SUMÁRIO
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.3 Ensaio celular
4.3.1 Cultivo celular
A linhagem de cólon carcinoma humano (T84) foi doada pelo Prof. Dr. Alexander Kots da George Washington University, Estados Unidos. A linhagem T84 foi cultivada em garrafas de 75 cm2 contendo meio DMEM-F12 suplementados com 10% de
soro fetal bovino e com antibióticos penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL). As células foram mantidas em estufa a 37 °C sob atmosfera úmida contendo 5% de CO2, com pH do meio de 7.4. Posteriormente, as células T84 foram cultivadas em
placas de 12 poços até atingirem confluência para realização dos ensaios. Semanalmente estas células foram propagadas para a realização dos experimentos e congelamento.
4.3.2 Ensaio da atividade metabólica celular por MTT
A mensuração da atividade metabólica constitui a base de numerosos ensaios
in vitro para determinar a resposta de uma população de células a fatores externos como
tetrazólio. O tetrazólio amarelo ou Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio conhecido como MTT é reduzido por células metabolicamente ativas, em parte pela ação das enzimas desidrogenase, para gerar equivalentes redutores como NADH e NADPH, levando a formação do formazano roxo intracelular que pode ser solubilizado e quantificado por meios espectrofotométricos.120 Desta forma utilizamos
esta metodologia para avaliar a viabilidade das células T84 e das plaquetas.
Protocolo nas células T84: Em placa de 96 poços foram incubadas células T84 em estufa úmida com 5% de CO2 a 37 °C por 72 h até atingirem confluência de 80-100%.
Foram incubados os compostos na maior concentração testada nas células (50 µM) durante os tempos de 1, 24 e 48 h. Decorrido o tempo de incubação, o meio foi substituído por meio sem soro e acrescentado 10 µL do volume de MTT. Incubando por 1-3 h em estufa a 37 °C (até ficar roxo). Este meio foi retirado e substituído pela solução álcool isopropílico/HCl 0.04 M. A densidade óptica foi medida através do leitor de microplaca (SpectraMax-M2e – software SPECTRAmax M2e ROM versão 2.1 Molecular Devices, CA, EUA) em 570 nm.
Protocolo nas plaquetas: Em placa de 96 poços contento a suspensão plaquetária (1.5 x 108/mL, 50 µL; obtidas conforme descrito na seção 4.4.1) o composto
BL-106 ou Tadalafil (0.01-100 µM) foi incubado por 5 min, 15 min, 30 min ou 60 min, posteriormente foi adicionado em cada poço 10 µL de solução de Krebs. Finalmente, 10 µL de MTT (5 mg/mL) foram adicionados em cada poço e após incubação por 3 h a 37 °C, a reação foi interrompida com 100 µL de SDS 10% em HCl (0.01 M). A placa foi lida em leitor de microplacas (Spectramax 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) no comprimento de onda de 540 nm.
4.3.3 Dosagem de lactato desidrogenase
A liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH) uma enzima presente no meio intracelular mais especificamente no citosol, é liberada para o meio extracelular quando ocorre a apoptose celular. Desta forma, utilizamos o sobrenadante da cultura de células T84 para mensurar a LDH colorimetricamente, utilizando o kit de detecção de
citotoxicidade LDH (Cayman Chemical, MI, USA). As células T84 foram cultivadas numa placa de 96 poços a uma densidade óptima previamente determinada em 200 µL de meio de cultura. O Triton X-100 (10%; 20 µL) foi adicionado aos poços contendo células para obtenção da liberação máxima de LDH (controle positivo) e o tampão de ensaio (20 µL) foi adicionado para se obter a liberação espontânea (controle negativo).
A maior concentração dos compostos (50 µM) usada nos testes com células T84 foi testada ou veículo foram adicionados (20 µL) e a placa foi incubada em CO2 a 37
°C por 1, 24 e 48 h. Em seguida, as placas foram centrifugadas a 400 x g durante 5 min e 100 µL de sobrenadante foi transferido para uma nova placa de 96 poços para a realização da reação, onde 100 µL de solução de reação foi adicionada a cada poço. As placas foram incubadas com agitação suave num agitador orbital durante 30 min à temperatura ambiente e a absorbância foi lida a 490 nm.
4.3.4 Extração de GMPc das células
As células T84 foram cultivadas em placas de 12 poços. Cada poço foi lavado por três vezes com DPBS (tampão fosfato salino de Dulbecco). As células foram tratadas com o veículo (DPBS + 0.1% de DMSO) ou compostos teste (BL-106, 106.1, BL-106.2, BL- 106.3, BL-220, BL-230 e BL-236) ou Tadalafil durante 10 min, em seguida, o acúmulo de nucleotídeo cíclico foi estimulado com ativador da guanilato particulada, a Enterotoxina termoestável tipo A (STa) por 10 min. O meio foi aspirado e o nucleotídeo foi extraído com HCl 0.1 M (0.3 mL por poço) por 20 min sob agitação. As amostras foram coletadas, centrifugadas e o sobrenadante, contendo os nucleotídeos cíclicos, foi retirado para quantificação.121 Após centrifugação e separação do sobrenadante as proteínas foram
extraídas com NaOH 0.1 M e dosadas de acordo ao método de Bradford.122
4.3.5 Quantificação do nucleotídeos cíclico GMPc
Os níveis de GMPc foram quantificados utilizando-se o kit da Cayman (Cayman Chemical, MI, USA) seguindo as instruções do fabricante. Após a diluição e
acetilação cada amostra foi quantificada em duplicata e os resultados expressos em pmol de GMPc/mL/mg de proteína.
4.3.6 Extração de RNA das células T84
O RNA total foi extraído a partir de células T84 após a incubação por 10 min com o composto BL-106, seguido de estimulação ou não com a STa. As células foram rompidas utilizando 0.5 mL do reagente TRIzol. O RNA foi então extraído com 20% de clorofórmio, incubando por 3 min. Em seguida o mesmo foi centrifugado a 12000 rpm, a 4 °C, por 15 min. Nesta etapa foi obtida a solução bifásica, uma orgânica e outra aquosa, a qual contém o RNA.
Posteriormente, a fase aquosa foi transferida para outro tubo de ensaio com tampa seguida da adição de isopropanol a 100%. O material foi agitado por 10 min em temperatura ambiente e realizada uma nova centrifugação a 12000 rpm, a 4 °C, por 10 min. O sobrenadante foi descartado, mantendo o pellet onde foi acrescentado etanol 75%. O material foi ressuspendido em tampão de DNase 1X (10 mM Tris-HCl (pH 7.5 a 25 °C), 2.5 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2) e incubou-se de 30 min a 37 °C com 2.5 unidades de
DNase livre de RNase I. Subsequentemente, o RNA foi re-extraído com fenol: clorofórmio ácido (1:1, v/v - pH 4.5) e o precipitado com 2 volumes de etanol a 100%. Finalmente, o precipitado foi lavado com etanol a 75% e ressuspensos em volumes variáveis de água tratada com DEPC (dietilpirocarbonato).
4.3.7 Quantificação de RNA das células T84 A quantificação do RNA foi realizada através da leitura de uma alíquota da amostra no espectrofotômetro Nanodrop 2000c (ThermoFisher Scientific, MA, EUA), em comprimento de onda equivalente a 260 nm, considerando que 1DO260nm equivale a 40
µg de RNA/mL.
A relação entre as leituras realizadas a 260 e 280 nm foi utilizada como parâmetro na estimativa do grau de contaminação do RNA por proteínas.
Invariavelmente, o valor desta relação deve estar contido na faixa de 1.7 a 2.1. A análise da qualidade do RNA extraído foi realizada por eletroforese da amostra em gel de agarose 1.2 %, e visualização das bandas 28S e 18S, correspondentes ao RNA ribossomal.
4.3.8 Retrotranscripção do RNA
O cDNA foi sintetizado a partir de 1.5 µg de RNA total utilizando Superscript III (200 U/µL). Resumidamente, o RNA total foi misturado com dNTPs 10 mM (solução dinucleotídeos trifosfato - dATP, dTTP, dCTP, dGTP), e 200 ng de primers em volume final de 13 µL. Após um passo de desnaturação durante 5 min a 65 °C, os tubos foram colocados em gelo durante pelo menos 3 min, para evitar a reformação da estrutura secundária.
Posteriormente, os componentes seguintes foram adicionados à mistura reacional: tampão de reação 5X, (DTT 0.1 M), 20 U de RnaseOUTTM e 200 U de
Superscript III em 20 µL de volume final. Os primers foram deixados para hibridar com o RNA durante 5 min a 25 °C e para o alongamento foi deixado em 50 °C durante 60 min. A reação terminou com um passo final de inativação da enzima (15 min a 70 °C). Um controle negativo, uma reação que não contêm enzima RT, foi efetuada em paralelo com cada retro-transcrição.
4.3.9 Reações em cadeia da polimerase
As amplificações de PCR foram realizadas em 25 µL de volume final utilizando AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, MA, EUA). Para cada 1 µL de reação de cDNA foram utilizados os seguintes primers:
Tabela 3. Sequências de primers oligonucleotídicos para genes alvo utilizados na RT- PCR.
Genes Fita molde e codificadora
pde5a-F 5’-GGAAGAGGTTGTTGGTGTAGC-3’ pde5a-R 5’- GTTCTCCAGCAGTGAAGTCTC-3’ H-ACTB-F 5’- CTGGGCATGGAGTCCTGTG-3’ H-ACTB-R 5’- AGGGCAGTGATCTCCTTCTG-3’
O programa de amplificação consistia de 35 ciclos de: desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, primers de anelamento durante 30 segundos a 57 °C e um passo de alongamento a 72 °C durante 30 segundos. Cada programa foi precedido por um passo de desnaturação preliminar para 95 °C durante 5 min e seguido por um passo de alongamento final a 72 °C durante 7 min. As reações de PCR foram realizadas utilizando um sistema de PCR GeneAmp 2400 (Perkin Elmer, MA, EUA). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em 1.2% (m/v) de géis de agarose e visualizados sob luz UV, após coloração com brometo de etídio.
4.3.10 PCR Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR)
As amostras de cDNA utilizadas na reação de qRT-PCR foram quantificadas num sistema StepOne PlusTM detecção em tempo real (Applied Byosystems, MA, EUA)
usando a mistura SYBRTM Green PCR Master Mix® (Applied Biosytems, USA), que além
de conter todos os reagentes necessários para PCR (dNTP’s, MgCl2, tampão, Taq Ampli-
Gold), contém o corante SYBR Green, uma molécula que emite maior quantidade de sinal fluorescente ao intercalar com DNA dupla fita.
As reações foram realizadas em placas de 96 poços (Applied Biosystems, MA, EUA), onde foi feita uma curva com a mistura de todos os cDNA, conforme mostrado no esquema abaixo:
Esquema 1. Diluição seriada da curva padrão utilizando todas as amostras e diferentes