Análise da manutenção do gene nas plantas transferidas para o campo

Duas das plantas transformadas, uma por bombardeamento de partículas e outra

λ

+

–

+

₊

_–

3 anos em terra. Destas, apenas a que tinha sido transformada por Agrobacterium evidenciou a permanência do gene cpArMV por Southern blotting (Fig. 5.8.).

Figura 5.8. – Southern blotting do clone de H. lupulus transformado com pROKArMV e colocado em terra há mais de 2 anos. Foi usada como sonda um fragmento de 1,2 Kbp do gene da cápside viral do ArMV. A) Clone transformado digerido com enzima Sma I e Eco RI. B) Plasmídeo digerido com enzima Sma I. C) Plasmídeo digerido com enzima Eco RI.

Na Fig. 5.8. é visível a marcação correspondente ao corte do DNA pelas enzimas de restrição Sma I e Eco RI, e mais intensamente uma mancha correspondente a um fragmento de peso molecular bastante superior ao esperado. Assim, estamos na presença de pelo menos dois locais de inserção do gene cpArMV na planta, uma vez que surge mais uma mancha de maior peso molecular (23,1kbp), que o esperado das digestões com as enzimas de restrição utilizadas (com enzima Sma I surge fragmento de 3,4kbp, com EcoR I um fragmento cujo tamanho dependeria da distância entre o sitio onde o transgene se integrou no genoma e o 1º local de flanqueamento no DNA da planta. A B C

9,4

6,5

2.3

5.4. DISCUSSÃO

5.4.1. Análise do DNA por PCR

O rendimento dos processos de extracção dos ácidos núcleicos foi baixo, por motivos associados à morfologia da planta e às condições de cultura. Assim, por ser uma planta trepadeira de caules fibrosos e longos, e com folhas só nos entrenós, o lúpulo tem pouco peso fresco. Além disso o grau de hidratação do material em cultura é muito elevado, donde em termos de quantidade de ácidos núcleicos disponíveis nas plantas de lúpulo,

in vitro, o rendimento é necessariamente baixo.

O gene cpArMV foi integrado nas plantas que sofreram transformação mediada por

Agrobacterium, e nas que foram transformadas por bombardeamento de partículas. A

percentagem de plantas que mantiveram o gene integrado ao fim de 6 meses, contudo, foi bastante baixo, não ultrapassando os 2 a 5%. Este resultado mostra que, ainda que num número reduzido de plantas, foi possível a incorporação estável do transgene. Outros trabalhos utilizando a transformação mediada pela estirpe de bactérias LBA 4404 de Agrobacterium, e a construção 35SGUSINT, revelaram-se pouco conclusivos quanto à integração estável de genes no lúpulo (Horlemann et al., 2003; Oriniakova et al., 1999). A planta utilizada nestes registos foi uma variedade checa, em que as marcações histoquímicas do GUS, embora visíveis, também diminuíram com o tempo. Nesse caso, não foi mesmo possível obter qualquer marcação por Southern blotting (Oriniakova et al., 1999). É pois possível que, no caso do lúpulo, possa existir um processo de silenciamento dos transgenes e/ou as construções usadas não sejam as mais eficientes, ou ainda que o processo de regeneração associado, apesar dos resultados obtidos, não seja o mais apropriado, pois as células com maior capacidade morfogénica não são, necessariamente, as mais acessíveis, ou as mais sensíveis à infecção por

Agrobacterium. O processo de bombardeamento, apesar de ter uma maior capacidade

de penetração nos tecidos, não se revelou mais eficiente na frequência de obtenção de transformações estáveis. Assim considerarmos que, embora as células alvo possam ser atingidas, não será esse o maior factor limitante. Apesar de já existirem vastos conhecimentos quanto aos factores bacterianos envolvidos na transferência genética inter-reinos (Monera versus Plantae) (Ditt, 2001), o conhecimento do que se passa no hospedeiro ainda está pouco claro. Trabalhos recentes (Radclyffe et al., 2003) indicam que nas células eucarióticas a intensificação da sensibilidade à transformação mediada por Agrobacterium, está intimamente relacionada com a síntese de purinas nas células

aumentar substancialmente a eficiência de transformação, sem que isso esteja dependente de anteriores manipulações genéticas. Este poderá ser um caminho a seguir em posteriores trabalhos de transformação utilizando o lúpulo.

5.4.2. Análise molecular das plantas

5.4.2.1. Análise das plantas transformadas por Southern blotting

Os resultados obtidos nestas análises demonstram que apesar de positivos, as plantas com marcação correspondente à presença do gene continuam a corresponder a uma baixa percentagem do total de transformadas, o que deixa em aberto a possível melhoria em todo o processo (ex: tipo e condições de cultura), com vista ao aumento da frequência de plantas com transformação estável.

As hibridações por Southern blotting dão a informação de que, existe mais do que um local de inserção nas plantas transgénicas, na digestão pela enzima Sma I. A razão para este resultado pode ser diversa, desde múltiplas inserções, integrações aberrantes capazes de gerarem novos locais durante o processo de integração do plasmídeo, ou ainda, a delecção de partes do T-DNA. Alguns autores consideram que a instabilidade genética é induzida em loci particulares do genoma, que se tornam locais preferenciais de integração do T-DNA, por recombinação ilegítima (Risseeuw et al., 1997). A indução dessa instabilidade terá origem no stresse existente nas células de explantes e calli em cultura, habitualmente utilizados como alvos de transformação. Assim sendo, será importante, por um lado, ter em atenção as construções utilizadas de modo a minimizar as metilações e outros processos de silenciamento, e por outro, considerar novas e diferentes técnicas de transformação, como seja a infiltração, de forma a poder ser ultrapassado o stresse causado pela própria cultura in vitro. Esta seria pois uma possibilidade a levar em conta para aumentar o número de plantas com integração estável dos genes de interesse.