Análise estatística

Os valores experimentais foram expressos como média ± erro padrão das médias (E.P.M.) de n experimentos indicados em cada caso. Os dados foram analisados utilizando a análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey para avaliar diferenças entre grupos experimentais. Valores de p<0.05 foram considerados significativos. Os valores de relaxamento provocados pelo composto BL-106 no corpo cavernoso e ureter foram calculados como percentual da contração induzida, as quais

foram tomadas como 100%. O programa Graph (GraphPad, version 6.0 Software, EUA) foi usado para as análises.

5 RESULTADOS

5.1 Docagem molecular

Para investigar o modo de acoplamento dos compostos na PDE5A e atribuir uma pontuação para a interação entre os compostos e os resíduos do bolsão catalítico foram realizados cálculos de docagem. O arquivo PDB utilizado para o presente estudo contém a estrutura da PDE5A co-cristalizada com o inibidor seletivo Tadalafil.

Portanto, o valor do desvio quadrático médio (RMSD) foi utilizado para a validação interna do processo de acoplamento, com valor de 0.32Å, este valor obtido foi bem dentro do limite aceitável (inferior a 2.0Å). Além da pose do Tadalafil no redocking ser quase completamente sobreposta com a orientação cristalográfica, validando os parâmetros de docagem (Fig. 8).

Figura 8. Redocking da molécula do Tadalafil usado como validação da docagem molecular. Comparação

entre a estrutura cristalográfica do Tadalafil (azul) e a melhor pose gerada pela docagem molecular (vermelha).

A validação indicou que o programa utilizado na docagem pode reproduzir com precisão a estrutura e a posição das moléculas usadas no estudo. Consequentemente, o algoritmo de acoplamento e o protocolo foram adequados para as simulações de docagem com os compostos.

A docagem molecular permite a obtenção de uma pontuação que é útil para estimar a afinidade de ligação entre a proteína e o ligante através destas funções, ademais permite selecionar a conformação mais provável.124 _{Neste sentido,}

apresentaremos a seguir os resultados obtidos no estudo das interações dos compostos com a PDE5 (Fig. 9). Esse estudo visou elucidar as funções de pontuação e quais são as interações com a PDE5.

BL106.1 Score -8.67 BL106.2 Score -8.10 BL106 Score -8.77 Tadalafil Score -9.34

Figura 9. Conformações de encaixe molecular e pontuações (score) previstas para os candidatos a

inibidores de PDE5A (verde). As interações intermoleculares são identificadas como ligações de hidrogênio (vermelho), apolares (azul) e íon-dipolo (preto).

Todos os compostos BLs foram acomodados na bolsão catalítico através de interações intermoleculares tais como ligações de hidrogênio, não polares e íon-dipolo. As pontuações para os novos inibidores variaram entre -8.10 a -8.77 kcal/mol.

Os resultados da docagem indicaram claramente que o composto BL-106 foi a melhor molécula ancorada, apresentando o valor de menor energia de ligação. De modo geral, as posições dos compostos no bolsão catalítico sugerem a capacidade dos compostos em inibir a ligação do GMPc no sítio.

BL106.3 Score -8.43 BL220 Score -8.28 BL230 Score -8.39 BL236 Score -8.15

5.2 Simulação de dinâmica molecular

Considerando a existência de diferentes conformações para os compostos e a enzima PDE5A, foram realizadas simulações de dinâmica molecular para encontrar possíveis novas interações entre os ligantes e o alvo. Convém a partir de agora, então, analisar a mobilidade conformacional do bolsão catalítico. Usamos esse modelo para refinar os nossos resultados, para assim obtermos uma conformação do sítio ativo que possibilitasse a ocorrência das interações em um sistema totalmente dinâmico.

A relação estrutura-função não é apenas influenciada pelos resíduos flexíveis do bolsão catalítico, mas também pelo equilíbrio das interações, incluindo as interações de ligação de hidrogênio e o empilhamento π-π entre os compostos e a PDE5A.

As ligações de hidrogênio entre os compostos e a PDE5A são muito importantes, especialmente a ligação de hidrogênio com o resíduo Gln817. Como mostrado nas Figura 10A e 10B as interações são sempre amostradas em distâncias superiores a 3Å, com poucas ligações de hidrogênio calculadas entre Gln817.

No entanto, os novos compostos podem ser estabilizados por interações polares dipolo-dipolo com anel indol dos compostos. Os compostos BL-106.2 e BL-220 são fortemente estabilizados pela cadeia lateral da Gln817, indicando que a orientação espacial destes compostos favorece a exposição do anel indol formando mais facilmente ligações de hidrogênio com a carbonila do resíduo Gln817.

Figura 10. Distâncias amostradas entre átomos de oxigênio da carbonila da cadeia lateral de Gln817 e

nitrogênio do grupo indol dos inibidores: (A) Tadalafil e (B) candidatos a inibidores.

Para compreender a progressão na capacidade de adaptação dinâmica do sítio ativo da PDE5A após a ligação dos compostos, a partir da hipótese de que outros resíduos importantes podem estabilizar os novos inibidores no bolsão catalítico, fizemos uma varredura no sítio ativo a fim de buscar quais foram os resíduos responsáveis por está estabilização.

Como ilustrado na Figura 11 há interações do anel indol de todos os compostos com os resíduos da Phe820 e Val782. Estes resíduos também são responsáveis pela estabilização dos compostos Sildenafil, Tadalafil e Vardenafil.25

Esta análise mostrou uma notável frequência na estabilização do composto BL-106 com ambos os resíduos da Phe820 e Val782, uma característica significativa na docagem desse inibidor no bolsão catalítico da PDE5A, uma vez que o mesmo não foi visto para os outros compostos.

Figura 11. Mapa de distribuições das distâncias para os pares do anel benzeno no grupo indol dos

inibidores com cadeias laterais não polares dos resíduos Phe820 (d1) e Val782 (d2) nas trajetórias de simulação de dinâmica molecular. A proximidade de todos os novos inibidores com Phe820 foi frequentemente observada, exceto para BL-106.3. Adicionalmente, BL-106.1 e BL-236 são observados distantes de Val782.

Descobrimos que estas são apenas algumas das possibilidades para as interações do inibidor com o bolsão catalítico e buscamos avaliar as interações para cada modificação química feita nos inibidores.

Figura 12. Interações específicas entre inibidores e resíduos de PDE5, de acordo com as modificações

químicas. (A) Met816 com BL-106; (B) Ala779 com BL-106.1; (C) Gln817 (d1) e cadeia lateral Met816 (d2) com BL-106.2; (D) Gln817 com BL-106.3; (E) Tyr612 com BL-220; (F) Gln779 (d1) e Gly659 (d2) com BL- 230; (G) Met805 (d1) e Phe786 (d2) com BL-236.

Os resultados mostraram que o grupamento metil no composto BL-106 favoreceu sua estabilização com resíduo da Met816 (Fig. 12A), a inserção do grupamento metoxi faz interações dipolares com backbone da Ala779 (Fig. 12B), a inserção do anel benzênico no BL-106.2 aumentou seu caráter hidrofóbico (Fig. 12C), o átomo de cloro no BL-106.3 (Fig. 12D) aumentou a eletronegatividade do anel atraindo grupamentos carregados positivamente, ligações de hidrogênio com os resíduos Gln817 foram amostradas para os compostos BL-220 devido a ausência do metil no anel de pirazina (Fig. 12E) e BL-230 a inserção do etanol no mesmo grupamento (Fig. 12F), e por fim a inserção do radical metil hidrofóbico na BL-236 favoreceu interações intermoleculares não polares (Fig.12G).

A Figura 13 mostra esquematicamente um modelo de interação para cada composto baseado na posição dos resíduos catalíticos da estrutura modelada dos compostos com a PDE5A. Podemos observar uma verdadeira rede de interações que acomodam os compostos da maneira mais estável possível, dependendo de suas características moleculares, amostragem estrutural e conformacional.

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Figura 13. Modelo de interação observado durante as simulações de dinâmica molecular mostrando a

proximidade entre os resíduos do sítio de ligação da PDE5 e grupamentos dos compostos. Alguns resíduos são caracterizados pela versatilidade de interações como Met816, Phe820, Val782, Tyr612, Phe786 e Gln817.

Ao mesmo tempo que as análises in silico geram resultados satisfatórios como a possibilidade de avaliar em nível molecular as interações de fármacos com alvos biológicos, o estudo destes pode e muito se beneficiar através de estudos in vitro e in

vivo. Assim, há um sinergismo entre as informações originadas dos estudos in silico com

seus respectivos efeitos in vitro.