Isolamento e análise qualitativa da variação sazonal de bactérias endofíticas associadas à Podocarpus macrophyllus.

A Tabela 1.7 relaciona o número total de bactérias isoladas de diferentes regiões de um indivíduo da espécie Podocarpus macrophyllus. Comparativamente, a região do caule apresentou maior número de isolados quando comparado a região das folhas e tal observação sugere um nível diferente de infecção das duas regiões

avaliadas. Entretanto, ao se avaliar a diferença do número de isolados com relação às estações do ano não se observa grande variação no número de isolados para uma mesma região da planta. Contudo, para se afirmar algo sobre à variação sazonal da comunidade de bactérias cultiváveis associada à planta Podocarpus macrophyllus é necessária a avalição de um maior número de indivíduos e a correlação do processo de isolamento com a identificação dos gêneros e espécies que colonizam a planta64,65_.

Tabela 1.7. Relação de quantidade de isolados por região da planta e estação do ano. Região Inverno Primavera Verão Outono

Folha 2 2 6 2

Caule 11 15 15 8

Fruto - 4 4 -

Semente - - - -

Total 13 21 25 10

Como visto na Tabela 1.7, um total de 69 isolados foram coletados ao longo de 1 ano de acompanhamento de um indivíduo da espécie Podocarpus

macrophyllus. Tal experimento teve como intuito catalogar quais os microrganismos

endofíticos estão corriqueiramente presentes nesta planta, além da elaboração de uma biblioteca de “fingerprints” de espectros de MALDI-TOF MS.

A Figura 1.6 ilustra a composição qualitativa da comunidade de bactérias cultiváveis associada ao indivíduo. Pode-se observar que a maior variedade de gêneros ocorreu nas estações de primavera e verão, e nestas estações foram isoladas as maiores quantidades de cepas, 21 e 25 cepas respectivamente, enquanto foram isolados 13 e 10 cepas no inverno e outono.

Figura1.6. Relação de porcentagem de microrganismos isolados por estação do ano.

Observa-se que a planta é prioritariamente colonizada por bactérias do gênero Bacillus, Staphylococcus e uma bactéria não identificada cujo código atribuído a mesma foi LaBioMMi 1137, posteriormente a mesma foi identificada como Bacillus

pumilus através do sequenciamento da região 16S rRNA. De acordo com o que pode

se visualizar na Figura 1.6, tais gênero estavam presentes em todas as estações do ano nas porcentagens de 30,7 %, 4,7 %, 4,0 % e 20,0 % para Bacillus spp.; 7,7 %, 19,0 %, 4,0 % e 0 % para Staphylococcus sp. e 46,2 %, 9,5 %, 12,0 %, 30,0% para a cepa LaBioMMi 1137, respectivamente para as estações de inverno, primavera, verão e outono.

Através da identificação dos microrganismos isolados nas 4 estações é possível inferir quais destes estão intimamente associados à planta e quais podem ser oportunistas. Alguns gêneros de bactérias, aparentemente oportunistas, foram isolados no inverno: LaBioMMi 1133; na primavera: Cupriavidus ssp., Klebsiella ssp.,

Pantonea ssp., Rhizobium ssp.; Verão: Arthobacter ssp., Burkholderia ssp., Outuno: Pseudomonas ssp. A

Tabela apêndice 1 do material no apêndice, relacionada a identificação dos microrganismos a partir da comparação da média de múltiplos espectros (MSP) de MALDI-TOF MS desses organismos com as bibliotecas Bruker Taxonomy® e LaBioMMi armazenadas no programa MALDI Biotyper® versão 3.1.

A Figura 1.7 ilustra o HCA dos espectros de fingerprints de MALDI-TOF MS para os microrganismos isolados. Os microrganismos puderam ser subdivididos em 8 grupos de acordo com a similaridade de seus espectros. Somente os isolados LaBioMMi 1148 e 1153 apresentaram distinção o suficiente para não se agruparem com os demais isolados. Vale destacar a proximidade dos grupos G6 e G7 que são constituídos pelas cepas similares ao LaBioMMi 1131 (Bacillus licheniformis) e LaBioMMi 1137 (Bacillus pumilus).

Como pode se observar na Figura 1.8 os espectros dessas cepas são bem similares, apresentam um padrão similar de íons. Entretanto, os marcadores 2946.490 Da, 3627.392 Da, 5894.478 Da e 7256.880 Da da cepa LaBioMMi 1131 estão deslocados em relação aos observados para a cepa LaBioMMi 1137 que são 3043.791 Da, 3621.042 Da, 6088.317 Da e 7246.505 Da.

Figura 1.7. Dendograma de MSP dos espectros de bactérias endofíticas obtido em MALDI-TOF MS na região de 2000 a 20000 Da no modo positivo de aquisição de íons.

Figura 1.8. Comparação dos espectros dos isolados LaBioMMi 1131 e 1137.

A Figura 1.9 compara os fingeprints das cepas contidas nos grupos G3 e G6. Ambos grupos são compostos por microrganismos que foram identificados pertencentes ao gênero Bacillus, através da comparação dos MSPs adquiridos experimentalmente com os contidos na biblioteca do software Biotyper®. Assim como nas análises de HCA, pode-se observa novamente que as cepas isoladas se dividem em dois conjuntos.

O primeiro grupo corresponde aos LaBioMMi 1131, 1141, 1142, 1163 e 1178 todos com indicação para espécie Bacillus licheniformis. Esse grupo demonstra alta correlação entre seus espectros, com índice de correlação variando de 0,73 entre as cepas LaBioMMi 1163 e 1178 até 0,910 para LaBioMMi 1131 e 1141.

O segundo grupo corresponde às cepas LaBioMMi 1136, 1180, 1196, 1197 e 1202. Entretanto, a correlação dos espectros dessas cepas é inferior à observada para as cepas do G6. É notável a separação do grupo G3 nos conjuntos LaBioMMi 1180 e 1202, e LaBioMMi 1196 e 1197 sendo o primeiro com correlação de 0,75 e o segundo com 0,59. Contudo, todas as cepas desse conjunto apresentam similaridade com a LaBioMMi 1136, sendo que a LaBioMMi 1196 apresenta correlação em torno de 0,81 e as demais cepas com correlação em torno de 0,64.

Figura 1.9. Análise de correlação entre os espectros de MALDI-TOF MS dos grupos G3 e G6 de isolados do Podocarpus macrophyllus.

Assim como observado para as cepas dos grupos G3 e G6, a Figura 1.10 compara os fingeprints das cepas contidas no G7. Novamente, o índice de correlação de seus espectros permite avaliar a similaridade dos microrganismos isolados. Os mesmos se subdividem nos agrupamentos contendo as cepas LaBioMMi 1133, 1134, 1137, 1138, 1140 e 1143 e no agrupamento das cepas LaBioMMi 1137, 1152, 1157, 1158, 1159, 1164, 1192, 1194 e 1195.

Embora seja possível a observar uma diferenciação em dois grupos, ainda há uma correlação entre esses com valor de aproximadamente 0,68. Além disso, há o fato de que ambos grupos são correlacionados à cepa LaBioMMi 1137 (Bacillus pumilus) sugerindo que essas cepas compartilham semelhanças pontuais em seus biomarcadores.

Outro fato notável é que a LaBioMMi 1137, além de colonizar

Podocarpus macrophyllus em todas as estações do ano, ainda foi isolado de todos os

tecidos avaliados de modo que se pode inferir que essa bactéria é um microrganismo endofítico bem adaptado ao hospedeiro.

Figura 1.10. Análise de correlação entre os espectros de MALDI-TOF MS dos grupos G7 de isolados do Podocarpus macrophyllus.

4.2 Comparação sazonal e regional da comunidade de bactérias