A VALIAÇÃO HISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO TRANSIENTE DO GENE UID A

3.3.4.TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA POR BOMBARDEAMENTO DE PARTÍCULAS 105

3.3.5.ANÁLISE MOLECULAR DAS PLANTAS 107

3.3.5.1.AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DO GENE UID A POR PCR 107

3.4. DISCUSSÃO 111

3.4.1.OBTENÇÃO DE PLANTAS LIVRES DE VÍRUS 111

3.4.2.TERMOTERAPIA 111

3.4.4.TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA MEDIADA POR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 113

3.4.4.1.SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS 114

3.4.4.2.ESTUDO DA DETECÇÃO DA INTEGRAÇÃO DO GENE UID A E NPT II 116

3.4.5.TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA POR BOMBARDEAMENTO DE PARTÍCULAS 117

Resumo

Neste capítulo determinaram-se os métodos e condições para a obtenção de plantas transformadas, utilizando duas técnicas distintas: transformação mediada por Agrobacterium e bombardeamento de partículas. As plantas utilizadas na transformação foram testadas quanto à presença dos vírus: ArMV(Vírus do Mosaico de Arabis), ApMV (Vírus do Mosaico da Macieira), PPV (Vírus Postular da Ameixieira), PNRSV (Vírus da Necrose em Anel de Prunus), SGV (Vírus do Fendilhamento do Caule), através de DAS-ELISA. As plantas infectadas foram sujeitas a métodos de eliminação de vírus: termoterapia com isolamento e cultura de meristemas, e micropropagação em meio com um antivírus químico Isovir ® cujo princípio activo é a Isoprinosina. Utilizou-se o plasmídio p35SGUSINT e o plasmídio pROKArMV (construção com o gene da cápside viral do ArMV). Os plasmídios contêm o mesmo gene marcador selectivo, o npt II.

Os antibióticos de eliminação de bactérias foram a cefotaxima e/ou carbenicilina em diferentes concentrações e combinações. Várias concentrações de canamicina foram testadas em explantes transformados. O tempo para a aplicação de selecção foi também testado. A transformação foi testada com e sem a utilização do composto fenólico acetosseringona na co- cultura das bactérias com o material vegetal. As estirpes de Agrobacterium utilizadas foram a LBA 4404, a EHA 105 e a C1C58 com o plasmídio 35SGUSINT. No bombardeamento de partículas os “macrocarriers” foram colocados a 6mm do ecrã de paragem e as amostras colocadas a diferentes distâncias. Foram testadas várias pressões de bombardeamento dos explantes.

Os ensaios de teste DAS-ELISA mostraram que as plantas “stock” não estavam infectadas com o Vírus do Mosaico de Arabis, nem com qualquer outro dos vírus testados, excepto em 20% das plantas do clone Br, infectadas com PNRS. As plantas foram submetidas a termoterapia e isolamento de meristemas, e cultura em meio com antivírus químico filtrado e meio com antivírus químico autoclavado. O crescimento médio foi determinado em cada uma das condições anteriores. Foi verificada a taxa de morte dos explantes e a percentagem de material livre de vírus obtido. A taxa de morte, nas plantas em meio com antivírus autoclavado, é superior à ocorrida em meio com antivírus filtrado. Nos explantes colocados em 25mg/L de canamicina existe um decréscimo de cerca de 5% na regeneração em relação às plantas controlo. Para os 50mg/L de canamicina esta diminuição na regeneração foi cerca de 13%. A frequência de regeneração com Agrobacterium foi inferior, cerca de 6%, à das plantas controlo. A frequência de regeneração dos explantes transformados por bombardeamento de partículas foi mais baixa 3% que a das plantas controlo. A taxa de resultados positivos foi de 70%, nos explantes transformados com a estirpe C1C58, 65%, com a estirpe LBA4404 e 30% com a estirpe bacteriana EHA 105. Independentemente da estirpe bacteriana usada, a expressão de gene uid A, decresceu ao longo do tempo, sendo inferior a 2% ao fim de 4 meses.

Nos ensaios com a construção p35SGUSINT obteve-se 50 plantas em que a taxa integração dos genes, confirmada por PCR, 2 meses após a transformação, foi de 39,4% para o gene uid A e de 85,3% para o gene npt II.

Conclui-se que, quer na transformação mediada por Agrobacterium, quer no bombardeamento de partículas, 48h de pré-cultura dos explantes permitiram a obtenção de maior número de transformantes. A pressão selectiva nos meios deve começar a exercer-se até os 3 primeiros dias após transformação, com uma concentração de canamicina de 25mg/L. Na transformação mediada por Agrobacterium, os antibióticos de eliminação da bactéria devem ser usados numa mistura de cefotaxima e carbenicilina na concentração de 250mg/L cada. No bombardeamento de partículas, as condições para a obtenção de mais plantas transformadas serão as de 1500psi de pressão e com as amostras a 6cm do ecran de paragem.

3.1. INTRODUÇÃO

O lúpulo é uma planta perene que possui um ciclo sexual anual o que, em termos de melhoramento convencional, representa uma vantagem. O facto de se tratar de uma planta dióica pode, porém, constituir uma desvantagem. O melhoramento convencional para além de envolver plantas masculinas, que do ponto de vista económico têm pouco interesse e, vão interferir nas características da planta feminina,implicam a espera de 3 a 4 anos até a produção ser passível de avaliação pelo produtor. Neste sentido, atendendo ao grande valor económico do lúpulo, e ao enorme prejuízo causado anualmente por numerosos agentes patogénicos, nomeadamente vírus, a que espécie é sensível, a transformação genética pode ser a resposta para um problema que se repete todos os anos com consequências sempre devastadoras (Adams, 1975). As infecções causadas por este tipo de organismos pode conduzir, não só, à perda de produtividade das cultivares, como também à alteração do seu conteúdo em α-ácidos e óleos essenciais. Assim, relativamente aos primeiros, os valores podem baixar até 40% e aumentar em percentagem semelhante nos segundos, nomeadamente, no que se refere a alguns sesquiterpenos (Patzak et al., 2001).

Embora o lúpulo não possa ser considerada uma planta recalcitrante à transformação, visto que existem poucos trabalhos de transformação envolvendo esta espécie, sendo o nível de conhecimento pouco profundo, a verdade é que, dos registos de trabalhos nesta área envolvendo o lúpulo, existem dados que apontam para alguma dificuldade na introdução estável dos genes de interesse (Oriniaková & Matoušek, 1996; Horlemann et al., 2003, Lyon de Castro, 2004), o que deixa em aberto uma vasta gama de possibilidades para trabalhos futuros. Por outro lado, a micropropagação e multiplicação in vitro de diversas variedades de lúpulo tem vindo a ser desenvolvida com bons resultados. Assim, uma vez obtidas plantas transformadas, estas podem ser multiplicadas, de um modo seguro, e após todos os testes exigidos, transferidas para os jardins de lúpulo com sucesso para o produtor. Dado que na família do lúpulo só existem dois géneros, Humulus e Cannabis, a base de estudo prévio ao nível deste taxon não é muito rica, pois também existem poucas referências de transformação genética envolvendo plantas deste segundo género.

No processo de transformação genética várias fases decisivas devem ser concretizadas para a obtenção de plantas estavelmente transformadas. Uma delas é a obtenção de organogénese e outra, no caso particular da transformação mediada por

ser sensível ao Agrobacterium, já foi provada por vários trabalhos (Horlemann et al., 2003; Lyon de Castro, 2004) incluindo o presente trabalho.

O bombardeamento de partículas tem sido utilizado em plantas lenhosas e em geral com taxas elevadas de sucesso (Jauhar, 2001; Altpeter et al., 2005). Tornou-se o método alternativo para as plantas menos sensíveis a Agrobacterium e, em várias situações, um eficiente método alternativo de transformação. Embora seja um método expedito e determinante para as plantas pouco sensíveis a Agrobacterium, tem sido usado, de uma maneira mais geral, na transformação de diferentes espécies de plantas, independentemente da sua sensibilidade ao Agrobacterium, tendo sido recentemente utilizado com sucesso em lúpulo, num trabalho complementar ao presente (Lyon de Castro, 2004).

Quer no método utilizando o Agrobacterium como vector, quer no caso do bombardeamento de partículas, os vectores contêm um gene repórter e um gene marcador de selecção. Estes genes são extremamente úteis na determinação dos passos e factores essenciais para o processo de transformação, nomeadamente na fase inicial do processo.

Este trabalho tem como objectivo determinar a possibilidade de se obter a transformação estável de plantas de lúpulo. Por um lado, pretendemos determinar os métodos e condições essenciais para a transferência de DNA para as células vegetais (determinação da expressão transiente) e, por outro, desenvolver as técnicas de cultura

in vitro adequadas para a obtenção de plantas transformadas.

Após o desenvolvimento do protocolo de transformação e deste ter sido testado numa planta modelo (Nicotiana tabacum), foi efectuada a transformação em lúpulo. Por fim, foi aplicado e avaliado o protocolo de transformação, com uma construção contendo a proteína da cápside do Vírus do Mosaico de Arabis, nas plantas de lúpulo do clone Bragança.

3.2. MATERIAL E MÉTODOS

3.2.1. Avaliação da existência de infecções virais nas plantas por DAS-ELISA