CAROLINE HONAISER LESCANO
AVALIAÇÃO IN SILICO, IN VITRO E IN VIVO DE
COMPOSTOS CANDIDATOS A INIBIDORES DE
CAROLINE HONAISER LESCANO
AVALIAÇÃO IN SILICO, IN VITRO E IN VIVO DE COMPOSTOS CANDIDATOS A
INIBIDORES DE FOSFODIESTERASE 5
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Farmacologia.
ORIENTADOR: PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI
COORIENTADORA: PROF
a. DR
a. FABÍOLA TAUFIC MÓNICA IGLESIAS
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE
DEFENDIDA PELA ALUNA
CAROLINE HONAISER LESCANO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI.
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
CAROLINE HONAISER LESCANO
ORIENTADOR: PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI
COORIENTADOR: PROFa. DRa. FABÍOLA TAUFIC MÓNICA IGLESIAS
MEMBROS:
1. PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI
2. PROF. DR. RICARDO NASCIMENTO DOS SANTOS
3. PROF. DR. RODRIGO ALVARO BRANDÃO LOPES MARTINS
4. PROFa. DRa. SORAIA KÁTIA PEREIRA COSTA
5. PROF. DR. STEPHEN HYSLOP
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna.
Dedico a minha MÃE e meu PAI, por representarem tudo na minha vida.
AGRADECIMENTOS
Esta tese é fruto do trabalho e apoio de inúmeras pessoas,ainda que a memória me deixe registrar aqui apenas uma parcela delas, espero agradecer a todas.
Agradeço ao meu orientador, Gilberto De Nucci, pela oportunidade dada a mim. Obrigada por sua disponibilidade, pelo respeito ao nosso trabalho, e pelo ser humano que você é. A você, meus incondicionais agradecimentos por contribuir na minha formação. Por disponibilizar a infraestrutura e pelo seu empenho em promover recursos para que o trabalho pudesse ser desenvolvido.
Agradeço muito a Profa Fabíola Zakia Mónica pela oportunidade, confiança e por
sempre contribuir imensamente com seus comentários argutos e perspectivas no nosso trabalho. Agradeço a todos os Professores do Departamento de Farmacologia que contribuíram diretamente na minha formação e, sobretudo por dividirem por muitas às vezes seus conhecimentos. E aos funcionários do Departamento de Farmacologia, como reconhecimento do trabalho inestimável dedicado aos alunos. Sou grata especialmente ao Gustavo, Bruno, Maísa e Cidinha.
Agradeço a algumas pessoas muito especiais: Camila, Tiago, Cristiano, Mauro Napolitano, Roberta, Fernando e Glaucia por sua amizade. Meus sinceros agradecimentos. Agradeço aos amigos e colegas do Laboratório: André, Antônio, Noedi, Beto, Sandra, Júlio, Renan, Edith, Diana, Samara, Fernanda, Evandro, Pedro, Cleber e Cristiane. Agradeço imensamente ao Mauro Sucupira pela disponibilidade na quantificação dos compostos e seus ensinamentos.
À minha família, pelo apoio, carinho e amor, especialmente à minha mãe, por compreender pacientemente a minha ausência. Mãe e Pai são para vocês que ofereço o resultado deste trabalho e obrigado por tudo que ensinaram a ser. Ao Alex, Paulette, Bia e Tales pelas coisas que cultivamos e pela sorte de ter vocês em minha vida!
Ao Ivan, pelo amor, apoio, incentivo e paciência dado a mim. Por todos os dias vividos ao seu lado e ter me ensinado a cada dia ter ações para ser uma pessoa melhor.
À Capes e Fapesp (N. 2010/16947-9,2011/11828-4, 2013/05475-7 e 2013/08293-7) e CNPq(N.470374/2013-6) pelo financiamento desta pesquisa.
À todos agradeço, profundamente.
RESUMO
A terapêutica farmacológica dos inibidores da fosfodiesterase tipo 5 (PDE5) é considerada como tratamento de primeira linha para a disfunção erétil. Adicionalmente, são utilizados para o tratamento da hipertensão pulmonar idiopática e hiperplasia prostática benigna. Todos os inibidores de PDE5 têm semelhanças estruturais com o monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) e competem pela ligação no sítio catalítico. A seletividade e afinidade dos inibidores de PDE5 são determinadas pelo contato direto entre certos resíduos do domínio catalítico, e entender como ocorrem as interações moleculares pode ajudar no desenvolvimento de novos fármacos. Desse modo, o presente trabalho pretendeu avaliar uma série de novos derivados de 6,7-dihidro-3H-oxazolo[3,4-a] pirazina-5,8-diona in silico e in vitro sobre a proteína alvo PDE5, bem como avaliar a biodisponibilidade das novas moléculas. Neste trabalho, usamos como ferramenta de estudo a docagem molecular e a simulação de dinâmica molecular para analisar as interações das novas moléculas com a PDE5, além de utilizar métodos in vitro para estudar os efeitos dos compostos em células, plaquetas e tecidos humanos e por fim investigar os parâmetros farmacocinéticos. Os resultados de docagem e dinâmica molecular sugerem que os resíduos dos bolsões (bolsão-Q, bolsão-H e região L), que formam o domínio catalítico da PDE5A são orientados para criar uma rede de interações que acomodam os inibidores da forma mais estável, dependendo das características moleculares, estruturais e amostragem conformacional. Ademais, nas células de carcinoma de colón ou T84 os compostos promoveram o aumento dos níveis de GMPc sem efeito citotóxico. Nas plaquetas os compostos foram capazes de inibir a agregação após estímulo com o doador de óxido nítrico (nitroprussiato de sódio) e aumentar os níveis e GMPc e AMPc com melhores resultados na presença do composto BL-106. Complementarmente, mostramos que os compostos BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 foram capazes de inibir a enzima fosfodiesterase 5A. A atividade do BL-106 foi investigada no corpo cavernoso humano e de coelho e em ureter humano mostrando relaxamento com valores de pEC50 de 6.48 ± 0.20 (coelho), 7.14 ± 0.30 (humano) e 5.88
± 0.38 (humano). Finalmente, espera-se que os resultados apresentados nesta tese auxiliem no entendimento das interações dos novos compostos com a PDE5. Fornecendo
embasamento químico para a compreensão da ação destes compostos em nível biológico e que a descoberta destes possam abrir uma nova alternativa para o desenvolvimento de outros inibidores.
ABSTRACT
The pharmacological therapy with phosphodiesterase type 5 (PDE5) inhibitors is considered a first line of treatment for erectile dysfunction. In addition, they are used for the treatment of idiopathic pulmonary hypertension and benign prostatic hyperplasia. All PDE5 inhibitors have structural similarities with cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and compete for the bond in the catalytic site. The selectivity and affinity of PDE5 inhibitors are determined by the direct contact between certain residues of the catalytic domain, and understanding how the molecular interactions occur may help in the development of new drugs. This study, therefore, sought to assess a series of new 6,7-dihydro-3H-oxazolo[3,4] pyrazine-5,8-dione derivatives through in silico and in vitro studies on the target protein PDE5, in addition to evaluating the bioavailability of the new molecules. In this study, we used the molecular docking and molecular dynamics simulation tools to analyze the interactions of the new molecules with PDE5, in addition to using in vitro methods to study the effects of the compounds on cells, platelets and human tissue, and finally, to investigate the pharmacokinetic parameters. The molecular docking and dynamics results suggest that residues of pocket (Q-pocket, H-pocket and region L), which form the catalytic domain of PDE5A, are oriented to create a network of interactions that can accommodate the inhibitors in a more stable way, depending on the molecular, structural and conformational sampling characteristics. Furthermore, the compounds promoted increased levels of cGMP in the colon carcinoma or T84 cells without cytotoxic effect. In the platelets, the compounds were able to inhibit aggregation after stimulation with the nitric oxide donor (sodium nitroprusside) and to increase the cGMP and cAMP levels with better results in the presence of the BL-106 compound. In addition, we showed that the BL-106, BL-220, BL-230 and BL-236 compounds were able to inhibit the phosphodiesterase 5A enzyme. The activity of BL-106 was investigated in the corpus cavernosum of a human and rabbit and in a human ureter, showing relaxation with pEC50 values of 6.48 ± 0.20 (rabbit), 7.14 ± 0.30 (human) and 5.88 ± 0.38
(human). Finally, it is expected that the results presented in this thesis may assist in understanding the interactions of new compounds with PDE5, providing a foundation for understanding the action of these compounds on a biological level, and that the
discovery of these mechanisms may open up new alternatives for the development of other inhibitors.
LISTA DE DROGAS
SUBSTÂNCIA PROCEDÊNCIA
Ácido araquidônico Cayman Chemical
BL-106 Laboratório Biolab (Brasil)
BL-106.1 Laboratório Biolab (Brasil)
BL-106.2 Laboratório Biolab (Brasil)
BL-106.3 Laboratório Biolab (Brasil)
BL-220 Laboratório Biolab (Brasil)
BL-230 Laboratório Biolab (Brasil)
BL-236 Laboratório Biolab (Brasil)
DMEM-F12 Ham Sigma-Aldrich (EUA)
DMSO Sigma-Aldrich (EUA)
Enterotoxina termoestável tipo A Bachem (EUA)
Estreptomicina Gibco (EUA)
Forscolina Sigma-Aldrich (EUA)
Nitroprussiato de sódio Sigma-Aldrich (EUA)
Noradrenalina Sigma-Aldrich (EUA)
Penicilina Gibco (EUA)
Tadalafil Laboratório Biolab (Brasil)
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AA Ácido araquidônico
AC Adenilato ciclase
ACTB Gene da Beta-actina
Ala Alanina
AMPc Monofosfato cíclico de adenosina
ANOVA Análise de variância
ANP Peptídeo natriurético atrial
ASCinf Área sob a curva de concentração da droga versus tempo do tempo
0 (zero) extrapolada ao infinito
ASCúltimo Área sob a curva de concentração da droga versus tempo do tempo
0 (zero) ao tempo da última concentração
ATCC American Type Culture Cell
ATP Trifosfato de adenosina
BNP Peptídeo natriurético cerebral
C0 Concentração no tempo 0
CAM Ca+2/calmodulina
cDNA DNA complementar
CG Gradiente conjugado
Cl Clearance ou Depuração
CNP Peptídeo natriurético do tipo C
CO2 Dióxido de carbono
CQA Controle de qualidade alto
CQB Controle de qualidade baixo
CQM1 Controle de qualidade médio 1
CQM2 Controle de qualidade médio 2
Cúltimo Concentração correspondente ao último tempo
DE Disfunção erétil
DEPC Dietilpirocarbonato
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DPBS Tampão fosfato salino de Dulbecco
DTNB Ácido 5,5-ditiobis 2-nitrobenzóico
DTT Ditiotreitol
EDRF Fator de relaxamento dependente do endotélio
EDTA Ácido etilenodiaminotetra acético
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
EPM Erro padrão da média
FDA Food and Drug Administration
GC Guanilato ciclase
GCp Guanilato ciclase particulada
GCs Guanilato ciclase solúvel
Gln Glutamina
Glu Glutamato
Gly Glicina
GMPc Monofosfato cíclico de guanosina
GTP Trifosfato de guanosina
HPLC High Performance Liquid Chromatography
Ile Isoleucina
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
InsP3 Inositol trifosfato
IP3R Receptor de inositol trifosfato
Ke Constante de eliminação
LDH Lactato desidrogenase
Leu Leucina
MD Dinâmica molecular
Met Metionina
MLC Fosfatase de cadeia leve da miosina
MLCK Kinase de cadeia leve da miosina
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NOS Óxido nítrico sintase
ON Óxido nítrico
PCR Reação em cadeia da polimerase
PCR-RT Reação em cadeia da polimerase em tempo real
pEC50 Antilog da concentração de droga necessária para produzir 50%
do efeito máximo PDB Protein data bank
PDE Fosfodiesterase
PDE4 Fosfodiesterase tipo 4
PDE5 Fosfodiesterase tipo 5
PDE6 Fosfodiesterase tipo 6
Phe Fenilalanina
PKA Proteína kinase dependente de AMPc
PKG Proteína kinase dependente de GMPc
PPP Plasma pobre em plaquetas
PRP Plasma rico em plaquetas
qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa
RMSD Root-mean-square deviation
RNA Ácido ribonucleico
SBF Soro fetal bovino
SNC Sistema nervoso central
SNP Nitroprussiato de sódio
STa Enterotoxina termoestável tipo A
T1/2 Tempo de meia vida
T84 Linhagem celular de carcinoma de cólon humano
TBX Tromboxano
Thr Treonina
Túltimo Tempo da última concentração
Tyr Tirosina
Val Valina
Vd Volume de distribuição VMD Visual Molecular Dynamics
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Isoformas da família de fosfodiesterases, distribuição e seus principais substratos. ... 32
Tabela 2. Descrição dos sistemas considerados em estudos de dinâmica molecular. ... 50
Tabela 3. Sequências de primers oligonucleotídicos para genes alvo utilizados na RT-PCR. ... 56
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cascata de sinalização do GMPc.. ... 28
Figura 2. Alvos do GMPc após a cascata de sinalização. ... 30
Figura 3. Hidrólise de AMPc e GMPc em AMP e GMP pelas fosfodiesterases. ... 33
Figura 4. Diagrama em fita da estrutura cristalográfica da fosfodiesterase 5 (PDB:1XO7). ... 35
Figura 5. Mecanismo de ação dos inibidores de PDE5 na ereção peniana ... 37
Figura 6. Desenho representativo dos parâmetros geométricos que definem os potenciais de interações intra e intermoleculares dos campos de força utilizados em simulações de dinâmica molecular ... 42
Figura 7. Estrutura molecular dos novos candidatos a inibidores de fosfodiesterase 5. ... 44
Figura 8. Redocking da molécula do Tadalafil usado como validação da docagem molecular. ... 66
Figura 9. Conformações de encaixe molecular e pontuações (score) previstas para os candidatos a inibidores de PDE5A. ... 68
Figura 10. Distâncias amostradas entre átomos de oxigênio da carbonila da cadeia lateral de Gln817 e nitrogênio do grupo indol dos inibidores ... 70
Figura 11. Mapa de distribuições das distâncias para os pares do anel benzeno no grupo indol dos inibidores com cadeias laterais não polares dos resíduos Phe820 (d1) e Val782 (d2) nas trajetórias de simulação de dinâmica molecular. ... 71
Figura 12. Interações específicas entre inibidores e resíduos de PDE5, de acordo com as
modificações químicas. ... 72
Figura 13. Modelo de interação observado durante as simulações de dinâmica molecular mostrando a proximidade entre os resíduos do sítio de ligação da PDE5 e grupamentos dos compostos. ... 74
Figura 14. Efeito dos compostos na atividade celular metabólica pelo ensaio de MTT. ... 75
Figura 15. Atividade citotóxica dos compostos pelo ensaio de LDH. ... 76
Figura 16. Efeito dos compostos sobre o acúmulo de GMPc em células. ... 77
Figura 17. Curva concentração resposta para os compostos no acúmulo de GMPc induzido por STa em diferentes concentrações (0.01-1 µM) em células T84.. ... 78
Figura 18. Expressão do gene PDE5 em células T84 a partir RT-PCR semi-quantitativa. ... 79
Figura 19. Expressão do gene PDE5 em células T84 foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. ... 80
Figura 20. Efeito dos compostos sobre a agregação plaquetária. ... 81
Figura 21. Efeito do BL-106 ou tadalafil sobre a agregação plaquetária. ... 82
Figura 22. Efeito do BL-106 sobre a agregação plaquetária ... 82
Figura 23. Efeito do BL-106 (A) ou Tadalafil (B) na viabilidade das plaquetas pelo ensaio de MTT. ... 83
Figura 24. Efeito do BL-106 (A) ou Tadalafil (B) sobre os níveis de GMPc em plaquetas ... 84
Figura 25. Efeito do BL-106 sobre os níveis de GMPc em plaquetas na presença de SNP. ... 85
Figura 26. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de GMPc nas plaquetas em diferentes tempos de incubação. ... 85
Figura 27. Efeito do BL-106 (A) ou Tadalafil (B) sobre os níveis de GMPc intracelular e extracelular em plaquetas ... 86
Figura 28. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de AMPc em plaquetas ... 87
Figura 29. Efeito do BL-106 sobre os níveis de AMPc em plaquetas na presença de SNP. ... 87
Figura 30. Efeito dos compostos sobre os níveis de tromboxano B2 em plaquetas ... 88
Figura 31. Efeito do BL-106 em diferentes concentrações sobre os níveis de tromboxano B2 em plaquetas ... 89
Figura 32. Inibição da fosfodiesterase 5 pelos compostos. ... 90
Figura 33. Inibição da fosfodiesterase 5 pelo composto BL-106. ... 90
Figura 34. Curvas concentração-resposta para BL-106 e Tadalafil em corpo cavernoso de (A) coelho e (B) humano e pré-contraído com fenilefrina ... 91
Figura 35. Curva concentração-resposta para BL-106 e Tadalafil em ureter humano e pré-contraído com cloreto de potássio (KCl, 80 mM). ... 92
Figura 36. Concentração sérica média calculada pela administração endovenosa em cães na dose de 3 mg/kg. ... 92
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 25 1.1 Nucleotídeos cíclicos ... 26 1.2 Sinalização do GMPc ... 27 1.3 Alvos moleculares do GMPc ... 29
1.3.1 Proteínas kinases dependentes de GMPc ... 30 1.3.2 Canais iônicos controlados por GMPc ... 31 1.3.3 Fosfodiesterases ... 32
1.4 Fosfodiesterase tipo 5 ... 33 1.5 Estrutura e função da PDE5 ... 34 1.6 Inibição da PDE5 ... 36 1.7 Inibidores de PDE5 ... 38 1.8 Docagem molecular ... 39 1.9 Simulações de dinâmica molecular ... 40 1.10 Candidatos a inibidores de PDE5 ... 44 2 JUSTIFICATIVA ... 46 3 OBJETIVOS ... 48 3.1 Objetivo geral ... 48 3.2 Objetivos específicos ... 48 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 49 4.1 Docagem molecular ... 49
4.1.1 Seleção da estrutura da PDE5 para docagem molecular ... 49 4.1.2 Preparo dos ligantes e docagem molecular ... 49
4.2 Simulação de dinâmica molecular ... 50 4.3 Ensaio celular ... 51
4.3.1 Cultivo celular ... 51 4.3.2 Ensaio da atividade metabólica celular por MTT ... 51 4.3.3 Dosagem de lactato desidrogenase ... 52 4.3.4 Extração de GMPc das células ... 53 4.3.5 Quantificação do nucleotídeos cíclico GMPc ... 53
4.3.6 Extração de RNA das células T84 ... 54 4.3.7 Quantificação de RNA das células T84 ... 54 4.3.8 Retrotranscripção do RNA... 55 4.3.9 Reações em cadeia da polimerase ... 55 4.3.10 PCR Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR) ... 56
4.4 Avaliações dos compostos na agregação de plaquetas humanas ... 57
4.4.1 Agregação plaquetária ... 58 4.4.2 Extração e quantificação de GMPc e AMPc... 58 4.4.3 Dosagem do tromboxano B2 ... 59 4.5 Atividade inibitória da fosfodiesterase 5 (PDE5) in vitro ... 59 4.6 Avaliações do composto BL-106 no relaxamento de músculo liso ... 59
4.6.1 Animais ... 60 4.6.2 Preparação de corpo cavernoso de coelho... 60 4.6.3 Preparação de corpo cavernoso e ureter humanos ... 60 4.6.4 Banho para corpo cavernoso e ureter humanos ... 60
4.7 Avaliação farmacocinética ... 61
4.7.1 Animais ... 61 4.7.2 Administração dos compostos ... 61 4.7.3 Coleta das amostras ... 62
4.8 Quantificação compostos ... 62
4.8.1 Curvas de calibração ... 62 4.8.2 Controles de Qualidade ... 62 4.8.3 Extração das amostras ... 63 4.8.4 Condições cromatográficas e espectrometria de massas ... 63 4.8.5 Obtenção dos parâmetros farmacocinéticos ... 64
4.9 Análise estatística ... 64 5 RESULTADOS ... 66 5.1 Docagem molecular ... 66 5.2 Simulação de dinâmica molecular ... 69 5.3 Ensaios in vitro com células ... 74
5.3.1 Viabilidade e toxicidade celular ... 74 5.3.2 Efeito dos compostos nos níveis de GMPc ... 76
5.3.3 Expressão da fosfodiesterase 5 nas células T84 ... 79
5.4 Efeito dos compostos na agregação plaquetária ... 80
5.4.1 Viabilidade das plaquetas ... 83 5.4.2 Efeito dos compostos nos níveis de GMPc nas plaquetas... 84 5.4.3 Efeito dos compostos nos níveis de AMPc nas plaquetas... 86 5.4.4 Efeito do composto BL-106 nas concentrações de tromboxano B2 ... 88 5.5 Inibição da PD5A ... 89 5.6 Relaxamento induzido pelo composto BL-106 no corpo cavernoso e ureter ... 91 5.7 Perfil farmacocinéticos dos compostos ... 92 6 DISCUSSÃO ... 95 7 CONCLUSÃO ... 104 7.1 Conclusões ... 104 7.2 Conclusão geral ... 105 ANEXO 1... 118 ANEXO 2... 119 ANEXO 3... 120 ANEXO 4... 122
1 INTRODUÇÃO
O monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) é um segundo mensageiro fundamental na via de sinalização intracelular o qual desempenha papéis críticos em muitos processos fisiológicos que vão desde o relaxamento do músculo liso,1 inibição da
adesão e agregação plaquetária,2 natriurese,3 motilidade do esperma,4 secreção de íons5
ao crescimento e apoptose celular.6-8
A formação do GMPc ocorre pela guanilato ciclase solúvel e/ou guanilato ciclase particulada que catalisam a conversão de trifosfato de guanosina (GTP) para GMPc. O GMPc formado atua diretamente através de três principais alvos celulares: as proteínas kinases dependentes de GMPc,9 canais controlados por nucleotídeos cíclicos e
fosfodiesterases reguladas por GMPc.10
As fosfodiesterases (PDEs) possuem pelo menos 11 famílias de genes diferentes em mamíferos e são enzimas funcionalmente distintas e altamente regulamentadas. A atividade das PDEs tem papel de destaque na sinalização celular, pois são responsáveis por promoverem a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos. A fosfodiesterase 5 (PDE5) modula as concentrações intracelulares de GMPc para monofosfato de guanosina.11
A regulação do metabolismo dos nucleotídeos cíclicos depende do perfil de expressão específica dos diferentes tipos de fosfodiesterase num dado tecido. A PDE5 é considerada uma proteína citosólica e está expressa em vários tecidos, incluindo próstata,12 bexiga,13 testículos,14 rim,15 células gastrointestinais,16 células de Purkinje do
cerebelo,17 corpo cavernoso18 e plaquetas.19
Dada a importância do GMPc nas vias de sinalização intracelular sua elevação permitiu identifica-lo como potencial alvo terapêutico. O aumento do GMPc celular ocorre através da inibição da PDE5. Esta modulação continua sendo uma interessante abordagem farmacológica. Atualmente, os inibidores de PDE5 como Sildenafil, Tadalafil e Vardenafil estão aprovados para tratamento da disfunção erétil,20 hipertensão
pulmonar,21,22 insuficiência cardíaca congestiva23 e sintomas do trato urinário inferior
Todos os inibidores de PDE5 têm semelhanças estruturais com GMPc e competem pela ligação no sítio catalítico da PDE5.24 A seletividade e afinidade dos
inibidores de PDE5 são determinadas pelo contato direto entre certos resíduos do domínio catalítico na porção carboxi-terminal. O domínio catalítico de interação é dividido em bolsão-Q, bolsão-H e região-L, estes subdomínios acomodam os resíduos que interagem diretamente com as moléculas inibidoras.25
De maneira geral, já se sabe que determinados resíduos de aminoácidos são importantes na estabilização e seletividade da ligação do substrato GMPc bem como dos inibidores vardenafil, sildenafil e tadalafil no domínio catalítico da PDE5. Por outro lado, tratando de novas moléculas compreender as possíveis interações que estes compostos podem fazer com a enzima permite extrair informações importantes para planejamento racional de fármacos. Adicionalmente, associar as técnicas de modelagem molecular no qual admite-se avaliar estas predições de interação proteína-ligante a ensaios in vitro, pode contribuir para explicar em parte os possíveis mecanismos de ação de novas moléculas.
1.1 Nucleotídeos cíclicos
Os nucleotídeos fosfato cíclico de adenosina (AMPc) e monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) são sintetizados pelas enzimas adenilato ciclase e guanilato ciclase, respectivamente. AMPc e GMPc são segundos mensageiros ubíquos que medeiam as respostas biológicas a uma grande variedade de estímulos extracelulares, incluindo hormônios, neurotransmissores, quimiocinas e citocinas.26 O aumento da concentração
destes nucleotídeos cíclicos resulta na ativação de proteína kinase dependente de AMPc (PKA) e proteína kinase proteína dependente de GMPc (PKG).9
Através das proteínas kinases dependentes de nucleotídeos cíclicos, é possível controlar vários processos fisiológicos, tais como resposta inflamatória,27 imunitária,28
cardíaca,23 contração do músculo liso,15 resposta visual,27 sinais neuroendócrinos,29
glicogenólise,30 agregação plaquetária,2 condutância dos canais de íons,27 a apoptose e
O papel importante do AMPc e do GMPc nas vias de sinalização intracelular permitiu identifica-los como potenciais alvos terapêuticos.30 Dada a sua relevância por
estarem ligados principalmente a família de enzimas fosfosdiesterases, que hidrolisam especificamente os nucleotídeos cíclicos, mediando o controle dos níveis de AMPc e GMPc e seu retorno ao estado basal.31
O AMPc foi descoberto na década de 1950 durante os estudo sobre a regulação hormonal do metabolismo dos mamíferos e foi considerado uma molécula sinalizadora.32 Os níveis celulares de AMPc são controlados através da sua síntese pela
adenilato ciclase (AC) que catalisa a ciclização intramolecular de ATP em AMPc liberando pirofosfato33 e sua degradação acontece através das PDEs.34
Por sua vez, o GMPc foi descoberto na urina de coelho em 1963,35 logo após foi
confirmada sua existência em 1967.36 As concentrações intracelulares de GMPc são
estritamente controladas pela ação da guanilato ciclase e das fosfodiesterases.37-40 O
GMPc produzido medeia o seu efeito em diferentes alvos celulares com as proteína kinases dependentes de GMPc, os canais catiônicos dependentes de GMPc e as fosfodiesterases (PDEs).27 A cascata de sinalização segue em mais detalhes na próxima
seção.
1.2 Sinalização do GMPc
A produção de GMPc ocorre por duas isoformas de guanilato ciclase: a guanilato ciclase solúvel (GCs) e guanilato ciclase particulada (GCp) através das principais vias de sinalização, pelo óxido nítrico e por peptídeos (Fig. 1) estes eventos acontecem em um largo espectro de células.1,41
O óxido nítrico ganhou maior destaque após sua identificação como fator de relaxamento dependente do endotélio (EDRF).42,43 Somente em 1987, o EDRF e o óxido
nítrico foram reconhecidos como sendo uma mesma molécula.44,45 A formação do óxido
nítrico advém da óxido nítrico sintase (NOS), a qual é expressa em três isoformas: óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e óxido nítrico
sintase endotelial (eNOS), através da ação catalítica da NOS que convertem o aminoácido precursor L-arginina em ON e L-citrulina.46
Figura 1. Cascata de sinalização do GMPc. O GMPc é produzido pelas guanilato ciclase: particulada (GCp)
e solúvel (GCs), a ativação das guanilato se dá pelos ligantes: peptídeos endógenos como a uroguanilina e através do óxido nítrico, respectivamente. O GMPc formado pode ativar as isoformas de PDEs, proteína kinase e canais iônicos controlados por GMPc.
O óxido nítrico após ser sintetizado vai atuar ativando a CGs na subunidade da porção N-terminal composta por quatro átomos de nitrogênio e um átomo de ferro, onde se liga formando um complexo heme ferroso nitrosil e promove a mudança conformacional capaz de ativar a GCs, gerando assim GMPc, que por sua vez ativa outros alvos moleculares.47
Outra via de ativação da GC envolve os peptídeos natriuréticos, que compreendem uma família de mediadores polipeptídicos. Os principais peptídeos natriuréticos são peptídeo natriurético atrial (ANP ou do tipo A), peptídeo natriurético cerebral (BNP ou do tipo B) e peptídeo natriurético do tipo C (CNP). Os peptídeos natriuréticos exercem os seus efeitos biológicos ligando-se aos receptores da guanilato
ciclase associadas a membranas (alternativamente conhecida como guanilato ciclase particulada).48
O nível de GMPc em toda a célula é determinado principalmente pelo balanço entre as atividades das GC e das PDEs que hidrolisam o GMPc. O GMPc pode ser carreado para o meio extracelular das células pela ação de alguns dos membros da família de proteínas transportadora de resistência a múltiplos fármacos dependente de ATP.49 No
entanto, a sua contribuição quantitativa na exportação do GMPc é pouca quando comparado com a ação das PDEs.50 O GMPc produzido tanto pela guanilato ciclase
solúvel quanto pela guanilato ciclase particulada tem suas funções celulares exercidas através da sua ligação em alvos moleculares.
1.3 Alvos moleculares do GMPc
Processos fisiológicos importantes são regulados pela via dependente de GMPc como por exemplo: o relaxamento do músculo liso vascular e gastrointestinal, a inibição da agregação plaquetária, o bloqueio da hipertrofia cardíaca, a proteção contra danos de isquemia e a melhoria das funções cognitivas.9 Estudos sugerem que estes efeitos (Fig.
2) são largamente mediados pela ativação de proteínas kinases dependente de GMPc,51,52 canais iônicos controlado por GMPc53 e pelas as PDEs.27
Figura 2. Alvos do GMPc após a cascata de sinalização. Os vários subtipos de guanilato ciclase e seus
vários ligantes capazes de desencadear diversos efeitos em alvos como as proteína kinases, isoformas de PDEs e canais iônicos controlados por GMPc que estão envolvidos no controle fisiológico em órgãos como coração, rim, nos vasos sanguíneos e tecido adiposo. Adaptado de Burnett.54
1.3.1 Proteínas kinases dependentes de GMPc
Dentre a família das proteínas kinases existe a PKG. Quando o GMPc se liga aos seus resíduos de serina ou treonina ocorrem vários eventos de fosforilação a partir de um doador, normalmente um nucleosídeo trifosfato (por exemplo, ATP),55 que conduz
ao relaxamento como, por exemplo, em células de músculo liso.
O papel da via do ON/GMPc/PKG é muito importante no relaxamento do músculo liso, o qual parece estar envolvido na regulação de três principais processos: na redução das concentrações intracelulares de cálcio livre, na regulação da sensibilização do cálcio e na regulação dos filamentos finos.56
Além da implicação do GMPc no músculo liso através da PKG, outro papel importante deste segundo mensageiro é nas plaquetas.57 Nas plaquetas o GMPc aciona a
ativação da PKG e esse processo leva à inibição da agregação plaquetária através da fosforilação de diferentes alvos.58 As plaquetas expressam principalmente a isoforma
PKG-Iβ localizada no citosol, que pode interagir com substratos diferentes através do seu domínio N-terminal.59 Adicionalmente, no trato gastrointestinal a isoforma PKG-II
atua na regulação da secreção de água e cloreto, em células intestinais.60
Convém ainda pontuar a sua participação na ossificação,61 no controle da
liberação de renina no rim,62 além da capacidade de promover a abertura de canais de
potássio ativados pelo cálcio, ocasionando o relaxamento das células do músculo liso.51
Durante os últimos anos uma variedade de funções das PKGs tem sido exploradas principalmente em órgãos periféricos e no SNC.63-65
1.3.2 Canais iônicos controlados por GMPc
Os canais iônicos controlados por GMPc são proteínas de membrana que desempenham funções relevantes na transdução sensorial em fotorreceptores e receptores olfativos.66-68 Estas proteínas podem ser encontradas em uma variedade de
células, incluindo células da retina e de gânglios,68 pinealócitos,69 músculo aórtico,70
células epiteliais e esperma.71
O papel fisiológico de maior destaque dos canais iônicos controlados por GMPc é na fototransdução. Neste mecanismo o GMPc atua na abertura do canal quando não há passagem de fóton. Entretanto, quando há luz esse mecanismo é controlado pela PDE6 através de sua hidrólise que permite a passagem de Na+ e K+ resultando no
fechamento e hiperpolarização do canal.72 De maneira geral, a síntese e a degradação do
GMPc no processo de fototransdução são controlados pela guanilato ciclase retiniana e PDE6.
1.3.3 Fosfodiesterases
As PDEs são categorizadas em 11 principais tipos, são enzimas funcionalmente distintas e altamente reguladas.26,73,74 Cada tipo de fosfodiesterase tem
diferentes especificidades de substrato com base em sua capacidade de discriminar entre GMPc e AMPc (Tabela 1).26
Tabela 1. Isoformas da família de fosfodiesterases, distribuição e seus principais substratos.
Isoforma Seletividade Distribuição primária em tecido PDE1 AMPc/GMPc Cérebro, pulmão, coração e células do músculo liso
PDE2 AMPc Córtex supra-renal, cérebro, coração, fígado, corpo cavernoso, olfato bulbo e plaquetas
PDE3 AMPc Linfócitos, pâncreas, fígado, pulmão, coração e tecido adiposo PDE4 AMPc Linfócitos, pulmão e cérebro.
PDE5 GMPc Corpo cavernoso, pulmão, plaquetas e células de músculo liso PDE6 GMPc Retina
PDE7 AMPc Células T e músculo esquelético
PDE8 AMPc Testículos, ovário, intestino delgado, cólon PDE9 GMPc Amplamente expresso no fígado e rim PDE10 AMPc/GMPc Cérebro
PDE11 AMPc/GMPc Testículos, cérebro, corpo cavernoso, músculo esquelético e próstata
Fonte: Adaptado de Essayan.28
As PDEs de mamífero compartilham uma organização estrutural comum, como o domínio catalítico conservado localizado perto da extremidade C-terminal e um domínio de regulação perto da extremidade N-terminal da proteína. Complementarmente, apresentam domínios com ligação de íons metálicos como Zn²+,
Mg²+ e Mn²+. 26
Algumas PDEs, tal como a PDE4 e PDE7 são altamente específicas para hidrólise de AMPc, entretanto, as PDE5, PDE6 e PDE9 são específicos para GMPc. Ao mesmo tempo que as PDE1, PDE2 e PDE3 hidrolisam ambos os nucleotídeos.28 As
Figura 3. Hidrólise de AMPc e GMPc em AMP e GMP pelas fosfodiesterases.31
Como vimos a regulação do metabolismo dos nucleotídeos cíclicos depende do perfil de expressão específica dos diferentes tipos de fosfodiesterase num dado tecido.30 As PDEs são reguladas por diversos mecanismos bioquímicos que incluem a
fosforilização/desfosforilização, a ligação de GMPc ou AMPc em regiões alostéricas, a ligação de Ca+2/calmodulina e várias interações proteína-proteína. PDEs participam de
diferentes funções fisiológicas no corpo e por inferência, também em diferentes condições patológicas.31,71 São reconhecidas como bons alvos de fármacos.30
As fosfodiesterases estão expressas em vários tipos de células, tornando-as um importante regulador da concentração de AMPc e GMPc.27 Ademais, a utilização de
inibidores podem prolongar a ação intracelular dos nucleotídeos cíclicos pelo aumento de suas taxas. Convém ainda destacar o papel da fosfodiesterase 5 como alvo na terapêutica da disfunção erétil.11
1.4 Fosfodiesterase tipo 5
A PDE5 foi originalmente identificada, isolada e caracterizada a partir de plaquetas.75 Mais tarde foi descrita no tecido pulmonar, nos estudos sobre proteína AMPc
kinase dependente de GMPc e outras proteínas de ligação ao GMPc, também foi identificada a PDE5A como uma das principais proteínas de ligação ao GMPc.76 Três
variantes da proteína PDE5A foram identificados. O que difere as três variantes (PDE5A1-A3) são seus N-terminais e exões únicos seguido por uma sequência comum de 823 aminoácidos.77,78
PDE5 é considerada uma proteína citosólica expressa no coração, placenta, músculo esquelético, pâncreas, cérebro, fígado, vários tecidos gastrointestinais e pulmão,16,31,78 também é expressa em plaquetas onde foi originalmente descoberta.75 É
claro está proeminentemente expressa no músculo liso vascular incluindo os tecidos do pênis.17
Na PDE5 a estabilização da ligação do GMPc acontece pela fosforilação dos resíduos serina e treonina. A principal responsável por esta fosforilação é a PKG. Contudo, quando os níveis de GMPc são elevados e GAF-A já está ocupada pelo GMPc, a PKA pode também fosforilar este local. Esta fosforilação então aumenta a atividade catalítica de PDE5, através da afinidade de ligação do GMPc para o domínio GAF.26 Postula-se que este mecanismo proporciona a célula um método para prolongar a
ativação da PDE5 em um ciclo de retroalimentação iniciada pela síntese de GMPc.79
1.5 Estrutura e função da PDE5
As estruturas cristalográficas demostraram que a PDE5 humana é uma proteína monomérica e tem uma massa molecular de aproximadamente 200 kDa composta pelo domínio C-terminal onde se encontra o bolsão catalítico com cerca de 364 aminoácidos.25,31 O domínio N-terminal que é caracterizado por apresentar os
domínios reguladores GAF-A e GAF-B que são as regiões de ligação alostérica para o substrato enzimático GMPc e local de fosforilação (na posição Ser92). Adicionalmente, PKA e PKG podem fosforilar a PDE5, o que resulta em um aumento da afinidade de ligação de GMPc no seu sítio de ligação a PDE5, promovendo um processo alostérico e aumento da atividade da PDE5.80
A ligação do GMPc aos locais alostéricos provoca também uma mudança conformacional na enzima aumentando a afinidade do domínio C-terminal da PDE5 para o substrato e para os inibidores, mesmo na ausência de fosforilação.80 O domínio
catalítico está localizado na extremidade C-terminal da proteína (resíduos de aminoácidos: 535-860) que contém a ligação de dois íons metálicos divalentes necessários para a função catalítica (Zn2+ e Mg2+), também presentes em outras PDEs.81
O domínio é composto por vários resíduos que são responsáveis pela seletividade com o substrato GMPc bem como aos inibidores. Na Figura 4 podemos ver a participação de alguns resíduos que são de suma importância na especificidade da ligação do GMPc no sítio catalítico.25
Figura 4. Diagrama em fita da estrutura cristalográfica da fosfodiesterase 5 (PDB:1XO7). Vista ampliada
do sítio catalítico em complexo com GMPc (vermelho), abaixo a molécula do GMPc com os principais resíduos responsáveis por sua estabilização no domínio catalítico. Adaptado de Sung et al. 2006.25
A base da purina é mantida fortemente no sítio ativo através de um "grampo hidrofóbico" formado pelos resíduos Gln817, Phe820, Val782 e Phe786 de cada lado da molécula e também é estabilizada por meio de interações hidrofóbicas adicionais que acontecem com os resíduos Phe786 e Ile768 da PDE5A. O grupo hidroxila do anel da ribose do GMPc está ligado com moléculas de água presentes no bolsão catalítico por ligações de hidrogênio. Adicionalmente, a ribose tem uma configuração que facilita a sua estabilização pelos resíduos Leu725, Leu765 e Phe786 na PDE5A.82
Apesar da semelhança estrutural com outras PDEs, a PDE5 exibe afinidade ~ 100 vezes maior para GMPc do que para AMPc.11 Outra semelhança importante é na
sequência de aminoácidos dos domínios catalíticos das PDE5 e PDE6, ambas altamente específicas para GMPc e com ~ 42% de similaridade no seu sítio catalítico, o que as difere é a taxa catalítica sete vezes mais fraca na PDE6 quando comparada com a PDE5.83
A caracterização estrutural da PDE5 permite novas abordagens na concepção de novos inibidores que podem auxiliar no tratamento de patologias associadas com o GMPc.
1.6 Inibição da PDE5
A inibição da PDE5 aumenta os níveis de GMPc após a liberação de óxido nítrico nos terminais nervosos parassimpático durante estimulação sexual, aumentando assim o relaxamento do músculo liso (Fig. 5). Consequentemente, conduz a diminuição do tônus vascular nas artérias e no pênis. Isto faz com que ocorra um aumento do fluxo sanguíneo e um alargamento do tecido cavernoso do pênis induzindo a ereção.38,84
A ereção peniana ocorre quando o sangue intumesce o corpo cavernoso, um efeito facilitado pelo relaxamento do músculo liso da região peniana. O tônus do músculo liso é regulado pelo Ca2+ intracelular, que ativa a Ca2+/calmodulina (CaM)
enzima dependente da kinase de cadeia leve da miosina (MLCK) o que leva à fosforilação e contração da fosfatase de cadeia leve da miosina (MLC).85
Figura 5. Mecanismo de ação dos inibidores de PDE5 na ereção peniana. Adaptado de Beavo e Brunton.85
A via do óxido nítrico (NO) leva ao relaxamento do músculo liso por estimulação da guanilato ciclase solúvel (GCs) que resulta na produção de GMPc e na ativação da proteína kinase dependente de GMPc. A PKG causa relaxamento do músculo liso por um mecanismo que inclui a redução da concentração citosólica de Ca2+ (pela
exportação de Ca2+ e/ou pela redução do inositol trifosfato (InsP3) mediada pela
mobilização do Ca2+ ao receptor).85 Ocorre também a desfosforilação de cadeias leves de
miosina pela ativação da fosfatase MLC e/ou pelo sequestro de MLCK numa forma fosforilada que não é prontamente ativada por Ca2+/CaM. Os inibidores de PDE5 atuam
especificamente inibindo a degradação do GMPc celular pela PDE5 e assim prolongam e aumentam os efeitos do NO/GMPc.85
Apesar da PDE5 ser a principal enzima de metabolização do GMPc no tecido cavernoso, a estimulação contribui de forma significativa para a vasodilatação.86,87 As
formas mais abundantes das PDEs no corpo cavernoso humano são a PDE5 (cerca de 70%) e PDE2 (30%).88,89 Há relatos de quantidade pouco expressiva de PDE3 e PDE4.90
Esta é também a razão para os efeitos mínimos sobre a pressão arterial sistêmica relatados em estudos clínicos com inibidores de PDE5.74
1.7 Inibidores de PDE5
Na medida em que as funções fisiológicas da PDE5 foram elucidadas, a descoberta e a especificidade de seus inibidores ganharam destaque no meio científico. Em meados de 1998 a Pfizer aprovou o Sildenafil para o tratamento da disfunção erétil (DE) atribuída a sua capacidade de inibição da PDE5,91 que levou a um grande avanço na
terapia farmacológica da DE e ao desenvolvimento de outros inibidores da PDE5, como Vardenafil, Tadalafil e Iodenafil.92,93
Baseados nos efeitos vaso-relaxantes do GMPc, os inibidores de PDE5 foram originalmente utilizados para o tratamento de hipertensão, hipertensão pulmonar, incluindo, doença cardíaca coronária e angina.81 Mais tarde, os inibidores de PDE5
surgiram como uma interessante indicação para DE.94 A expressão abundante de PDE5
no corpo cavernoso humano em relação aos outros tecidos é considerada a principal razão da eficácia clínica dos inibidores de PDE5 no tratamento da DE.18
O sildenafil foi o primeiro fármaco utilizado por via oral para o tratamento da DE que teve um sucesso comercial notável com vendas mundiais que ultrapassaram 1.5 milhões de dólares em 2001.94 São numerosos os estudos sobre a prevalência,
fisiopatologia e fatores de risco para DE,95 também sobre a sua farmacologia e eficácia
de tratamento.96
Todos os inibidores de PDE5 são análogos do GMPc, que inibem a degradação do nucleotídeo cíclico e por competirem com a ligação ao sítio catalítico.97 Ademais, o
nível de GMPc é regulado por um equilíbrio entre a taxa de sua síntese através da guanilato ciclase e a sua hidrólise para o fisiologicamente inativo GMP através da PDE5.55
Atualmente, formulações dos inibidores de PDE5 indicados para DE, isto é Sildenafil, Tadalafil e Vardenafil, foram aprovados pela FDA como parte da terapêutica
para hipertensão pulmonar.22 Apesar do amplo uso terapêutico ainda existem os fatores
relacionados aos efeitos colaterais dos inibidores de PDE5.84 Dentre os efeitos colaterais
mais descritos estão a dor de cabeça e a congestão nasal. Os efeitos podem ser interpretados como um resultado da dilatação dos vasos arteriais bem como, da inibição não seletiva da PDE1 que também hidroliza GMPc, localizada predominantemente nas células do músculo liso vascular.
A dispepsia é frequentemente relatada como um efeito colateral, o que pode ser explicado pela alta expressão de PDE5 no esôfago inferior, assim como distúrbios visuais. Os efeitos oftalmológicos estão provavelmente relacionados com a inibição da atividade da PDE6 presente na retina, que é responsável pelo controle da transdução de sinal no olho.46,86
Uma alternativa para diminuição dos efeitos colaterais é a maior seletividade dos inibidores de PDE5. Devido aos avanços nos estudos in silico, agora é possível resolver algumas problemáticas no desenvolvimento de novas moléculas através da concepção de fármacos baseados na estrutura do alvo e na modelagem computacional de potenciais candidatos a fármacos. De forma paralela, é possível utilizar a complementação experimental para sanar a hipótese de como ocorre a sinalização.
1.8 Docagem molecular
A docagem molecular é baseada em estruturas que são capazes de se ligarem a um alvo molecular.98 O objetivo desta técnica computacional está relacionada a
identificação de novas entidades químicas, através de abordagens por triagem virtual que une o algoritmo da busca conformacional e uma função de pontuação. O algoritmo de busca é capaz de explorar todas as possíveis orientações e conformações de uma pequena molécula dentro do local de ligação referente ao alvo.99
A docagem molecular explora o espaço conformacional de ligantes flexíveis, enquanto a estrutura proteica permanece fixa (dependendo do método empregado), nesta exploração cada conformação que o ligante assume quando está ligado a proteína é chamada de hit. A cada pose é dado um valor referente à função de pontuação. A
função de pontuação representa um método matemático aproximado usado para prever e avaliar as forças de interações entre o ligante e a proteína alvo.100 Durante a triagem
virtual, é bastante comum usar a função de pontuação para selecionar os melhores candidatos para ensaios biológicos e bioquímicos.100
A escolha da melhor pontuação representa um estágio inicial para desenvolvimento de novos fármacos onde os melhores candidatos sofrem uma otimização racional para aperfeiçoar as suas características farmacodinâmicas, estabilidade, afinidade e seletividade em relação ao alvo biológico, bem como sua eficácia nos ensaios celulares.101
De fato, o conhecimento da relação entre a estrutura química de uma molécula e a sua atividade biológica é importante para compreender que tipo de substituições químicas se espera para melhorar a atividade dos compostos. De forma semelhante, a simulação de dinâmica molecular pode ser utilizada para estimar as interações moleculares entre o ligante e macromoléculas biológicas.102
Em particular os cálculos de dinâmica molecular são capazes de estudar alvos complexos e seus possíveis ligantes, com objetivo de racionalizar os estudos experimentais e melhorar os resultados da triagem virtual e docagem.103
1.9 Simulações de dinâmica molecular
Simulações de Dinâmica Molecular (MD do inglês Molecular Dynamics) são utilizadas para estudar como um dado sistema molecular evolui com o tempo, considerando as interações entre os átomos do ponto de vista da Mecânica Clássica. Para realizar os cálculos de MD é preciso conhecer as coordenadas iniciais dos átomos, seus potenciais de interação (intra e intermoleculares) e as equações de movimento clássicas.104
Existem disponíveis diversos potenciais clássicos para a realização das simulações de MD, cada um com uma composição própria sobre as equações que fornecem o potencial resultante. Desta forma, diferentes campos de força, que é a
combinação da forma funcional com o conjunto dos arquivos de parâmetros de potenciais e topologia, podem ser utilizados para realizar as simulações MD, como CHARMM,105,106 OPLS,107 GROMOS108 e AMBER.109 Estes campos de força possuem
funções de energia potencial similares à da Equação 1.1.
∑ ∑ ∑ [ ] ∑ [( ) ( ) ] ∑
Nesta equação, é uma soma dos potenciais intra e intermoleculares, como: ligações covalentes (1º termo); ângulos, formados por três átomos adjacentes e ligados covalentemente (2º termo); torções diedrais, para um conjunto de quatro átomos (3º termo); potenciais de Lennard-Jones, para pares de átomos que interagem por forças de Van der Walls (4º termo); e potencial eletrostático, que descreve as interações entre átomos carregados (5º termo).
Na Equação 1.1 os seguintes parâmetros são definidos: , , , , , , ,
, , . de acordo com cada potencial . Tais parâmetros podem ser obtidos por
métodos experimentais ou cálculos quânticos e faz parte do processo de parametrização molecular.
Outras contribuições podem ser adicionadas ao cálculo de através de termos como os potenciais de Urey-Bradley e ângulos impróprios. Portanto, é
composto pelos potenciais que descrevem as interações intramoleculares (ligações, ângulos e diedros, além de Urey-Bradley e impróprios) e intermoleculares (Lennard-Jones e Coulomb), mostradas na Figura 6.
Figura 6. Desenho representativo dos parâmetros geométricos que definem os potenciais de interações
intra e intermoleculares dos campos de força utilizados em simulações de Dinâmica Molecular.
As coordenadas iniciais dos átomos para proteínas podem ser obtidas pelo banco de dados PDB (Protein Data Bank),110 por exemplo. Os demais componentes como
solventes e contra-íons podem ser adicionados ao sistema para representar a condição biológica do estudo. O início da simulação se dá pela definição das velocidades iniciais dos átomos que compõem o sistema, estas velocidades são atribuídas de acordo com a distribuição de probabilidades de Maxwell-Boltzmann, com a energia cinética do sistema correspondendo à temperatura termodinâmica. Cada componente da velocidade segue a distribuição:
( )
Onde: é a probabilidade do átomo de massa na temperatura T ter velocidade .
Com os parâmetros do campo de força, posições e velocidades iniciais definidos, as trajetórias podem ser obtidas por integração numérica das equações diferenciais de movimento. Ou seja, deve se determinar as posições e velocidades em um passo seguinte , isto é feito através do método de diferenças finitas, com as posições seguintes sendo calculadas por expansões de Taylor. Os programas de simulação de MD usam geralmente algoritmos de Verlet,111 ou variações deste como Velocity-Verlet, implementado no NAMD.112
De modo geral, estes algoritmos calculam as interações entre os átomos considerando suas posições e as forças que atuam em cada átomo. A força que atua em cada átomo é calculada pelo gradiente do potencial . Desta forma, usando a segunda Lei de Newton, a aceleração de cada átomo também é calculada: , onde é a massa do átomo . Depois do cálculo da aceleração, a
velocidade de cada átomo no instante deve ser calculada: . Obtendo-se as velocidades em , as novas posições podem ser calculadas de acordo com: .
Com as novas posições definidas, o programa recalcula os potenciais de interação, seguido do calculo de força, aceleração, velocidade e novas posições. Diversos ciclos correspondem a trajetória da simulação e descrevem a evolução temporal do sistema molecular.
A simulação de MD é uma técnica ideal para buscar informações a respeito das interações entre macromoléculas alvo e novas moléculas. Sabemos por estudos prévios que o domínio catalítico da PDE5 apresenta aminoácidos essenciais para a ligação do GMPc assim como para os inibidores.25 Por outro lado, o trabalho apresenta
novas moléculas com características distintas. Entretanto, estas moléculas apresentam algumas similaridades com o composto Tadalafil.
Considerando que novos compostos possuem uma maior mobilidade conformacional devido as suas estruturas, portanto, maior a probabilidade de interações
com os resíduos do bolsão catalítico da PDE5, a dinâmica de interação com os resíduos de aminoácidos devem ocorrer de forma alternativa ao do Tadalafil. Entender como acontece à interação dos novos compostos no bolsão catalítico da PDE5 pode ajudar a desvendar o mecanismo que envolve a estabilização destas novas moléculas.
1.10 Candidatos a inibidores de PDE5
Novas moléculas derivadas da estrutura principal 6,7-dihidro-3H-oxazolo[3,4-a] pirazina-5,8-diona foram sintetizadas pela Biolab indústria farmacêutica. Como representado na Figura 7, podemos ver a estrutura química destes compostos e a inserção de grupamentos em R1 e R2. A maioria dos novos compostos possuem uma
porção com grupamento metilenodioxifenil conhecido como um grupo químico importante na eficácia dos inibidores de PDE5.24
Figura 7. Estrutura molecular dos novos candidatos a inibidores de fosfodiesterase 5, em destaque as
As modificações químicas nos novos compostos ocorrem em R1 conforme
ilustrado na Figura 7, onde no composto BL-106 há inserção do grupamento metilenodioxifenil, em BL-106.1 há adição do grupamento metoxibenzeno, BL-106.2 há adição do anel benzeno e no composto BL-106.3 ocorre a troca em R1 pelo grupamento
clorobenzeno. Enquanto isso, nos compostos BL-220, BL-230 e BL-236 ocorre a mudança em R2 no grupamento metil ausente em BL-220, no BL-230 a inserção do
grupamento etanol e no composto BL-236 há a inserção de 2-metiletanol.
Embora hajam disponíveis no mercado inibidores de PDE5, o sucesso destas terapias ainda é muito limitado. Assim, novos compostos podem sugerir novas abordagens, uma vez que os inibidores de PDE5 são utilizados na clínica para disfunção erétil, hipertensão pulmonar e sintomas do trato urinário inferior secundários à hiperplasia prostática benigna. Complementarmente estudos mostram a relação dos inibidores de PDE5 na potencialização da ação de fármacos antitumorais.113,114
De modo geral, o desenvolvimento de novas moléculas candidatas a inibidores de PDE5 ainda está em fase inicial dada a complexidade do desenvolvimento de um medicamento, por certo já passamos por várias etapas importantes. Convém fazer uma referência especial às técnicas in silico em combinação com as abordagens bioquímicas através de ensaios in vitro que permitiram percorrer uma grande linha deste longo processo.
2 JUSTIFICATIVA
Devido ao papel biológico importante dos nucleotídeos cíclicos, enzimas como PDE5 são consideradas um potencial alvo para desenvolvimento de fármacos. Recentemente, os inibidores da PDE5 foram aprovados para uso clínico no tratamento de sintomas do trato urinário inferior secundários a hiperplasia prostática benigna e hipertensão pulmonar. A priori estes fármacos eram usados apenas para disfunção erétil. No entanto, o sucesso da terapia com os inibidores de PDE5 atualmente disponíveis no mercado ainda é limitado. Ademais, nenhum novo inibidor de PDE5 com grande eficiência e que tenha sido incluído como uma nova opção terapêutica na clínica foi reportado nos últimos anos.
A partir deste panorama, uma série de moléculas orgânicas com alta diversidade estrutural foi sintetizada pela empresa farmacêutica Biolab. Uma característica importante dos novos compostos aqui apresentados é um esqueleto químico distinto dos outras moléculas disponíveis no mercado como o Tadaladil e Sildenafil. Hipoteticamente, os novos inibidores de PDE5 poderiam alcançar uma seletividade maior, possivelmente por apresentarem uma mobilidade conformacional que facilite a sua interação com o sítio catalítico da enzima.
Estudos experimentais in vitro demonstraram que o composto BL-106 foi capaz de relaxar o corpo cavernoso humano e este relaxamento foi dependente da concentração, reduzindo a contração induzida pela noradrenalina.115 No corpo
cavernoso a enzima PDE5 está intimamente ligada à hidrólise do GMPc, a sua inibição ocasiona o aumento do GMPc, proporcionando assim o relaxamento da musculatura lisa e favorecendo a ereção peniana. De maneira concordante, foi demonstrado os efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 no relaxamento do corpo cavernoso de coelho após contração induzida pela fenilefrina.116
Nesse sentido, consideramos relevante conduzir novos achados para estas moléculas promissoras, que podem representar novas possibilidades para criação de inibidores mais específicos (tanto de PDE5 como outras PDEs). Ainda no que tange à
metodologia, os estudos in silico trazem uma grande novidade, uma vez que as moléculas estudadas aqui são inéditas.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar in silico , in vitro e in vivo as interações e os efeitos dos compostos candidatos a inibidores de fosfodiesterase 5.
3.2 Objetivos específicos
• Investigar as interações moleculares dos compostos com a PDE5, através de docagem molecular e simulações de dinâmica molecular.
• Mapear quais os resíduos que podem interagir com os compostos.
• Investigar os efeitos dos compostos no acúmulo do GMPc em células de carcinoma de cólon (T84).
• Investigar os efeitos dos compostos na agregação de plaquetas humana in vitro, avaliar as alterações nos níveis de GMPc, AMPc e TBX.
• Avaliar a capacidade inibitória dos compostos sobre a PDE5.
• Analisar a farmacocinética dos compostos administrado por via endovenosa em cães, utilizando técnica HPLC-MS/MS.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Docagem molecular
4.1.1 Seleção da estrutura da PDE5 para docagem molecular
Primeiramente foram feitas buscas no banco de dados de proteínas (PDB),110
a procura da estrutura cristalográfica com as coordenadas tridimensionais que apresentavam resolução de até 3Å. Fez-se a escolha da proteína PDE5A humana código PDB: 1XOZ e em seguida, foi analisado o arquivo contendo as coordenadas da PDE5 (.pdb) para a presença de ligantes, cofatores e outras informações relevantes.
4.1.2 Preparo dos ligantes e docagem molecular
As estruturas tridimensionais das moléculas estudadas neste trabalho BL-106, BL-106.1, BL-106.2, BL-106.3, BL-220, BL-230, BL-236 e Tadalafil foram construídas e minimizadas com o programa ChemBioDraw Ultra 12.0. A otimização da geometria dos ligantes foi realizada utilizando o campo de força MMFF94. Já com a estrutura proteica da PDE5A e a estrutura dos compostos preparadas, utilizamos o programa DockThor para docagem.
Na plataforma DockThor o arquivo da proteína e posteriormente o arquivo do ligantes foram carregados e os íons de Zn2+ e Mg2+ foram adicionados como cofatores.
O centro de coordenadas da grade para a docagem foi definido pela posição do bolsão catalítico da PDE5, assim como suas dimensões. Para o experimento foi utilizado o centro da grade X: 46.96 Y: 33.83 Z: 11.77, com 12Å em cada eixo e em seguida, foi realizada a docagem. Os resultados foram visualizados usando o programa VMD 1.9.2.
4.2 Simulação de dinâmica molecular
As simulações foram feitas a partir da estrutura cristalográfica da PDE5A (a mesma estrutura utilizada nos ensaios de docagem), obtidos a partir do Protein Data
Bank (PDB: 1XOZ), com uma resolução de 1.37Å.25 Os sistemas a serem simulados foram
construídos para estudar as diferenças conformacionais entre PDE5 complexados com Tadalafil ou compostos (106, 106.1, 106.2, 106.3, 220, 230 e BL-236) (Tabela 2).
Tabela 2. Descrição dos sistemas considerados em estudos de dinâmica molecular.
Sistema Notação Moléculas de água Compostos Largura da caixa (Å)
1 BL-106 27000 BL-106 94.70 2 BL-106.1 27000 BL-106.1 94.55 3 BL-106.2 27000 BL-106.2 94.62 4 BL-106.3 27000 BL-106.3 94.61 5 BL-220 27000 BL-220 94.60 6 BL-230 27000 BL-230 94.61 7 BL-236 27000 BL-236 94.70 8 TAD 27000 Tadalafil 94.65
Simulações realizadas em duplicatas independentes.
Os compostos BLs bem como o composto Tadalafil foram alocados de forma idêntica no sítio catalítico, tal como determinado pela estrutura cristalográfica. As configurações iniciais foram construídas com Packmol,117 contendo a PDE5 (sem
complexo, complexo com Tadalafil ou com os compostos), com água (27000 moléculas), com íons Na+ e Cl- para neutralizar a carga da proteína a concentrações de
aproximadamente 0.1 molL-1. Os sistemas foram simulados da seguinte maneira: com
todos os átomos da proteína fixados, a água e o inibidor complexado foram relaxados, realizando 1000 passos de minimização pelo método de Gradiente-Conjugado (CG) seguido por 200 os de simulação MD; mantendo somente os átomos de Cα da proteína
fixados, foram realizadas 500 passos de minimização de CG, seguidas de 200 ps de simulação MD. Todos os átomos de PDE5 foram liberados e foram realizadas 2.2 ns de simulação MD. As coordenadas e velocidades finais foram utilizadas para iniciar cada etapa de produção. Duas simulações de 80 ns foram realizadas para cada sistema em
ensemble NPT a 1 atm e 310.15 K, totalizando 1280 ns. A pressão foi controlada em
banho de Nosé-Hoover Langevin com um coeficiente de amortecimento de 10 ps-1. O
campo de força CHARM foi utilizado para proteína PDE5, íons, água e para os inibidores.118 Os parâmetros para Tadalafil e novos inibidores foram obtidos a partir do
programa CGenFF47 e o modelo TIP3 foi utilizado para água.107 As simulações foram
realizados com o programa NAMD112 e a visualização foi feita com o VMD.119 As
distâncias entre os átomos foram calculadas utilizando o programa MDAnalysis.
4.3 Ensaio celular
4.3.1 Cultivo celular
A linhagem de cólon carcinoma humano (T84) foi doada pelo Prof. Dr. Alexander Kots da George Washington University, Estados Unidos. A linhagem T84 foi cultivada em garrafas de 75 cm2 contendo meio DMEM-F12 suplementados com 10% de
soro fetal bovino e com antibióticos penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL). As células foram mantidas em estufa a 37 °C sob atmosfera úmida contendo 5% de CO2, com pH do meio de 7.4. Posteriormente, as células T84 foram cultivadas em
placas de 12 poços até atingirem confluência para realização dos ensaios. Semanalmente estas células foram propagadas para a realização dos experimentos e congelamento.
4.3.2 Ensaio da atividade metabólica celular por MTT
A mensuração da atividade metabólica constitui a base de numerosos ensaios
in vitro para determinar a resposta de uma população de células a fatores externos como
