Determinação molecular do sexo das plantas

Uma vez que a determinação do sexo nas plantas de lúpulo envolve a presença de um cromossoma Y, todo o polimorfismo presente neste cromossoma será especificamente masculino, porque este polimorfismo só é transmitido de macho para macho. É com base nestes dados que foi determinado por amplificação aleatória dos polimorfismos de DNA – RAPD (random amplified polymorphic DNA), por ser este o tipo de marcador capaz de discriminar plantas macho de plantas fêmeas (Polley et al., 1997). Foi este marcador transformado num outro de locais de sequência marcada – STS (“sequence tagged sites”) que foi usado como fragmento a amplificar por PCR. A presença deste fragmento de 1,2 kb nos produtos de PCR, permitiu determinar que se estava na presença de uma planta macho de lúpulo.

Das análises feitas por PCR, verificou-se que as plantas das variedades comerciais eram todas plantas femininas, visto que em nenhuma delas foi possível amplificar este fragmento específico de plantas macho. Posteriormente às análises moleculares foi possível fazer a observação morfológica, que tal como vimos na secção anterior, viria a confirmar os resultados moleculares.

a

b

c

d

f

e

Da observação do gel dos produtos de PCR (Fig. 4.4.), podemos verificar que só aparecem as bandas do peso molecular esperado (1,2kb) nas plantas de Bragança, enquanto que todas as amostras das variedades comerciais, não apresentam banda alguma.

Figura 4.4.: Determinação do carácter sexual de plantas de H. lupulus por PCR. Plantas comerciais femininas: E1, E2 (variedade Er), N1, N2 (variedade Nougett). Plantas resultantes da transformação de plantas do clone Br, por Agrobacterium: R1,15. Plantas resultantes da transformação de plantas do clone Br, por bombardeamento de partículas: (A) correspondendo a transformação a 1500 psi e a 9 cm (B) correspondendo a transformação a 1500 psi e a 12 cm de distancia dos “carriers”. C Planta controlo (não transformada) do clone Br. (-) Controlo negativo do PCR. λ (DNA do fago λ digerido com Ava III).

Na Figura 4.4. é possível verificar que somente as plantas resultantes do clone Br, mesmo as sujeitas a transformação, apresentam a presença da banda associada às plantas de sexo masculino. Todas as plantas de origem comercial (var. Er e var. Nougett) sendo certificadamente plantas femininas, não apresentaram a banda associada ao sexo masculino.

- Morfologia e germinação de grãos de pólen das plantas no campo

Com base nas medições realizadas em microscopia óptica, verificou-se que os grãos de polén possuíam 25 µm de diâmetro. Apresentavam um espessamento da parede, que forma 3 gomos em cujo centro aparecem poros (Fig. 4.5.).

Apesar de ter ocorrido germinação, ela por vezes não pareceu ocorrer de uma forma normal, surgindo o tubo polínico sem orientação definida, enrolado sobre ele próprio. No entanto verificou-se que, em alguns casos, a germinação parecia ser mais definida, surgindo tubos polínicos mais longos e sem enrolamento (Fig. 4.6.).As taxas de germinação atingiram o seu valor máximo às 4h, com 50%, mantendo o mesmo valor nas 6h e sendo de 39% às 2h. Na Fig. 4.5.pode observar-se o aspecto morfológico dos grãos de pólen das plantas transgénicas do clone Bragança, verificando-se que o aspecto é semelhante aos grãos de pólen produzidos por plantas não transformadas.

E1 E2 N1 N2 λ λ

λ R1 15 A B C (–)

Figura 4.5. Aspecto morfológico dos grãos de polén isolados. (a e b) As setas indicam os 3 gomos (b) Seta espessa início da germinação do tubo polínico (ampliação total 400 x). (c e d) Aspecto morfológico de grãos de polén provenientes de plantas não manipuladas, (c) imagem retirada de www.123-net-Cours-Éléments de Botanique. fr (UFR de Pharmacie et Ingénierie de la Santé – ANGERS). Na imagem está inserida uma escala de 10 μm. (d) imagem retirada de www.kv.geo.uu.se

Figura 4.6. Germinação dos grãos de polén. a) Tubos polínicos enrolados com extremidades bojudas e atrofiadas (setas) ampliação total 100x. (b) e d) Tubos polínicos após 4h em meio de germinação (ampliação total 40x). c) Germinação dos grãos de polén após 6h (ampliação total

a _b

c

d

4.4. DISCUSSÃO

4.4.1. Aspectos morfológicos das flores

As plantas transformadas assim como as plantas que embora não transformadas passaram por cultura in vitro, nomeadamente as plantas regeneradas, apresentaram morfologia em tudo semelhante as plantas cultivadas e espontâneos descritos na bibliografia.

As inflorescências surgiram em panículas axilares, bracteadas com brácteas de cerca de 2 mm, decrescentes em tamanho até ao ápice. As anteras tinham cerca de 0,75 mm e sésseis, tal como foi descrito para esta espécie por Castroviejo e outros (1993). Assim em termos morfológicos as plantas não sofreram alterações. Se nas plantas regeneradas e multiplicadas ocorreu variação somaclonal, como o descrito para Curcuma

longa L. (Salvi et al., 2001), ela não se manifestou visivelmente em termos morfológicos.

Por outro lado, as plantas transformadas apresentaram também morfologia em tudo idêntica á descrita para o lúpulo, o que poderá significar que a integração dos transgenes não ocorreu em zonas do genoma passíveis de causar alterações (co-supressão de genes endógenos) manifestáveis na forma de alterações morfológicas. No entanto, será necessário a utilização de técnicas mais finas (ex: técnicas moleculares, como análise por “Random amplified polymorphic DNA (RAPD)) para assegurar que não ocorreram variações somaclonais (Salvi et al., 2001).

4.4.2. Determinação molecular do sexo das plantas

Considerando os resultados obtidos na amplificação por PCR, verificou-se que, tal como descrito por Polley e outros (1997), os “primers” utilizados apresentaram capacidade para amplificar uma zona específica do genoma das plantas de lúpulo do sexo masculino, tornando, deste modo, possível a identificação do carácter sexual das mesmas de uma forma rápida e expedita. Este processo tem a vantagem acrescida de permitir a determinação do sexo nas fases iniciais do desenvolvimento, sem necessidade de esperar pela floração, que por vezes, como no caso do clone Br., só ocorreu 2 anos depois da transferência para terra.

Em termos morfológicos, verificou-se que as plantas de origem comercial eram de facto do sexo feminino, pela observação das flores. Este era o resultado esperado, uma vez que somente as plantas femininas têm interesse comercial, e estas plantas foram

cedidas, inicialmente, a partir de lotes comerciais utilizados na cultura do lúpulo em Trás- os-Montes.

A confirmação morfológica do sexo das plantas e também o facto de o pólen ter germinado permite-nos considerar que, o clone de lúpulo espontâneo Bragança tem todo um potencial para ser utilizada como instrumento de melhoramento genético das cultivares de interesse económico.

No caso do clone Br, por se tratar de um clone espontâneo, recolhido na primavera, teria 50% de probabilidades de ser uma planta masculina. Com a determinação de que se trata de uma planta masculina podemos assegurar tratar-se, de facto, de uma planta espontânea e não uma planta de origem comercial, que tivesse, de algum modo, ultrapassado as barreiras dos campos de lúpulo cultivados. Por outro lado, desde o início da cultura de lúpulo com fins industriais que, embora não sendo usados para a produção de cerveja, as plantas masculinas têm um papel preponderante nos cruzamentos com vista à aquisição de novas características ou ao melhoramento de características já estabilizadas. Podemos pois dizer que as plantas masculinas, tal como preconizado por outros autores (Neve, 1988; Kralj & Haunold, 1987; Kenny, 1991; Seigner, 1992; Bakshi et al., 1994), podem ter um papel importante na obtenção de novas variedades de lúpulo com interesse cervejeiro, pelo que, esta planta espontânea pode ser aplicada em programas de melhoramento no sentido da obtenção de novas variedades. Por outro lado, trabalhos desenvolvidos com base na herança e transmissão dos genes de interesse, em sucessivas gerações, mostraram casos em que essa transmissão era estável (Chen et al., 1998; Campbell et al., 2000; Butterfield et al., 2002). Neste sentido, uma estratégia para obtenção de plantas com múltiplas resistências, ou novas apetências de interesse económico, será a de conduzir o cruzamento entre plantas transgénicas (no caso do lúpulo: masculinas e femininas) para diferentes genes (Butterfield et al., 2002). Será pois, de todo o interesse, num futuro próximo, testar cruzamentos utilizando este clone espontâneo.

- Morfologia e Germinação dos grãos de pólen das plantas no campo

Embora uma percentagem importante de grãos de polén tenha germinado, o processo não apresentou os resultados esperados. Nalguns casos o tubo polínico não se desenvolveu linearmente, apresentando uma forma atrofiada ou enrolada sobre si mesmo. Estes resultados poderão estar relacionados, por um lado, com o tempo de germinação dos grãos de pólen, que embora não muito afastado do tempo da sua produção (foram recolhidos em fim de Agosto, início de Setembro, e utilizados nos testes

elevadas. Por outro lado, o facto de ser o primeiro ano em que ocorreu floração, permite- nos sugerir que no primeiro ano a produção de flores e de grãos de pólen seja, não só inferior, como de menor viabilidade.

Outro factor a ter em consideração nos nossos resultados prende-se com o meio utilizado nos testes que, podendo não ser o mais indicado para esta espécie, pode ser também responsável pelas anomalias germinativas encontradas. Para determinar, de um modo mais definitivo, as taxas de germinação das plantas do clone Br, terão que ser feitos mais testes de germinação nos próximos anos, de modo a poderem determinar-se taxas de germinação e estados fisiológicos óptimos para o pólen de lúpulo.

O aspecto morfológico e dimensões dos grãos de pólen recolhidos e analisados nas plantas geneticamente modificadas são em tudo idênticos aos descritos para esta espécie (www.kv.geo.uu.se; Castroviejo et al., 1993).Assim sendo, podemos afirmar que, a esse nível não parece ter havido alterações detectáveis que possam dever-se ao facto das plantas terem sido manipuladas genéticamente.

CAPÍTULO V

Análise molecular das plantas transformadas

Índice

RESUMO 134

5.1. INTRODUÇÃO 136

5.2. MATERIAL E MÉTODOS 140

5.2.1.EXTRACÇÃO DE DNA DAS PLANTAS 140

5.2.2.EXTRACÇÃO DE RNA DAS PLANTAS 140

5.2.3.ANÁLISE DO DNA DOS TRANSFORMANTES POR PCR 142