Avaliações do composto BL-106 no relaxamento de músculo liso

4.6.1 Animais

Foram utilizados coelhos machos New Zealand adultos (2-3 kg, n=4) provenientes da granja Anilab (Paulínia, SP). Ração e água foram fornecidas a vontade. Todos os protocolos realizados tiveram a aprovação prévia da Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (protocolo CEUA-UNICAMP 2383-1).

4.6.2 Preparação de corpo cavernoso de coelho

Os animais foram anestesiados com isoflurano (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e exsanguinados por secção da artéria carótida. O pênis do coelho foi retirado na região de inserção da crura e imediatamente colocado em solução Krebs (pH 7.4) composição (mM): NaCl (118); NaHCO3 (25); glucose (5.6); KCl 4.7; KH2PO4 (1.2);

MgSO4.7H2O (1.17) e CaCl2.2H2O (2.5). Em seguida, o tecido cavernoso foi dissecado,

após a remoção dos tecidos conectivos e da túnica albugínea.

4.6.3 Preparação de corpo cavernoso e ureter humanos

Foram utilizados corpos cavernosos e ureteres de três pacientes (23-34 anos de idade, n=3-4) que haviam sido submetidos a múltiplas doações de órgãos após o consentimento informado da pessoa apropriada. Todos os protocolos realizados tiveram a aprovação do Comitê de Ética da Universidade Estadual de Campinas (protocolo de estudo nº 490/2009).

4.6.4 Banho para corpo cavernoso e ureter humanos

Os tecidos foram montados em câmaras de incubação de tecido (10 mL) preenchidas com solução Krebs; continuamente aeradas com mistura de O2:CO2

(95:5%), mantidas à temperatura de 37 °C. Mudanças na força isométrica foram registadas utilizando um sistema PowerLab 4/30 de aquisição de dados (Chart software, versão 7.0; ADInstruments, Colorado Springs, CO).

Curvas de concentração-resposta foram obtidas contraindo com noradrenalina (NOR, 10 μM) no caso do corpo cavernoso ou cloreto de potássio (KCl, 80 mM) no caso de ureter através de doses cumulativas (0.0003 - 30 µM). Uma curva de concentração-resposta do BL-106 foi construída em cada tira. As tiras de controle (tratadas com DMSO 40 mM) foram também executadas em paralelo a cada experimento.

4.7 Avaliação farmacocinética

4.7.1 Animais

Foram utilizados cães adultos da raça Beagle pesando 10 – 15 Kg (n=3-5). Os animais foram alocados no canil do Hospital Veterinário da Universidade Camilo Castelo Branco na cidade de Fernandópolis – SP (protocolo CEUA-UNICAMP 3340-1). Os animais foram avaliados clinicamente pelo médico-veterinário responsável e apresentaram parâmetros cardiorrespiratórios e de temperatura dentro da normalidade. Em todos os protocolos, no dia anterior ao estudo, os cães ficaram em jejum não hídrico por 8 h antes do início das coletas. Do mesmo modo, após 6 h de aplicação do composto, os animais eram reposicionados nas respectivas baias onde se alimentaram e beberam água normalmente.

4.7.2 Administração dos compostos

Em primeiro lugar foi colocado o colar “Elizabetano” no cão. Em seguida, foi realizada tricotomia na porção radial dos membros anteriores. Após esse procedimento foi feita a assepsia no local com auxílio de gaze umedecida em álcool 70%; seguidamente foi estancado o acesso venoso com garrote pediátrico na porção superior do úmero. Foi introduzido o cateter 22G em cada membro para administração pela via endovenosa. A introdução do cateter foi feita de modo que este acesse a veia cefálica e, em seguida, foi fixado no local com esparadrapo contornando a pata do animal.

4.7.3 Coleta das amostras

As coletas das amostras de sangue foram realizadas através de cateter intravenoso 22G introduzido na veia cefálica de uma ou das duas extremidades anteriores, foram coletados 1.5 mL de sangue em cada tempo de coleta. Os tempos de coleta foram: pré dose (0:00); 0:02; 0:05; 0:10; 0:15; 0:20 e 0:30 min; 1:00; 2:00; 3:00; 4:00; 6:00; 8:00; 12:00 e 24:00 h (15 coletas no total). As amostras de sangue foram centrifugadas a 2500 × g por 10 min a 4 °C e o plasma foi coletado e armazenado a −20 °C até os ensaios de quantificação.

4.8 Quantificação compostos

4.8.1 Curvas de calibração

As soluções padrão estoque dos analitos foram preparadas em acetonitrila em várias concentrações. As curvas de calibração foram preparadas pela adição da solução padrão no plasma de cão livre de fármacos, rendendo as concentrações de: 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 e 3000 ng/mL para os compostos. As concentrações do padrão interno (Tadalafil - d3) foram mantidas sempre na concentração 5 ng/mL.

4.8.2 Controles de Qualidade

O controle de qualidade é realizado para antecipar os limites dos valores analíticos. Foram realizados diariamente durante os ensaios as amostras de controle de qualidade (baixa, média e alta concentração), com a corrida de um novo controle de qualidade a cada 10 amostras desconhecidas. Amostras foram preparadas em plasma de cão livre de fármacos para os controles: CQB – 60 ng/mL, CQM1 – 400 ng/mL, CQM2 – 1200 ng/mL e CQA – 3000 ng/mL.

4.8.3 Extração das amostras

A extração dos compostos foi realizada com 100 µL de amostra de plasma adicionado em tubos de ensaio seguida da adição de 20 µL de solução de padrão interno (5 ng/mL Tadalafil - d3) e 20 µL de hidróxido de amônia 50%, as amostras foram

homogeneizadas por 10 s. Uma extração líquido - líquido foi realizada adicionando 2.5 mL de eter/hexano (60:40, v/v), e homogeneizadas por 40 segundos. As amostras foram depois centrifugadas à 2000 × g por 5 min, congeladas a -80 °C durante 10 min e após a separação das fases, a fase orgânica foi coletada e evaporada até a secagem por um fluxo de nitrogênio a temperatura de 45 °C. O resíduo foi dissolvido com 120 µL de acetonitrila - água (10:90 v/v) - hidróxido de amônia (2.5 mM), e agitado por 10 segundos.

Após a extração, as soluções foram transferidas para uma placa de 96 poços e acondicionadas para posterior análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS). Foram injetados 10 µL de amostra. Os procedimentos apresentados também foram aplicados não só na avaliação das amostras, mas também para a extração da curva padrão e das amostras do controle de qualidade.

4.8.4 Condições cromatográficas e espectrometria de massas

Os compostos BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 foram quantificados em plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS/MS), usando Tadalafil - d3 como padrão interno. A detecção das massas foi realizada através

do monitoramento dos íons resultantes no modo MRM. O sistema LC-MS/MS consistiu de um cromatógrafo líquido LC-10AVP (Shimadzu - Japão) acoplado a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo (Quattro Micro; Waters Micromass, Milford, MA, USA) equipado com uma fonte de ionização por "electrospray". A integração foi realizada usando o software MassLynx 4.0 SP4 (Waters Micromass).

A fase estacionária consistiu de uma coluna kinetex 100A XB-C18 2,6 µm (75 mm × 4.6 mm i.d., Phenomenex®_{, CA, EUA). As análises dos compostos foram realizadas}

(0.1%) + acetato de amônia (5 mM), sendo os íons detectados em modo positivo. Os compostos foram eluídos em velocidade de fluxo de 0.350 mL/min. O tempo de corrida foi de 5 min. As transições para os íons precursores protonados e para os íons de produto selecionados do composto BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 foram m/z 404/281.8, 389.50/250, 434/250 e 448.2/250.1, respectivamente.

4.8.5 Obtenção dos parâmetros farmacocinéticos

Os logaritmos das concentrações plasmáticas dos compostos foram traçados graficamente como uma função de tempo. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos foram obtidos: a área sob a curva de concentração plasmática versus tempo, do tempo zero ao tempo 24 h, (ASC0-24h) foi calculada através do método da regra trapezoidal. A

extrapolação desta área até o tempo infinito (ASC0-∞) foi realizada pela adição do valor

Cúltimo/Ke à ASC0-24h, onde Cúltimo é a ultima concentração do fármaco determinada

experimentalmente e Ke é a constante de eliminação da fase terminal.

A concentração plasmática inicial (C0) foi obtida pela extrapolação ao tempo

zero desde a fase terminal da eliminação. A constante de eliminação (Ke) foi estimada

pela regressão linear e o meia-vida de eliminação (T½) foi obtida usando a equação T½= 0.693.Ke-1. O volume de distribuição (Vd) foi calculado através da razão da dose

administrada pela concentração plasmática do fármaco ao tempo zero (C0). O software

usado foi o WinNonlin Professional Network - versão 3.2 e GraphPad Prism versão 6.0.