavadas por três vezes com YNB (Yeast Nitrogen Base; 0,17% de YNB em água destilada) e ressuspendidas em 10mL da mesma solução, a concentração celular foi ajustada para 1x107 leveduras viáveis/mL utilizando 0,5mg/mL de azul de metileno, em câmara de Neubauer. Em seguida, as leveduras (1x106 leveduras/mL) foram inoculadas em meios de cultura contendo diferentes concentrações de glicose: SD-G (sem glicose), SD0,2% (0,2% de glicose), SD (2% de glicose), SD4%
(4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 μg/mL de rapamicina) e SD+M (SD contendo 4 μM MHY1485), e incubadas a 36°C, sob agitação constante durante seis dias. Como controle foram utilizadas as leveduras cultivadas em SD (2% de glicose).
Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
4.2 Avaliação da massa celular das culturas de P. brasiliensis
A massa celular das culturas do Pb18, SD-G, SD0,2%, SD, SD4%, SD+R e SD+M, foi estimada pelo peso seco total das células contidas em 1,5 mL de cada cultura, após três e sete dias de crescimento a 36ºC. As alíquotas de cada cultura foram recolhidas em triplicata, lavadas em etanol a 100%, centrifugadas, para drenagem do sobrenadante, e secas, em estufa microbiológica, a 60ºC, por aproximadamente 30 minutos. O peso do sedimento seco foi calculado pela subtração do peso do microtubo vazio pelo peso do microtubo contendo a massa celular. Os resultados foram plotados em gráfico.
4.3 Análise da viabilidade celular
Durante seis dias consecutivos, as culturas do Pb18, SD-G, SD0,2%, SD, SD4%, SD+R e SD+M, foram submetidas a diluições em série (1/2; 1/4 e 1/8). Dez microlitros de cada diluição, bem como da cultura não diluída, foram inoculados em placas de Petri contendo meio sólido YPD (Yeast Peptone Dextrose, com 0,5% de extrato de levedura, 1% de peptona e 0,5% de glicose e 1,8% de ágar bacteriológico). Após três dias de incubação a 36ºC, as placas contendo o crescimento das leveduras foram documentadas fotograficamente utilizando uma câmara digital.
4.4 Morfometria e morfologia de P. brasiliensis
Alíquotas das culturas do Pb18, SD-G, SD0,2%, SD, SD4%, SD+R e SD+M, foram coletadas após um, três e seis dias de incubação. As leveduras foram lavadas em PBS (Phosphate Buffered Saline = Tampão Fosfato Salino - 0,01M, pH 7,2 contendo 140mM de NaCl; 2,7mM de KCl; 10mM de Na2HPO4 e1,8mM de KH2PO4), fixadas em paraformaldeído (4% em Tampão Fosfato 0,1M, pH 7,2) e fotodocumentadas usando um microscópio Leica DMLB, acoplado a uma câmera Leica DFC 310 fx, no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).
Para determinar a influência das diferentes concentrações de glicose ou tratamentos farmacológicos sobre a morfologia das leveduras do fungo, os diâmetros de pelo menos 100 leveduras foram mensurados (µm) e a proporção entre as leveduras e pseudo-hifas das culturas foi avaliada. As mensurações e contagens foram feitas usando o software Leica Application Suite V4.6.1. Os valores obtidos foram traçados num gráfico.
4.5 Coloração de vesículas ácidas por Acridina Orange
A Acridina Orange (AO) é um marcador fluorescente utilizado para identificar vesículas ácidas (PIERZYŃSKA-MACH; JANOWSKI; DOBRUCKI, 2014). As leveduras das culturas do Pb18, SD-G, SD0,2%, SD, SD4%, SD+R e SD+M, foram coletadas após um, três e seis dias de incubação, e lavadas com PBS (pH 7,2), para remoção do meio de cultura e incubadas com 10mM de AO (Sigma-Aldrich), a 37°C, durante 10 minutos no escuro. Após duas lavagens com PBS, as células foram visualizadas em um microscópio de fluorescência, comprimento de onda de excitação 488nm (Leica DMLB, acoplado a uma câmara Leica DFC 310 fx e ao software Leica Application Suite V3). AO produz fluorescência vermelha (filtro de emissão de 620 nm) nos compartimentos lisossômicos e fluorescência verde (emissão entre 520 e 560 nm) nos compartimentos citosólico e nuclear (LAO et al., 2014).
4.6 Coloração de vacúolos autofágicos por Monodansilcadaverina
Monodansilcadaverina (MDC) é um marcador fluorescente utilizado para coloração de vacúolos autofágicos (Seglen e Gordon 1982). As leveduras das culturas do Pb18, SD-G, SD0,2%, SD, SD4%, SD+R e SD+M, foram coletadas após um, três e seis dias de incubação, e lavadas com PBS (pH 7,2), para remoção do meio de cultura e incubadas com 50μM de MDC (Santa Cruz Biotechnology, diluído em metanol), a 37°C, durante 15 minutos no escuro. Depois de uma lavagem com PBS, as células foram analisadas imediatamente por microscopia de fluorescência, 335 nm excitação e 525 nm emissão (Leica DMLB, acoplado a câmera Leica DFC 310 fx). A fotodocumentação foi feita pelo software Leica Application Suite V3, no
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).
4.7 Ensaio de imunofluorescência
As leveduras do Pb18 cultivadas em meio SD ou SD+R, por um dia a 36ºC, foram recolhidas e fixadas em paraformaldeído 4% em Tampão Fosfato 0,1M, pH 7,2, durante 24 horas. Após três lavagens em PBS, a permeabilização celular foi feita com 0,2% de Tween20 em PBS, durante 10 minutos, seguida por lavagem com PBS contendo 0,2% de Tween 20 e 0,1% de BSA (Bovine Serum Albumin), por duas vezes. O anticorpo policlonal anti-Atg8, conjugado a FITC (Rhea Biotechnology), foi diluído (1:100) em PBS contendo 0,1% de BSA e incubado com as células permeabilizadas, por 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e imediatamente visualizadas em um microscópio de fluorescência (Leica DMLB acoplado com uma câmara Leica DFC 310 fx). As imagens foram analisadas com o software Leica Application Suite V3, no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual do Prof. Dr. Newton Soares da Silva, IP&D, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da UNIVAP – Universidade do Vale do Paraíba.
4.8 Analise estatística
Os dados foram apresentados por uma média de pelo menos três repetições semelhantes. A análise estatística e as comparações foram realizadas utilizando o teste ANOVA. E os resultados com p <0,05 ou p <0,01 foram considerados estatisticamente significativos.
5 RESULTADOS
5.1 Massa celular e viabilidade de leveduras de Pb18
Após três e seis dias de cultivo, a viabilidade das leveduras de Pb18 cultivadas em SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M foi comparada com a das leveduras da cultura controle (SD).
As leveduras das culturas SD-G e SD0,2% (Figura 1B) tornaram-se inviáveis, após seis dias de cultivo e isso refletiu no peso seco obtido para essas células que reduziu, significativamente, se comparadas com as crescidas em meio SD (Figura 1A). Esses resultados indicaram que o cultivo em menores concentrações de glicose promoveu parada na proliferação das leveduras de P.
brasiliensis (p < 0,05), bem como a morte dessas células.
Contudo, em altas concentrações de glicose (SD4%), ao longo dos seis dias de cultivo, não houve diferença significativa na quantidade de massa (Figura 1A) ou na viabilidade celular (Figura 1B) dessas leveduras quando comparadas com as crescidas em meio SD (2% glicose).
A adição de 0,2 µg/mL de rapamicina, fármaco inibidor de Tor e, consequentemente, estimulador da autofagia, ao meio de cultivo das leveduras (SD+R) não influenciou a viabilidade dessas células (Figura 1B), mas promoveu o aumento significativo da massa celular dessa cultura (Figura 1A, SD+R, p < 0,05), em comparação à cultura controle (SD), após três dias de cultivo. Porém, após o sexto dia de cultivo em SD+R, as leveduras apresentaram viabilidade menor (Figura 1B), com significativa redução em sua massa celular (Figura 1A, SD+R, p < 0,05).
Esses resultados sugerem uma possível toxicidade do fármaco sobre leveduras cultivadas por tempo prolongado em sua presença ou que o fármaco, por promover crescimento acelerado, nos primeiros dias de cultivo, tenha promovido a escassez nutricional precoce do meio, promovendo a queda da massa e da viabilidade celular observadas.
Leveduras de Pb18 cultivadas em meio SD contendo 4µM de MHY1485 (SD+M), estimulador da atividade de Tor e inibidor de autofagia, apresentaram aumento significativo da massa celular (Figura 1A, SD+M, p < 0,01), bem como permaneceram viáveis, ao longo dos seis dias de cultivo (Figura 1B, SD+M). Existem poucos trabalhos na literatura utilizando esse composto, e nenhum deles utiliza
células fúngicas, o que dificulta a compreensão da ação deste composto sobre as leveduras de P. brasiliensis. Porém, esses resultados sugerem que MHY1485 tenha efeito sobre a longevidade do fungo, pois mantém o crescimento deste pelos seis dias de cultivo, semelhante ao observado nos primeiros três dias de cultivo com rapamicina. Contudo, na cultura SD+R o crescimento não se mantém entre o terceiro e o sexto dias, mostrando-se diminuindo após seis dias de cultivo.
Figura 1 – Peso seco total e viabilidade celular de leveduras do Pb18.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD (SD 2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após três e seis dias de cultivo (36°C), centrifugadas e secas em estufa (A) ou diluídas e plaqueadas (B). Em (A), gráfico do peso seco total das leveduras do Pb18 nos diferentes meios de cultura. Em (B), imagem de leveduras de Pb18 plaqueadas, após diluição seriada (1, 1/2, 1/4 e 1/8), e incubadas por três dias em meio YPD sólido. Resultado estatisticamente significativo em comparação com o controle (SD), com p < 0,05 * ou p < 0,01 **.
5.2 Morfologia e morfometria de leveduras de Pb18
Após um, três e seis dias de cultivo, a morfologia das leveduras de Pb18 cultivadas em SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M foi comparada com a das leveduras da cultura controle (SD).
A cultura de leveduras do Pb18 na ausência de glicose (SD-G) apresentaram quantitativamente, 13,9%, 25% e 58,5% a mais de pseudo-hifas, que a cultura controle (SD), após um, três e seis dias de cultivo, respectivamente (Tabela 1; Figura 2A-C e Figura 3). Além disso, as leveduras cultivadas na ausência de glicose (SD-G) apresentaram variações significativas em seus diâmetros, em relação ao diâmetro observado para as leveduras cultivadas em SD. Após três dias, os diâmetros das leveduras da cultura SD-G foram significativamente menores (p <
0,01) (Figura 2E), aos das leveduras da cultura SD. Porém, após seis dias de cultivo em SD-G, essa condição se alterou e os diâmetros das leveduras SD-G apresentaram-se significativamente maiores (p < 0,01) quando comparados aos observados para as leveduras da cultura SD (Figura 2E e F).
Nas primeiras 24 horas de cultivo, leveduras de Pb18, cultivadas em meio reduzido (SD0,2%) e em privação total de glicose (SD-G) apresentaram quantidades semelhantes de pseudo-hifas, 21,8% e 22,5% respectivamente (Figura 2A), sendo ambos, aproximadamente 13% a mais em relação as encontradas no mesmo período em meio controle (SD) (Tabela 1). Porém, ao terceiro e sexto dia de cultivo, em SD0,2%, houve variação na quantidade desse tipo celular em comparação a cultura SD (Figura 2B e C e Figura 3). As pseudo-hifas foram 13% menos abundantes ao terceiro dia e 5,6% mais abundantes ao sexto dia de cultivo em SD0,2%, em comparação com o cultivo em SD (Tabela 1). O diâmetro das leveduras cultivadas em SD0,2% e SD foi similar, no primeiro e sexto dias de cultivo, porém ao terceiro dia em SD0,2%, as leveduras apresentaram diâmetros significativamente menores (p < 0,05) quando comparadas com as cultivadas em SD (Tabela 2; Figura 2E).
Leveduras do Pb18, cultivadas em altas concentrações de glicose (SD4%), apresentaram 24,1%, 27,5% e 35,8% a mais de pseudo-hifas, nos dias um, três e seis de cultivo, respectivamente, em relação à cultura SD (Tabela 1; Figura 2A, B e C e Figura 3). As leveduras dessa cultura (SD4%) apresentaram diâmetros significativamente menores (p < 0,01), em relação à cultura SD, ao terceiro dia de
cultivo (Tabela 2; Figura 2E), porém não houve variação significativa desses diâmetros após 24h e em seis dias de cultivo.
A formação de pseudo-hifas e os diâmetros de leveduras do Pb18, também, foram avaliados na presença dos moduladores da autofagia, rapamicina e MHY1485. A cultura de leveduras do Pb18, incubada na presença de 0,2 µg/ml de rapamicina (SD+R), apresentou 6,5% e 6,1% mais pseudo-hifas que a cultura na ausência do fármaco (SD), no primeiro e sexto dia de cultivo, respectivamente (Tabela 1; Figura 2A e C). Porém, esse tipo celular foi 17,1%, menos abundante ao terceiro dia quando comparado com a quantidade encontrada em SD (Tabela 1;
Figura 2B). Na cultura SD+R, as leveduras apresentaram aumento significativo na média de seus diâmetros (p < 0,01), nos dias um, três e seis de cultivo (Tabela 2;
Figura 2D, E e F e Figura 3), bem como no número de brotos, após, três e seis dias de cultivo, em relação as cultivadas em SD (Figura 3).
Na presença de 4µM de MHY1485(SD+M), a cultura de leveduras do Pb18 apresentou aumento de 6,3% para 20,8% de pseudo-hifas, do primeiro ao sexto dia de cultivo, em relação à cultura SD (Tabela 1; Figura 2A e C e Figura 3). Porém, no terceiro dia de cultivo, as pseudo-hifas foram 5,2% menos abundantes que as cultivadas em SD (Tabela 1; Figura 2B). Nessa mesma condição (SD+M), houve um aumento significativo (p < 0,01), de 0,4 e 0,5 µm, no diâmetro das leveduras, em relação ao controle (SD), no primeiro e sexto dia de cultivo, respectivamente (Tabela 2; Figura 2D e F), porém no terceiro dia, apesar dos diâmetros serem maiores, não houve diferença significativa.
Tabela 1 – Diferença percentual da quantidade de pseudo-hifas do Pb18 nas culturas SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M, em relação ao controle (SD), após um, três e seis dias de cultivo.
Diferença (%) pseudo- hifas
SD-G SD0,2% SD4% SD+R SD+M
1 dia 13,9 13,2 24,1 6,5 6,3
3 dias 25 -13* 27,5 -17,1* -5,2*
6 dias 58,5 5,6 35,8 6,1 20,8
Nota:* Em vermelho, quantidades a menos em relação ao controle (SD); o restante é quantidade a mais em relação ao controle.
Fonte: autor;
Figura 2 – Diferenciação morfológica e mensuração do diâmetro das leveduras do Pb18.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em SD (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após um, três e seis dias de cultivo (36°C). Em (A), (B) e (C), média em porcentagem da quantidade de pseudo-hifas e em (D), (E) e (F), média em µm do diâmetro das leveduras nas culturas SD, SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R ou SD+M. Resultado estatisticamente significativo em comparação com o controle (SD), com p < 0,05 * ou p < 0,01 **.
Tabela 2 – Média do diâmetro (µm) das leveduras do Pb18 nas culturas SD, SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M, após um, três e seis dias de cultivo.
1 dia SD SD-G SD0,2% SD4% SD+R SD+M
Diâmetro µm (Média)
2,4 2,5 2,5 2,6 3 2,8
Valor de p 0,05 0,389 0,09 0,08 1E-09** 8E- 06**
3 dias SD SD-G SD0,2% SD4% SD+R SD+M
Diâmetro µm (Média) 2,7 2,3 2,4 2,3 3 2,8
Valor de p 0,05 0,0006** 0,02* 0,006** 8E-05** 0,03*
6 dias SD SD-G SD0,2% SD4% SD+R SD+M
Diâmetro µm (Média) 2,3 2,8 2,2 2,1 3,1 2,8
Valor de p 0,05 7E-06** 0,3 0,09 3E-18** 9E-07**
Nota: * p < 0,05; ** p < 0,01.
Fonte: autor;
Figura 3 – Morfologia das células do Pb18.
Nota: Fotomicrografia de campo claro das leveduras do Pb18 cultivadas em SD (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após um, três e seis dias de cultivo (36°C). Barra de escala = 10µm.
5.3 Análise da presença de vacúolos autofágicos
O processo de autofagia se inicia com o recrutamento de proteínas específicas para a formação do autofagossomo e progride para a formação dos vacúolos autofágicos, por meio da fusão do autofagossomo com os lisossomos ou vacúolos em plantas e fungos (MORUNO et al., 2012). Para verificar a indução da autofagia nas leveduras cultivadas em diferentes concentrações de glicose e na presença dos moduladores da autofagia, rapamicina e MHY1485, essas células foram submetidas a marcação de suas organelas com acridina orange (AO), um marcador fluorescente seletivo para organelas vesiculares ácidas das células vivas (SHIN; KIM; PARK, 2012) e pela incorporação de monodansilcadaverina (MDC), um agente autofluorescente que se acumula em vacúolos autofágicos, exibindo estruturas pontuais (punctas) distribuídas dentro do citoplasma (KLIONSKY et al., 2008).
As leveduras de Pb18, após 24 horas de cultivo, nas diferentes condições, SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M, bem como em meio SD, incubadas com AO ou MDC (Figura 4 e 5, respectivamente), apresentaram marcações pontuais, indicando presença de vesículas ácidas, vacúolos e/ou vacúolos autofágicos.
Após três dias de cultivo (36°C), as leveduras cultivadas em SD-G, SD0,2%
e SD+R, mantiveram marcações pontuais por AO e MDC (Figuras 6 e 7, respectivamente). Na cultura SD4% tanto na marcação por AO quanto por MDC, se tornou difusa, indicando ausência de vacúolos autofágicos, corroborando com os resultados obtidos por Proikas-Cezanne e colaboradores (2007) ao estudarem uma correlação entre marcações difusas com a ausência do processo autofágico. No cultivo (36°C), por três dias, em meio SD contendo 4µM de MHY1485 (SD+M), as leveduras do Pb18 apresentaram menor quantidade de marcações pontuais (punctas) por MDC e por AO em relação ao primeiro dia de cultivo. Contudo, as células cultivadas no meio comum (SD) não apresentaram nenhuma marcação no terceiro dia de cultivo.
Após o sexto dia de incubação nos diferentes meios de cultura (SD, SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M), os únicos que continham leveduras apresentando marcações pontuais por AO foram SD-G, SD0,2% e SD+R, conforme ilustrado na Figura 8. Na cultura contendo MHY1485 (SD+M), inibidor de TOR, as células apresentaram marcação difusa por AO (Figura 8). No cultivo em SD e em SD4% as
leveduras não se mostraram marcada por AO (Figura 8). As marcações por MDC, mostrada na Figura 9, ficaram difusas em meio SD (controle), nos tratamentos de privação (SD-G) e altas concentrações (SD4%) de glicose, e em meio contendo com as substâncias moduladoras, rapamicina (SD+R) e MHY1485 (SD+M). No cultivo em meio SD0,2% não houve nenhuma marcação.
Figura 4 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após um dia de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em SD (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após um dia de incubação e coradas com 10 mM de AO, por 10 minutos no escuro. Citoplasma e núcleo marcados em verde; e em vermelho, vesículas ácidas. Setas brancas indicam pontos com marcação de vesículas ácidas. Barra de escala = 10 μm.
Figura 5 – Vacúolos autofágicos corados por monodansilcadaverina (MDC), após um dia de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em SD (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após um dia de incubação e coradas com 50 μM de MDC por 20 minutos. Vacúolos autofágicos estão corados em verde. Setas brancas indicam pontos com marcação de vacúolos autofágicos; e setas amarelas, marcação difusa. Barra de escala = 10 μm.
Figura 6 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após três dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras de Pb18 em (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2%
(SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), após três dias de incubação;
coradas com 10 mM de AO, por 10 minutos no escuro. Citoplasma e núcleo marcados em verde; e em vermelho, vesículas ácidas. Setas brancas indicam pontos com marcação de vesículas ácidas; e setas amarelas, marcação difusa. Barra de escala = 10 μm.
