Análises do caule superior dos pés francos no modo negativo de ionização

Nessa etapa do trabalho as matrizes dos pés francos, (análises tanto para o caule superior quanto para as folhas), foram analisadas no modo negativo de ionização, pois, é esperado que para os compostos que mais variaram nessas matrizes, apresentem uma melhor ionização, devido tratar-se destes glicosilados, onde principalmente em partes aéreas, são os flavonoides, uma classe majoritária em

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estudos de folhas. Alguns desses compostos já são observados nos caules superiores, muitas vezes translocados da parte área ou vice-versa.

Em plantas, os flavonoides podem ocorrer de várias formas modificadas correspondentes a uma adicional hidroxilação, metilação e principalmente a glicosilação. Essa glicosilação pode ocorrer por ligação direta da unidade de açúcar ao núcleo do flavonoide, através de uma ligação C-C, resistente a ácido, para formar flavonoides C-glicosilados. Os flavonoides ocorrem geralmente como O-glicosilados, em que um ou mais grupos hidroxilas da aglicona está ligado a uma unidade de açúcar com a formação de uma ligação O-C glicosídica, o qual é um hemiacetal instável em meio ácido. Qualquer um dos grupos hidroxilas podem ser glicosilados, mas certas posições são favorecidas. São locais de glicosilação comuns a posição C-7 de flavonas, flavanonas e isoflavonas, posição C-3 e C-7 em flavonóis, e posições C-3 e C-5- em antocianidinas (DEWICK, 2009).

Essas duas classes de flavonoides mencionadas, C e O-glicosilados, apresentam diferentes mecanismos de fragmentação, característico para cada um deles (FIGURA 5.89). Em experimentos de MS/MS é comum que as classes de flavonoides O-glicosilados, gerem íons característicos, pois estes são formados por reações de rearranjo nas ligações interglicosídicas. Dessa maneira, é muito comum observar nestes espectros a perda das unidades de açúcar, uma vez que existe uma ligação C-O que vai estar bastante enfraquecida.

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FIGURA 5. 88 - Fragmentações características de Flavonoides C-glicosilados e O-glicosilados (Fonte: Bellete, 2014).

Para os flavonoides C-glicosilados, análises de espectrometria de massas de primeira ordem irão fornecer apenas a massa do íon pseudo- molecular, análises do tipo MS/MS permitem a caracterização destes em ambos os modos de ionização, positivo ou negativo. O principal caminho de fragmentação para essa classe de flavonoides são clivagens através da própria unidade de açúcar, uma vez que estes não apresentam mais a ligação lábil C-O que os O-glicosilados possuem. Existem diversas possibilidades de clivagens para o resíduo de açúcar, sendo característico e mais comum para estas perdas de 90, 120 e 150 Da o que acontece com as hexoses (DEWICK, 2009).

Começando os estudos pelo caule superior de citros Valência enxertados nos pés francos de TST, de acordo com as análises estatísticas feitas pelo S-plot (FIGURA 5.90), as matrizes que mais se diferenciaram das amostras seguem de acordo com a FIGURA 5.91.

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FIGURA 5. 89 - Gráfico S-Plot do caule superior de TST no modo negativo de ionização.

FIGURA 5. 90 - Bandas cromatográficas evidenciadas pelo gráfico S-plot nas matrizes de caule superior de plântulas de TST (ESI, modo negativo).

Os íons presentes no gráfico da FIGURA 5.90 que estão nos extremos foram os que mais se diferenciaram em plântulas de TST, com m/z 593,1487 no tr em 5,37 e 7,52 min, a banda 1 e 3 no cromatograma de íons totais, infere que estamos com flavonoides glicosilados (FIGURA 5.92). Estes apresentaram uma diferença de massa teórica para experimental em 0,1 mDa. No espectro de íon molecular e de íon

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produto (FIGURA 5.93) foram observadas para a banda 1, perdas de 240 Da, perdas estas típicas de flavonoides C-glicosilados. Essa perda de 240 Da foi proveniente de duas perdas consecutivas de 120 Da, gerando fragmentos característicos para essa molécula em m/z 473 e m/z 353, que são referentes a unidade de açúcar, que estão ligadas cada uma no carbono C6 e C8, como podemos observar na proposta de fragmentação na FIGURA 5.94 e 5.95.

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FIGURA 5. 92 - Espectro de massas para o íon m/z 593,1486 no tr 5,37 min encontrado no caule superior de TST (ESI, modo negativo). Espectro de íons produtos (abaixo) e espectro do íon molecular do flavonoide vicenina-2 (acima).

FIGURA 5. 93 -Mecanismo de fragmentação proposto para perda de 120 Da.

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FIGURA 5. 94 - Proposta de fragmentação para o flavonoide vicenina-2, identificado no caule.

Para a banda 2 com tr em 7,52 também foi encontrado o mesmo íon pseudomolecular [M-H]- _{593, porém com características de fragmentações}

diferentes, em seu espectro de íon produto foi possível observar um único pico bastante estável (FIGURA 5.96), as perdas observadas para esse íon molecular foram diferentes quando comparadas com a banda 1, identificada como vicenina-2. Nesse caso, houve uma perda de 308 Da gerando um fragmento com íon em m/z 285, isso se dá devido uma característica de composto da classe dos flavonoides O- glicosilados como mostrado no esquema da FIGURA 5.89. Esse flavonoide é do tipo 7-O-glicosilado, seus resíduos de açúcar são uma raminose e uma glicose. A glicose está ligada a raminose pelo carbono C5, como podemos observar na proposta de fragmentação ilustrada na FIGURA 5.97.

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FIGURA 5. 95 - Espectro de massas para o íon m/z 593,1486 no tr 7,52 min encontrado no caule superior de TST (ESI, modo negativo). Espectro de íons produtos (abaixo) e espectro do íon molecular do flavonoide didimina (acima).

FIGURA 5. 96 - Proposta de fragmentação para o flavonoide didimina, identificado no caule superior do citrus de TST (ESI, modo negativo).

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Na banda 3, no tr 8,46 min nos experimentos de full scan no modo negativo nas matrizes do caule superior de TST, foi possível detectar um íon pseudomolecular em [M-H]- _{623 e com seus espectros de íon produto (FIGURA 5.98)}

com íons detectados em m/z 503, 413 e 383, sendo como pico base referente para esse composto m/z 383, foi possível inferir que estávamos com a molécula 6,8 –di- C-Glu-diosmetina (FIGURA 5.99). Ocorreu perda de 120 u.m.a do íon pseudomolecular, levando a m/z 503, este sofre perda de 90 Da levando a m/z 413, sofrendo uma outra modificação agora perdendo 120 Da para ter a fragmentação com íon base m/z 383.Fragmentações estas, típicas de flavonoides C-glicosilados. Quando o íon m/z 383 perde duas unidades de monóxido de carbono (CO), ele gera íons fragmentos em m/z 355 e 327, referentes a perda de 28 Da para cada fragmentação, como mostra a proposta para essa molécula na FIGURA 5.100.

FIGURA 5. 97 - Espectro de massas para o íon m/z 623,1592 no tr 8,46 min encontrado no caule superior de TST (ESI, modo negativo). Espectro de íons produtos (abaixo) e espectro do íon molecular do flavonoide 6,8-Di-C-Glu-diosmetina (acima).