sp isolado de Podocarpus macrophyllus.
4.1 Experimento de biossorção de metais pesados pelo Bacillus sp (LaBioMMi 1141)
4.1.3 Análise dos espectros de MALDI TOF-MS das células intactas do LaBioMMi 1141 (Bacillus sp.) submetido aos experimentos de biossorção
de Fe+ e Cu2+.
Ao final dos experimentos determinados pelo planejamento fatorial além da dosagem da concentração residual de metais no meio de cultura, também foi avaliado o espectro de massas de MALDI TOF-MS, no modo positivo de aquisição de íons, na região de 650 a 3500 Da, para as células dos microrganismos avaliado. Como ferramenta no auxílio no tratamento de dados, e na busca de alterações no perfil de metabolitos na região avaliada, foi utilizado a ferramenta de PCA disponível no pacote Biotyper. A Figura 3.9 demonstra os resultados obtidos do gráfico de scores e loadings para os espectros do LaBioMMi 1141 (Bacillus sp.) cultivados em diferentes concentrações de Fe3+. O gráfico gerado pode explicar bem a separação observada
para o sistema, haja vista que a componente principal 1 (PC1) é composta por mais de 70% da variância total do sistema. Ao se analisar a dispersão das amostras no gráfico de scores pode-se distinguir a formação de dois grupos. Os mesmos foram separados com relação a concentração de Fe3+ do meio de cultura, sendo que um dos
mg/mL. Quando se compara o gráfico de PCA com o de loadings é possível e a associação dos íons que servem como marcadores químicos para distinguir os grupos. O grupo dos microrganismos cultivados em 350 mg/mL distingue-se por marcadores presentes nas regiões de 880 a 930 Da e 960 e 990 Da enquanto o grupo cultivado em 175 mg/mL distingue-se por marcadores na região de 600 a 700 Da.
Figura 3.9. Gráfico de a) PCA e b) Loadings para os espectros de MALDI TOF-MS das células intactas do LaBioMMi 1141 (Bacillus sp.) no experimento de biossorção de Fe3+.
Contudo, para o experimento de biossorção de Cu2+ não foi possível
observar um padrão que posso ser associado com as condições de cultivo do microrganismo. A Figura 3.10 demonstra o gráfico de scores e loadings dos espectros de MALDI TOF-MS dos microrganismos cultivados no meio de cultura contendo diferentes concentrações de Cu2+. Embora a variância explicada pelas componentes
principais seja elevada, aproximadamente 80% na PC1, observa-se apenas um agrupamento composto por espectros de microrganismos cultivados a 0,04 mg/mL de Cu2+ e outro agrupamento composto por uma mistura de microrganismos cultivados a
Figura 3.10 Gráfico de a) scores e b) loadings para os espectros de MALDI TOF-MS das células intactas do LaBioMMi 1141 (Bacillus sp.) no experimento de biossorção de Cu2+.
Com base na região de massa, determinada pelo PCA, para os microrganismos crescidos em condições com alta concentração de Fe3+
, foi realizada
a busca de moléculas sideroforas que seriam condizentes com essa região. A Figura 3.11 ilustra a molécula da bacillibactina, a qual é a atribuída a mediação do transporte de íons Fe3+ para dentro das células do microrganismo, e o processo pelo qual ocorre
a captura de íons Fe3+ do meio de cultura e transporte para o interior da célula.185.
Embora as massas da mesma e do complexo dela com íons Fe3+ estejam dentro da
região estabelecida pelo PCA, [M+H]+ igual a 883 Da e [M-2H+Fe3+]+ igual a 935 Da,
nenhum desses marcadores foi observado nos espectros. Contudo, os sinais referentes a Bacillibactina hidrolisada e o complexo ferri-Bacillibactina hidrolisada foram observados, [M+H]+ igual a 900 Da e [M-2H+Fe3+]+ igual a 954 Da. Além disso,
a Figura 3.12 ilustra a estrutura do complexo ferri-Bacillibactina formado durante o processo de transporte do metal para o interior da célula.
Figura 3.12 Ilustração do complexo ferri-Bacillibactina.
Em 2006, Miethke et al. condensaram as várias etapas descritas anteriormente em uma rota para aquisição de Fe3+ pelas células do microrganismo186.
Onde a biossíntese da Bacillibactina ocorre no interior da célula a parti da condensação de unidades de ácido 2,3-dihidroxibenzóico (DBH), Glicina e Treonina para a formação da trilactona a partir de três unidades do catecol (2,3- dihidroxibenzoato-glicina-treonina). Quando sintetizada a Bacillibactina é excretada para o meio, onde se complexa com íons ferro e possibilita a passagem desses pela membrana celular do microrganismo. No citosol, o anel trilactônico é hidrolisado novamente em 3 unidades de catecol (2,3-dihidroxibenzoato-glicina-treonina) e os íons Fe3+ são liberados.
Como não foi possível o isolamento e fragmentação via dissociação por colisão (Collision-induced dissociation), dos íons majoritários presentes nos espectros adquiridos, haja visto que os mesmos foram adquiridos diretamente das células intactas do microrganismo e abundância muitas vezes não era elevada, um padrão de fragmentação da Bacillibactina hidrolisada, trímero do catecol (2,3-dihidroxibenzoato- glicina-treonina), foi proposto com o intuito de se buscar íons marcadores de metabólito, na fragmentação ocorrida na fonte (Post-source decay). A Figura 3.13 ilustra o esquema de fragmentação proposto para a Bacillibactina após sofrer a hidrolise, adicionalmente também foi calculada a massa do complexo do trímero do
catecol (2,3-dihidroxibenzoato-glicina-treonina) complexado com Fe3+.
Primeiramente, há a liberação de 2,3-hidroxibenzamida como perda neutra, cuja massa é 153 da, do íon do trímero do catecol (2,3-dihidroxibenzoato-glicina-treonina), cuja massa é 901 Da, para originar o íon 748 Da. Então, nesse íon há uma migração de hidrogênio, seguida de um rearranjo para então ocorrer a perna neutra de 3- metiloxiaziridina, cuja massa é 53 Da, e obtermos o fragmento cuja massa é igual 691 Da. O íon de 691 Da sofre duas fragmentações seguindo do rearranjo do tipo McLafferty para na primeira etapa ocorrer a liberação de CO2, 44 Da, e na segunda a
liberação de propadieno, 40 Da, e obter o dímero do catecol (2,3-dihidroxibenzoato- glicina-treonina), cuja massa é igual a 607 Da.
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Nas Figura 3.14 e Figura 3.15 são ilustrados os espectros de MALDI TOF-MS, adquiridos no modo positivo de aquisição de íons, do microrganismo LaBioMMi 1141 (Bacillus sp.) sendo que as Figura 3.14 a) e b) representam o microrganismo cultivado em 350 e 175 mg/mL de Fe3+
, respectivamente, e as Figura