similares. Neste caso, o composto também foi isolado e possui uma coloração amarela e sua fórmula molecular proposta pelo LC-MSE foi C
15H14O7. No espectro de
massas no modo negativo foi detectado o íon molecular m/z 305 [M-H]-. No espectro
do RMN 1H, pode-se observar um singleto em 8.5 ppm, como já havíamos
mencionado, onde o mesmo é característico de um fenol. Na região aromática do espectro aparece dois dubleto em δH 6.97 e 6.73 ppm (J= 6.0 Hz) que indica a
disposição meta destes prótons no anel aromático, assim também aparece um tripleto que integra a um próton em δH 6.97 ppm (J= 6.0 Hz) que também forma parte do
341.2686
1+ Auto msms F955_Pos_P2-F-4_01_4177.d: +MS2(341.2686), 20.0eV, 4.65min #290
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 4 x10 Intens. -100 0 100 200 300 400 500 600 700 m/z 106.0856 133.0878 151.0966 170.2037 203.8739 242.7024 270.1575 301.1461 319.2914 343.2751 1+ Auto msms F955_Pos_P2-F-4_01_4177.d: +MS2(341.2686), 20.0eV, 4.65min #290
0 50 100 150 200 250 Intens. 100 150 200 250 300 350 m/z
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mesmo sistema de spins. Na parte de menor deslocamento químico aparecem dois sinais em δH 2.70 e 2.42 ppm que integram a um próton cada um, com constante de
acoplamento de 12 Hz, caraterístico de acoplamento germinal em prótons ligados a carbonos sp3, como mostra a FIGURA 5.13. O experimento 1H-1H-COSY ratificou que
os três sinais aromáticos têm acoplamentos entre si e formam parte de um mesmo anel aromático.
FIGURA 5. 12 - Composto 2 isolado da fração de acetato de etila do meio de cultivo CM do oomiceto
Phytophthora nicotianae da classe das Antronas.
FIGURA 5. 13 -Espectro de RMN 1H- 600 MHz (MeOD), com sua ampliação na região aromática do
composto do pico 5 da fração de acetato de etila do oomiceto desenvolvido em meio de cultivo CM.
Os experimentos bidimensionais de HSQC e HMBC facilitaram o estabelecimento das conectividades diretas e a mais de duas ligações, respectivamente, entre carbonos e próton da estrutura (TABELA 5.2). Tem-se um fato de muito interesse a presença do carbono spiro no deslocamento de carbono em 74.9 ppm e a suas conectividades a mais de duas ligações com os prótons diasterotópicos
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H-10a e H-10b. Do mesmo modo, também foi relacionado um sinal em 133.5 ppm, de um outro carbono quaternário que apresenta acoplamento heteronuclear a longa distância com os prótons mencionados anteriormente, assim como o próton δH 6.84
do sistema aromático. Os restantes dos carbonos quaternários não aparecem no espectro e não podem ser correlacionados, devido sua pouca quantidade de massa isolada para este composto em torno de 1mg. Infelizmente isto também impossibilitou a realização dos espectros de NOESY-2D para determinar a configuração relativa dos substituintes em C-11, como é ilustrado no mapa de contorno na FIGURA 5.14.
TABELA 5. 2 - Correlação 1H-13C HSQC e HMBC para o composto 2, referente ao pico 5.
Posição 13C (δC=ppm) HSQC δH (J/Hz) HMBC (δH=ppm) 14 179.5 - 2.70, 2.42 12 176.8 - 2.70, 2.42 4 133.5 - 6.84, 2.70, 2.42 2 122.9 6.84, d, 6.0 Hz 6.73 1 115.9 6.73, d, 6.0 Hz 6.97, 6.84 3 114.8 6.97, d, 6.0 Hz 6.84, 6.73 9 74.9 - 2.70, 2.42 10 42.1 2.70, 2.42, 2xd, 12 Hz - 7 29.3 1.32, t, 7.0 Hz 0.90 8 13.0 0.90, t, 7.0 Hz -
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FIGURA 5. 14 - Ampliação da região aromática e alifática do mapa de contorno HMBC (MeOD, 600MHz).
Com o espectro de massas obtido para a confirmação desse segundo composto mostra-se na FIGURA 5.15 que possibilitou prever a estrutura dessa nova antrona, com a resolução da massa a detecção do pico molecular em m/z 305, indicando a presença da molécula desprotonado [M-H]-. No espectro de MS2 para este
composto mostrou dois íons com fragmentos intensos em m/z 175 e 146. A proposta para fragmentação desse composto segue ilustrada na FIGURA 5.16.
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FIGURA 5. 15 - Espectro de massas para o íon m/z 305,0648 no tr 1,28 min encontrado no composto 2 referente ao pico 5 da fração de acetato de etila em meio de CM de P.nicotianae (ESI, modo positivo). Espectro de íons produtos (abaixo) e espectro do íon molecular da antrona (acima).
FIGURA 5. 16 - Proposta para a fragmentação da antrona com m/z 305. (ESI, modo negativo).
Os demais picos ainda não foram elucidados, pois os dados que temos em mãos até o momento, são insuficientes para propor as demais estruturas. Serão feitos novos trapeamentos em LC-SPE-NMR, na busca de uma melhor separação, resolução e absorção, pois com essa metodologia os possíveis metabólitos serão aprisionados em cartuchos de SPE, monitorado em vários comprimentos de onda (DAD), afim de se obter com maior facilidade uma maior quantidade de massa que
115.0348 206.0373 1- 162.0490 1- 175.0540 1- 305.0648 1- FP3 Auto ms_ms_P2-F-1_01_4175.d: -MS, 1.23-1.34min #87-99 0 1 2 3 4 4 x10 Intens. 100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 96.9567 108.0398 116.0444 128.0437 146.05581- 162.0469 172.0326 191.5453 206.0353 233.0244
FP3 Auto ms_ms_P2-F-1_01_4175.d: -MS2(305.0652), 35.0eV, 1.28min #94
0 100 200 300 400 Intens. 100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z
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seja suficiente para proceder com a identificação dos picos e aliado a essa técnica fazer experimentos em LC-MSE tanto no modo positivo quanto em modo negativo para
obter-se a massa do íon molecular.
5.3. Reisolamento de P. nicotianae para teste de patogenicidade
Os isolados do oomiceto de P. nicotianae foram reisolados de frutos de
limão siciliano que é bastante susceptível ao patógeno onde esses frutos seguiram previamente imersos por 15 min em solução de hipoclorito de sódio ao 2,5%, seguido de lavagem em água destilada esterilizada para remoção do excesso. Com auxílio de um furador de rolha (12 mm de diâmetro) flambado, o fruto foi furado penetrando-se a casca e o albedo, sendo removida esta camada e adicionado no local um disco no meio ágar, contendo o micélio do respectivo isolado de P. nicotianae. O orifício foi novamente coberto com a casca inicialmente removida e protegido com esparadrapo. Os frutos do limão foram mantidos durante 7 dias em incubadora tipo BOD à 28ºC, no escuro. Após esse período, pedaços da área lesionada pelo patógeno foi coletada e transferida para meio cenoura milho-ágar, a fim de propiciar as condições para o desenvolvimento do patógeno. Essas culturas passaram a ser observadas até o crescimento característico de Phytophthora, para a transferência da colônia pura e assim termos um material bem mais ativo, para o estudo de interação patógeno versus hospedeiro, como mostra a FIGURA 5.17.
FIGURA 5. 17 - Comparativo de crescimento micelial de P.nicotianae – a) meio de CM com o inóculo após várias repicagens e b) meio de CM com o inóculo após o reisolamento.
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