macrophyllus e sua influência na interação entre microrganismos
4 Resultados e discussões
4.3 Experimento de interação de crescimento entre o isolado LabioMMi 1180 e fungos endofíticos de Podocarpus macrophyllus.
Os experimentos de interação entre microrganismos foram realizados utilizando-se co-culturas de microrganismos em placa de Petri com o intuito de investigar se os metabólitos derivados da bactéria B. subtilis poderiam afetar o crescimento dos fungos Xylaria sp., Trichoderma sp. e Cladosporium sp.
Os microrganismos foram inoculados em cada canto da placa de Petri e o crescimento radial dos fungos foi monitorado durante 14 dias de incubação e, no final do experimento, a área ocupada pelo crescimento dos fungos foi determinada. Neste tipo de ensaio, os compostos orgânicos voláteis (VOCs) liberados pelos dois organismos são confinadas no espaço da placa, e os metabólitos fixos estão difundidos através do meio de cultura. O meio de cultivo generalista BDA, que promove rápido crescimento radial, e o meio R2A oligotrófico foram utilizados.
As interações entre fungos e bactérias podem seguir diferentes mecanismos. Embora não seja tão fácil determinar exatamente o que causa a inibição e seu ela funcionamento, a observação do desenvolvimento de colônias do microrganismo inibido pode fornecer algumas pistas sobre o mecanismo e quais os tipos de metabólitos envolvidos no processo de inibição.
Nas partes superiores e inferiores da Figura 2.19, é possível visualizar que a massa micelial do Cladosporium sp. cresce na placa de teste com quase a mesma geometria que o controle, mostrando apenas uma pequena assimetria. Pode indicando que talvez esta cepa de Cladosporium seja mais sensível aos VOCs produzidos por B. subtilis. Contudo, o crescimento de Xylaria sp. e do Trichoderma sp. apresenta maior assimetria. O crescimento assimétrico desses fungos ocorreu diretamente na face exposta ao B. subtilis, tal comportamento sugere a presença de um gradiente de difusão de metabólitos bioativos produzidos pela bactéria, que inibindo o crescimento invasivo dos fungos.
Figura 2.19. Experimento de interação entre isolados LaBioMMi 1180 e nos fungos Xylaria sp.,
Trichoderma sp. e Cladosporium sp.
As áreas de crescimento medidas nos experimentos e nos controles geraram gráficos, Figura 2.20 e 2.21, nas quais, observar-se que em todos os experimentos a presença do B. subtilis inibiu significativamente o crescimento de fungos Xylaria sp., Trichoderma sp. e Cladosporium sp. em ambos os meios de cultura avaliados.
A área ocupada pela Xylaria sp. foi reduzida de 2033 mm² (controle) para 1474 mm² no meio BDA e de 1905 mm² para 589 mm² em R2A, quando cultivado na presença do LaBioMMi 1180.
O mesmo comportamento foi observado para os demais fungos. A área ocupada por Cladosporium sp. reduziu de 1098 mm2 (controle) para 494 cm2, quando
Figura 2.20. Alteração da área de crescimento dos fungos em meio BDA quando em contato com o isolado LaBioMMi 1180.
Figura 2.21 Alteração da área de crescimento dos fungos em meio R2A quando em contato com o isolado LaBioMMi 1180.
As bordas das colônias dos microrganismos envolvidos nos experimentos de co-cultivo foram retiradas e um processo de microextração foi realizado. Na Figura 2.22 é demonstrado o perfil dos metabólitos que foram extraídos usando o procedimento de microextração e analisadas por MALDI-TOF MS. Os
espectros adquiridos mostram duas séries homólogas de íons detectados em m/z 1000-1100 e m/z 1450-1560 para os microextratos obtidos do controle de B. subtilis, e das três amostras extraídas, sendo essas: um da área próxima à bactéria, uma área próxima ao fungo, e um da posição intermediária entre os dois microrganismos. Os íons da série homóloga de m/z 1000-1100 foram atribuídos à surfactinas e iturinas, e os íons detectados a m/z 1450-1560 correspondem às fengicinas.
Essas duas séries de metabólitos são lipociclopeptídeos surfactantes já descritos na literatura como metabólitos produzidos por espécies de Bacillus, e apresentam potente atividade antimicrobiana.
A presença destes compostos em todos os microextratos coletados em diferentes regiões da placa de co-cultura corrobora a hipótese da difusão desses metabólitos pelo meio de cultura, explicando o crescimento assimétrico das colônias de fungos.
Figura 2.22 Perfil dos espectros de MALDI TOF/MS para os microextratos do experimento de interação entre o isolado LaBioMMi 1180 e Xylaria sp. isolada do Podocarpus macrophyllus.
Na literatura existem vários trabalhos citando a atividade antimicrobiana dos metabólitos de Bacillus spp. Essas bactérias possuem boas características para serem consideradas candidatas como agentes de controle biológico, protegendo as plantas contra o ataque de patógenos. Um total de 64 cepas de Bacillus spp., isoladas de diferentes hospedeiros, foram avaliadas como agentes para o controle de diversos fitopatógenos por Mora et. al.152. A maioria dessas cepas apresentou genes
relacionados à produção de diversos lipociclopeptídeos incluindo iturina, bacilomicina, fengicina e surfactina.
A produção destes ciclopeptídeos e sua atividade antibacterina foram demonstradas por meio de ensaios contra os fitopatógenos C. michiganensis, E.
amylovora, P. carotovorum, P. syringae, R. radiobacterand, R. solanacearum, X. arboricola e X. axonopodis153.
O efeito antifúngico de Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens foi avaliado contra Macrophomina phaseolina por Torres et. al.153 e observou-se que as
surfactinas e as iturinas foram os metabólitos majoritários no meio líquido juntamente com a fengicina.
As alterações estruturais causadas em M. phaseolina por estes metabólitos foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura e MALDI-TOF MS. Evidenciou-se que os metabólitos surfactina, iturina e fengicina induziram danos nos escleródios de M. phaseolina, resultando em importante efeito antifúngico e inibição do crescimento154.
Os clusters biossintéticos responsáveis pela produção de iturina C, surfactina, bacilomicina D e as fengicinas A e B foram confirmados por RT-PCR e, posteriormente, esses peptídeos foram detectados por MALDI-TOF MS por Sajitha et. al.154 A aplicação desses metabólitos foi avaliada contra Lasiodiplodia theobromae,
um fungo causador de fitopatologias em uma seringueira, mostrando resultados promissores155.
5 Conclusões
As ferramentas de análise dos fingerprints de microrganismos adquiridos por MALD-TOF MS, podem ser aplicadas na identificação e diferenciação de microrganismos, também podem ser aplicadas na triagem e seleção de microrganismos a serem utilizados em experimentos, assim como a determinação de metabólitos alvos a serem estudados.
A utilização dos espectros adquiridos nas regiões de 700 a 3000 Da e 2000 a 20000 Da aliados a ferramentas de análise multivariada foram imprescindíveis para a seleção dos isolados de trabalho LaBioMMi 1137, 1141, 1180 e 1202, quando comparados à biblioteca de Bacillus spp. isolados a partir de Podocarpus
macrophyllus. Adicionalmente, a utilização de ferramentas de reconhecimento de
padrões, scores aliados ao gráfico de loadings, pode-se verificar quais eram os marcadores químicos que diferenciavam essas cepas e quais compostos eram comuns a todas elas.
Os experimentos em larga escala possibilitaram o isolamento de moléculas de Iturina e Surfactina, que são comuns a todos os isolados, bem como dos marcadores Plantazolicina e Fengicina, que são exclusivas dos isolados LaBioMMi 1137 (Bacillus pumilus) e LaBioMMi 1180 e 1202 (Bacillus subtilis), respectivamente.
Embora não tem sido possível observar correlação entre o perfil de compostos voláteis dessas bactérias com o do óleo essencial das folhas do
Podocarpus macrophyllus, diversos compostos com aplicabilidade biotecnológica
puderam ser identificados. Essas bactérias são hábeis produtoras de pirazinas, que podem ser de grande interesse para a indústria de flavorizantes.
Outros metabólitos com possível interesse na aplicação com biocontrole são diversos compostos oxigenados, como as cetonas de cadeia curta e o benzaldeído, que apresentam atividade contra patógenos de plantas. Juntamente com esses compostos, o DTMS também apresenta atividade antimicrobiana e em alguns casos pode atuar como indutor do crescimento de raízes de mudas.
Esses resultados são reforçados pelos resultados dos experimentos de interação de bactérias e fungos. Em todos os casos avaliados as bactérias demonstraram efeitos inibitórios sobre o crescimento dos fungos. Enquanto para o fungo Cladosporium sp. parece haver um sinergismo entre a atuação dos metabólitos
fixos e voláteis, para Xylaria sp. e Trichoderma sp. o efeito inibitório parece ser devido à difusão de compostos bioativos através do meio de cultura.