Avaliação do perfil de compostos fixos produzidos por Bacillus spp.

3.5.1 Metodologia de preparo das amostras para aquisição dos espectros de MALDI - TOF MS

A metodologia empregada no preparo das amostras visava a utilização de células intactas que propiciam a rápida aquisição com pouquíssimo pré-tratamento da amostra e a aquisição de espectros com maior número de sinais quando comparados a outras metodologias de preparo de amostra61,62_.

As amostras consistiam no esfregaço direto, com o auxílio de um palito de madeira, do material biológico proveniente de uma colônia da placa de cultura, sobre o spot da placa de análise. Posteriormente, 1 μL de solução de ácido α-ciano- 4-hidroxicinâmico na concentração de 20 mg.mL-1_{, preparado em solução 1:1 v/v}

acetonitrila:água com 0,1% ácido trifluoroacético, foi aplicado sobre o spot da amostra com posterior evaporação do solvente à temperatura ambiente. Cada microrganismo isolado foi cultivado em triplicata e cada um desses foi aplicado em 16 spots da placa de análise, de forma que o total de 48 espectros foram adquiridos, com os mesmos parâmetros de aquisição de dados.

3.5.2 Metodologia de aquisição de espectros MALDI-TOF MS

Os espectros foram adquiridos em um espectrômetro de massas Bruker® Autoflex speed (Bruker Daltonics®, GmbH) equipado com o laser Smartbean II (355 nm) e operado pelo software flexControl® (versão 3.3, Bruker Daltonics, GmbH). O equipamento foi previamente calibrado com o padrão BTS (Bacterial Test Standard, Bruker Daltonics®, GmbH) ou a cepa padrão de Escherichia coli ATCC 25922 CHB ou DH5alpha BRL, com 24 horas de incubação a 37ºC em meio Mueller Hinton.

A intensidade do laser foi ajustada de acordo com o padrão de calibração e os espectros foram adquiridos nos modos linear, MALDI(+)-TOF MS e reflectron, MALDI(+)-TOF/TOF MS de aquisição de íon na faixa dinâmica de 2000 a 20000 Da para o modo linear e 700 a 3000 Da para o modo reflectron.

Os espectros foram adquiridos aleatoriamente em diferentes posições do spot por meio de movimento randômico no modo automático de aquisição do

software FlexControl®. Os parâmetros do espectrômetro em cada modo estão listados na tabela abaixo:

Tabela 2.2. Descrição dos parâmetros dos métodos utilizados na aquisição de íons para o modo linear e reflectron.

Parâmetro Modo Linear Modo Reflectron

Number of shots 2000 2000

Laser repetition rate 1000 1000

Ion source voltage 1 20 kV 20 kV

Ion source voltage 2 18,5 kV 17,4 kV

Lens voltage 8,2 kV 8,5 kV

Reflector voltage 1 22 kV

Reflector voltage 2 10 kV

3.5.3 Processamento dos dados de MALDI - TOF MS e MALDI - TOF/TOF MS

Os dados adquiridos foram processados utilizados os softwares flexAnalysis® versão 3.3 e MALDI Biotyper® 3.1 (Bruker Daltonics GmbH). Previamente as análises realizadas: comparação com o banco de dados de espectros do Biotyper®, as análises de componentes principais (PCA) e matriz de índice de correlação (CCI), os espectros foram pré-processados de acordo com parâmetros padrões recomendados para cada uma dessas análises. A seguir os parâmetros de pré-processamento estão listados:

Tabela 2.3. Parâmetros utilizados no pré-processamento para identificação das bácterias, análise de componentes principais e matriz de índice de correlação.

Parameter Standard PCA CCI

Mass Range [Da] 3000-15000 700-2500

700-2500 3000-15000 Method Spectra compressing Selected range Selected range Smoothing

Method Savitsky-Golay Savitsky-Golay Savitsky-Golay

Frame size [Da] 25 25 25

Nº of runs 2 2 2

Normalization Método Maximum norm Minimum Minimum

Peak Picking

Max. Peak 100 100 100

Thresold 0,001 0,01 0,01

Method Spectra differentiation Peak fitting Peak fitting

Tabela 2.4. Parâmetros do procedimento de criação de MSP e comparação com a biblioteca

Parameter Value

MSP Creation

Max. Mass Error of Each Single Spectrum 2000

Desired Mass Error for the MSP 200

Desired Peak Frequency Minimum (%) 25

Max. Desired Peak Number of the MSP 70

MSP identification

Frequency Threshold for Spectra Adjusting 50

Frequency Threshold for Score Calculation 5

Max. Mass Error of the Raw Spectrum 2000

Des. Mass Tolerance of the Adjusted Spectrum 250 Furthermore Accepted Mass Tolerance of Peak 600 Parameter of the Intesity Correction Function 0,25

MSP clustering

Distance Measure Correlation

Linkage Average

Score Threshold Value for a Single Organism 300

Tabela 2.5 Parâmetros para as análises de componentes principais (PCA) e matriz de índice de correlação (CCI).

Parameter Value PCA and CCI creation

Lower bound 700 e 3000

Upper Bound 2500 e15000

Resolution 02-04

PCA Clustering

Method Hierarchical Distance Measure Correlation Linkage Algorithm Average Maximal Cluster 4

CCI Parameter Intervals 8

3.5.4 Experimento de cultivo em escala ampliada

Com intuito de se isolar metabólitos secundários produzidos pelos isolados LaBioMMi 1137, 1141, 1180 e 1202, foram realizados cultivos em larga escala de 20 litros de meio de cultura.

Previamente aos cultivos, as bactérias foram reativadas a partir de conservas que estavam armazenadas em freezer a -20 ºC. Os isolados foram reativados em placas de petri de 9 mm contendo Nutriente Agar. Posteriormente a

reativação, os inóculos foram preparados em 6 mL de caldo Nutriente. As bactérias foram cultivadas em erlenmeyers de 1 L contendo 330 mL de caldo Nutriente, os microrganismos foram mantidos em incubadora por 14 dias a 37 ºC e 120 rpm de agitação.

Ao final do período de cultivo, a biomassa de células foi separada por meio de centrifugação a 5000 rpm, utilizando uma centrifuga da marca Eppendorf®, modelo 5810R. O pellet formado foi ressuspendido e lavado com o meio de cultura estéril.

Ao ser precipitado novamente, o pellet foi extraído com solução de metanol 70% por 15 minutos em ultrassom. Os resíduos de material celular foram separados por centrifugação a 7000 rpm. O sobrenadante foi coletado e seco em speedvac CHRIST® RVC 2-33 IR. O procedimento de extração foi realizado em triplicada.

3.5.5 Fracionamento dos extratos bacterianos

Os extratos de LaBioMMi 1137, 1141, 1180 e 1202 foram ressuspendidos em acetato de etila e misturados com sílica gel para realizar o procedimento de clean up em coluna filtrante. O procedimento foi realizado em uma coluna de 30 cm de comprimento x 7 cm diâmetro contendo 90 g de sílica gel flash, e o procedimento foi realizado sob vácuo. Os extratos foram eluídos com 500 mL de cada uma das misturas de: Hexano: Acetato de etila (9:1), Hexano: Acetato de etila (1:1), Acetato de etila 100%, Acetato de etila: Metanol (9:1), Acetato de etila: Metanol (1:1) e Metanol 100%. As frações foram coletadas em balões de 1000 mL e evaporadas em rotavapor.

O extrato obtido foi ressuspendido em acetato de etila e transferido para recipientes previamente pesados e posteriormente secos em dry block sob fluxo de ar comprimido. As 6 frações obtidas foram analisadas por cromatografia de camada delgada, utilizando placas com fase estacionária ODS e misturas de Metano:Água em diversas proporções foram utilizadas como eluente. As frações similares foram agrupadas e fracionadas em um cromatógrafo em escala preparativa. As separações das frações foram realizadas em modo isocrático utilizando uma coluna para cromatografia líquida de alta eficiência em modo preparativo Luna Phenyl-Hexyl 10 μ 100Å 250 x 21,2 mm PHENOMENEX®, empregando fluxo de 10 mL/min e detector

de índice de refração. As fases móveis empregadas no fracionamento do modo isocratico de separação foram previamente estabelecidas em separações em pequena escala, utilizando cromatografia de camada delgada.

3.6 Avaliação do perfil de compostos voláteis produzidos por Bacillus