sinensis frente ao patógeno
5.6. Análise da variação do perfil químico através da técnica LC-
MS
EA análise de um perfil químico de uma dada espécie constitui-se em um método qualitativo, onde se pode ou não validar o método utilizando as propriedades de reprodutibilidade e precisão. A escolha de um bom método de extração das amostras a serem analisadas também é de suma importância, logo nesse caso, pensando em todas as variações das amostras possíveis foram feitas pré análises por micro extrações para selecionar o melhor método de extração, já que estávamos trabalhando com uma amostragem não alvo (untarget). A escolha do método de extração levou em consideração a eficiência e o tempo total necessário para o preparo das amostras. O processo de divisão dos órgãos vegetais estudados das plântulas de TST (porta enxerto) e CTSW (porta enxerto) foi separado em raiz, caule inferior, caule superior e folhas para cada espécie de Citrus sinensis em estudo, os quais foram
a b c
c
99 rotulados e discriminados como segue abaixo:
Tangerineira Sunki Tropical – Porta Enxerto Controle_ sadio TSTRATE – raízes do porta enxerto
TSTCATEINF – Caule inferior do porta enxerto
TSTCATESUP- Caule superior da enxertia laranja Valência TSTFOTE – folhas da enxertia laranja Valência
Citrumeleiro Swingle – Porta Enxerto Controle_ sadio CTSWRATE – raízes do porta enxerto
CTSWCATEINF- Caule inferior do porta enxerto
CTSWCATESUP- Caule superior da enxertia laranja Valência CTSWFOTE- folhas da enxertia laranja Valência
Tangerineira Sunki Tropical - Porta Enxerto inoculado com o patógeno_ doente
TSTRA – raízes do porta enxerto
TSTCAINF – Caule inferior do porta enxerto
TSTCASUP- Caule superior da enxertia laranja Valência TSTFO – folhas da enxertia laranja Valência
Citrumeleiro Swingle – Porta Enxerto inoculado com o patógeno_ doente CTSWRA – raízes do porta enxerto
CTSWCAINF- Caule inferior do porta enxerto
CTSWCASUP- Caule superior da enxertia laranja Valência CTSWFO- folhas da enxertia laranja Valência
Os códigos citados acima serão utilizados deste ponto em diante nos resultados e discussões posteriores. As análises foram efetuadas em um Cromatógrafo Líquido de Ultra Eficiência (CLUE) acoplado a um espectrômetro de massas equipado com um analisador híbrido Triplo Quadrupolo – Tempo de Vôo (Q- TOF). A coluna utilizada para este estudo foi a Acquity UPLC BEH C-18 Waters® (2.1
100 reverso de eluição gradiente.
Por se tratar de um estudo metabonômico “não direcionado”, decidiu-se trabalhar tanto no modo positivo quanto no modo negativo de ionização, na tentativa de ionizar o maior número possível de compostos. Os parâmetros usados de energias e fluxos de gás, entre outros utilizados seguem como descrito na TABELA 5.3.
TABELA 5. 3 - Parâmetros estabelecidos para as análises em UPLC-QTof.
Modo de Ionização ESI Positivo e Negativo
Temperatura da Fonte 120°C
Voltagem do Capilar +3,0eV /-3,0eV
Cone de Amostragem 40 eV
Temperatura de Dessolvatação 450°C
Fluxo do gás (N2) de
Dessolvatação 700,0L/h
Fluxo do gás (N2) do Cone 10,0L/h
Energia de Colisão Rampa 25-35 eV
Aquisição de Dados MSE
Faixa de Massa Adquirida 130 - 1000 m/z
Lock mass (LeuEnk)
Positivo, m/z 556.2771 e 278.1141
Negativo, m/z 554.2615 e 236.1035
Nesse trabalho foram feitas extrações em triplicatas de cada parte vegetal e comparou-se a repetibilidade e a precisão através das sobreposições dos perfis cromatográficos e o seu tempo de retenção de cada parte vegetal. Pode-se concluir que a técnica utilizada para a extração foi bastante reprodutível. A validação da extração foi efetuada ao quantificar metabólitos que será discutida posteriormente. O rendimento dos extratos foi calculado em relação a massa do material seco utilizado para a extração (50 mg), conforme indicado na TABELA 5.4.
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TABELA 5. 4 - Valores de rendimento das extrações de TST e CTSW (n=3) das amostras de diferentes partes das plântulas.
Amostra Extrato (mg) Rendimento (%) CV(%) TSTFO 5,8 11,6 ± 0,8 6,9 TSTFOTE 5,8 11,6 ± 0,8 6,9 TSTRA 4,5 9,0 ± 0,9 9,9 TSTRATE 4,8 9,6 ± 1,0 10,6 TSTCASUPE 3,5 7,0 ± 0,8 12,7 TSTCATESUP 3,6 7,2 ± 0,9 13,0 TSTCAINF 5,1 10,2 ± 0,4 3,9 TSTCATEINF 5,0 10,1 ± 0,3 3,8 CTSWFOTE 4,8 9,6 ± 0,8 8,3 CTSWFO 3,7 7,4 ± 0,8 10,8 CTSWCATEINF 3,7 7,4 ±0,6 10,8 CTSWCAINF 3,5 7,0 ± 0,8 12,7 CTSWRATE 3,9 7,8 ± 0,7 9,6 CTSWRA 2,8 5,6 ± 0,5 8,7 CTSWCATESUP 2,6 5,2 ± 0,7 14,3 CTSWCASUP 2,2 4,4 ± 0,5 11,1 *CV = Coeficiente de variação
No estudo metabolômico das partes de cada plântula estudado, todos os resultados foram obtidos das amostragens de plântulas da mesma idade e nas mesmas condições, assim descartando resultados equivocados de variação de perfil químico, devido alguns fatores que podem influenciar na diferenciação dos mesmos, como: sazonalidade, temperatura, disponibilidade hídrica e estresses hídricos. O estudo avaliou, ao analisar plantas enxertadas sadias e doentes, prováveis mecanismos bioquímicos envolvendo o metabolismo secundário, como uma resposta de defesa ao estímulo fisiopatológico causados pela Gomose de citros. Os agentes fitopatogênicos atacam plantas justamente porque durante o seu desenvolvimento evolutivo conseguiram assimilar as substâncias produzidas pelo hospedeiro, mas para que ocorra tal efeito, o patógeno precisa vencer diversas barreiras opositoras impostas pelo hospedeiro que são seus mecanismos de defesa pré e pós formados.
Nas FIGURAS 5.23 a 5.26 mostram os cromatogramas sobrepostos comparativo de íons totais obtidos de todas as partes vegetais estudadas das
102
plântulas de TST e CTSW no modo positivo quanto no modo de ionização negativo, onde se obteve uma análise bem explorada de cada composto detectado, com espectro do íon molecular precursor de massa exata, através da baixa energia de ionização, e espectro dos íons fragmentos, também com massa exata, através de energias mais elevadas. Foi possível, observar uma quantidade considerável de variações e uma quantidade de analitos foi encontrada, porém analisando cada banda cromatográfica e seus respectivos íons de massa, detectou-se que no modo positivo para alguns órgãos da planta, como por exemplo o caule superior e as folhas, houve contaminação, onde foi possível verificar clusters com perdas simultâneas de 44 Da, que é bastante característico de amostras com o polímero polietileno glicol (- CH2CH2O-) n (PEG). Essa contaminação pode ter ocorrido pela própria água, ou por polímeros extraídos de plásticos, no momento da extração no procedimento experimental. Através dos cromatogramas de íons totais foi possível também obter a ionização de diversos compostos e como a análise por LC-MSE são na maioria das
vezes bastante semelhantes e ricas em informação, é difícil identificar diferenças entre as amostras baseando-se em uma simples análise visual. Dessa maneira, fez-se uso de quimiometria para melhor interpretação desses dados.
103 A
B
C
D
FIGURA 5. 23 - Cromatogramas de íons totais de todos os órgãos da planta estudada de TST (ESI, positivo), infectadas com gomose (verde) e sadias (vermelho). A: Raízes; B: Caule inferior; C: Caule superior; D: folhas.
104 A
B
C
D
FIGURA 5. 24 - Cromatogramas de íons totais de todos os órgãos da planta estudada de CTSW (ESI, positivo), infectadas com gomose (verde) e sadias (vermelho). A: Raízes; B: Caule inferior; C: Caule superior; D: folhas.
105 A
B
C
D
FIGURA 5. 25 - Cromatogramas de íons totais de todos os órgãos da planta estudada de TST (ESI, negativo), infectadas com gomose (verde) e sadias (vermelho). A: Raízes; B: Caule inferior; C: Caule superior; D: folhas.
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A
B
C
D
FIGURA 5. 26 - Cromatogramas de íons totais de todos os órgãos da planta estudada de CTSW (ESI, negativo), infectadas com gomose (verde) e sadias (vermelho). A: Raízes; B: Caule inferior; C: Caule superior; D: folhas.
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Na comparação visual dos cromatogramas entre os porta enxertos no modo positivo de ionização (FIGURA 5.23 e 5.24) foi possível observar diferenças entre essas plântulas, tanto em termo de intensidade de picos, como em presença e/ou ausência de bandas cromatográficas, isso sugere que ao comparar uma espécie que é mais susceptível que a outra, que possui uma resistência ao patógeno estudado, ocorre mudanças na variação de seu perfil químico, principalmente quando comparamos plântulas sadias versus doente. Para as análises das partes inferiores dos porta enxertos, o modo de aquisição positivo foi bem melhor, como já era previsto, devido à presença na variação de compostos da classe das cumarinas, estas, se ionizam muito bem nesse modo, devido as suas características químicas (GARCIA, 2005), De vários flavonoides presentes no gênero Citrus, as flavanonas glicosídicas são acumuladas em maior quantidade em partes áreas, embora a concentração destes compostos seja dependente da idade da planta, em busca dessa variações e dessa classe de substâncias as demais amostras obtivemos melhor êxito no modo negativo de ionização, principalmente quando se fez estudos mais detalhado para as partes das plântulas TSTFOTE, TSTFO, TSTCATESUP, TSTCASUP, CTSWFOTE, CTSWFO, CTSWCATESUP e CTSWCASUP, foi possível observar melhores diferenças entre os tratamentos, onde estes, serão abordados bem mais detalhados aliados as análises quimiométricas multivariadas.