Para análise inicial, os espécimes coletados durante cirurgia foram congelados e cortados. Os cortes obtidos foram corados com HE com o objetivo de se confirmar o diagnóstico de GSN, AP e/ou CXAP. A lâmina da congelação foi analisada (Figura 6) e o fragmento foi utilizado para extração de RNA. As características histológicas encontradas após análise destes fragmentos estão disponíveis no Apêndice 2.
Tabela 6 – Estadiamento, tratamento e recorrência de 10 pacientes diagnosticados com CXAP utilizados para análise de expressão gênica e imunoistoquímica neste estudo
Características clínicas N (%) Estadiamento (T) T2 4 (40%) T3 3 (30%) T4 3 (30%) Estadiamento (N) N0 6 (60%) N1 3 (30%) N2 1 (10%) Estadiamento (M) M0 9 (90%) M1 1 (10%) Estádio clínico I e II 3 (30%) III e IV 7 (70%) Radioterapia Sim 7 (70%) Não 3 (30%) Quimioterapia Sim 1 (10%) Não 9 (90%) Esvaziamento Sim 6 (60%) Não 4 (40%) Recorrência Presente Local 2 (20%) Distância 2 (20%) Ausente 5 (50%) Não informado 1 (10%)
Tempo para recorrência (anos)
Média 4,3 (intervalo 0,5-8)
Figura 6 – Aspectos histopatológicos observados nas lâminas de congelação de alguns espécimes coletados em centro cirúrgico e utilizados neste estudo. A, parótida normal composta por gordura e ácinos serosos. B, parênquima neoplásico de um AP. Note matriz mixoide (*). D, proliferação de células epiteliais e mioepiteliais de um AP distribuídos em um estroma mixoide. C, parênquima neoplásico de um CXAP composto por células com intenso pleomorfismo celular. D, proliferação de células luminais em um estroma mixoide e formação de estruturas ductiformes, compatível com área de AP residual. Aumento original: A, B, C e D (x10); no detalhe de A, B, C e D (x40).
Em relação a peça cirúrgica do CXAP, áreas de AP residual foram identificadas em 7 casos (70%). Quanto a invasão capsular, 4 de nossos casos (40%) apresentaram invasão franca a cápsula do adenoma ao passo que os outros 4 (40%) apresentaram fases precoces de invasão, sendo classificados como minimamente invasivos. Nenhum de nossos casos foi classificado como intracapsular. Além disso, não tivemos acesso ao material histológico de dois casos (20%), o que impossibilitou a classificação da invasão capsular nestas amostras. Quanto a diferenciação epitelial no fenótipo transformado, 8 casos (80%) exibiram diferenciação luminal. Três deles (30%) foram classificados como adenocarcinoma SOE e 5 casos (50%) como carcinoma do ducto salivar. Nenhum caso evidenciou diferenciação mioepitelial. Margens cirúrgicas estavam comprometidas em metade dos casos (50%). Linfonodos estavam livres de neoplasia em metade dos casos em que o esvaziamento cervical foi realizado. A maioria dos casos não apresentou invasão angiolinfática, perineural e necrose.
Tabela 7 – Características microscópicas de 10 pacientes diagnosticados com CXAP neste estudo
Características microscópicas N (%)
AP residual
Presente 7 (70%)
Ausente 1 (10%)
Não pode ser avaliado 2 (20%)
Invasão capsular
Precoce
Minimamente invasivo 4 (40%)
Francamente invasiva 4 (40%)
Não pode ser avaliado 2 (20%)
Subtipo histológico
Luminal 8 (80%)
Adenocarcinoma SOE
Precoce 2 (20%)
Francamente invasivo 1 (10%)
Carcinoma do ducto salivar
Precoce 2 (20%)
Francamente invasivo 3 (30%)
Mioepitelial 0
Não pode ser avaliado 2 (0%)
Grau histológico
Baixo grau 3 (30%)
Alto grau 5 (50%)
Não pode ser avaliado 2 (20%)
Margens cirúrgicas Livres 5 (50%) Comprometidas 5 (50%) Comprometimento de linfonodos Presente 3 (50%) Ausente 3 (50%) Invasão perineural Presente 2 (20%) Ausente 8 (80%) Invasão vascular Presente 4 (40%) Ausente 6 (60%) Invasão linfática Presente 2 (20%) Ausente 8 (80%) Necrose Presente 4 (40%) Ausente 6 (60%) N: número de casos
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA
Todas as nossas amostras apresentaram RNA íntegro pela análise no gel de agarose
(Apêndice 3). Àquelas provindas do A. C. Camargo Cancer Center passaram por testes de
integridade na própria instituição. De acordo com a otimização da reação de qRT-PCR, o método da curva padrão relativa foi escolhido para realização dos ensaios. β-actina apresentou os melhores resultados dentre outros controles endógenos utilizados e, por esse motivo, foi escolhido para ser o gene de referência. Além disso, os perfis de amplificação indicaram que a amplificação mais eficiente ocorreu na temperatura de 60ºC.
Com isso, foram realizados 5 ensaios para os genes HIF-1α, FASN e adipofilina. Apenas 4 ensaios foram utilizados para o gene GLUT-1. Em todos eles, a especificidade da reação foi verificada pela execução de curvas de dissociação e eficiências maiores que 90% e menores que 110% foram consideradas satisfatórias. Coeficiente de correlação (R2) considerado ideal foi igual ou próximo de 1. Quanto a reprodutibilidade experimental, variações de CT>0,5 entre as triplicatas técnicas foram excluídas. Nenhuma duplicata apresentou variação de CT>0,5.
Quando comparamos a expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre amostras de GSN, AP e CXAP percebemos que não houve diferenças estatisticamente significativas na expressão de HIF-1α entre os tecidos analisados (Gráfico
1A). A expressão de GLUT-1 foi significativamente maior nos tecidos tumorais do que em
GSN (Gráfico 1B). Houve uma tendência de que a expressão gênica de FASN fosse maior nos tecidos tumorais do que em GSN, embora sem diferença estatística (Gráfico 1C). A expressão de adipofilina, diferentemente dos outros genes, foi significativamente menor nos tecidos tumorais do que em GSN (Gráfico 1D).
Além disso, algumas de nossas amostras se diferenciaram de todas as outras e foram colocadas nos gráficos como pontos acima da barra de desvio de erro (outliers). Fizemos uma análise cuidadosa destas amostras na tentativa de encontrar possíveis justificativas (Apêndice 4). Como visto, características histológicas dos fragmentos utilizados para extração do RNA podem ser encontradas no Apêndice 2.
Gráfico 1 – Análise de qRT-PCR para comparação da expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre amostras de GSN, AP e CXAP. Em A, não foi observada diferença estatística na expressão deHIF-1α entre os tecidos analisados. Em B, expressão de GLUT-1 foi significativamente maior nos tecidos tumorais do que em GSN. Em C, houve uma tendência de que a expressão de FASN fosse maior nos tecidos tumorais do que nos tecidos normais estudados, embora sem diferença estatística. Em D, a expressão de adipofilina nos tecidos tumorais foi menor nos tecidos tumorais do que em GSN. **p<0,01; teste Kruskal-Wallis com comparação múltipla de Dunn’s. Pontos acima da barra de erros representam outliers.
Além disso, verificamos a expressão destes genes em GSN de seis pacientes em que a contraparte neoplásica (AP ou CXAP) também foi avaliada. Quando comparamos a expressão relativa dos genes entre GSN e o tecido tumoral, percebemos que não houve diferenças estatisticamente significativas na expressão de HIF-1α entre os grupos (Gráfico 2 A). Por outro lado, a expressão de GLUT-1 foi significantemente maior no tecido tumoral do que em GSN
(Gráfico 2 B). FASN tendeu a ser mais expressa no tecido tumoral enquanto a adipofilina foi
significantemente maior em GSN (Gráfico 2 C e D).
Gráfico 2 – Análise de qRT-PCR para comparação da expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre GSN e tecido tumoral (TT) provenientes dos mesmos pacientes (n=6). Em A, não se observou diferença estatística na expressão de HIF-1α entre GSN e tecido tumoral. Em B, expressão de GLUT-1 foi significativamente maior nos tecidos tumorais do que em GSN. Em C, não se observou diferença estatística na expressão de FASN entre GSN e tecido tumoral. Em D, expressão de adipofilina foi significativamente maior nas GSN do que no tecido tumoral. *p<0,05; **p<0,01; teste Mann-Whitney. Pontos acima da barra de erros representam outliers.
Quando comparamos a expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre as 4 amostras de AP residual, as 13 amostras de AP e as 10 amostras de CXAP, percebemos que não houve diferenças estatisticamente significativas na expressão destes genes entre os três grupos (Gráfico 3).
Gráfico 3 – Análise de qRT-PCR para comparação da expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre 4 amostras de AP residual (APr), 13 amostras de AP e 10 amostras de CXAP. Em A, B, C e D não foram observadas diferenças estaticamente significativas na expressão destes genes entre os três grupos. Teste Kruskal-Wallis.
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA
Investigamos por imunoistoquímica a expressão das proteínas HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina. Sete amostras de GSN, 12 amostras de AP e 8 amostras de CXAP foram submetidas a reação conforme descrito em Material e Métodos. Em relação a GSN, a maioria dos casos não apresentou expressão para as proteínas GLUT-1 e adipofilina, enquanto apenas 1 caso apresentou expressão para as proteínas HIF-1α e FASN (14,3%) (Figura 7). Em relação
ao AP, apenas 1 caso (8,3%) expressou a proteína HIF-1α, 10 casos (83,3%) a proteína FASN e 2 casos (16,7%) a proteína adipofilina. Nenhum caso expressou a proteína GLUT-1 (Figura
8). Nos casos de CXAP, a proteína GLUT-1 foi expressa em 6 casos (75%), enquanto a proteína
FASN foi expressa em 7 dos casos (87,5%). Adipofilina, por outro lado, foi expressa em metade dos casos enquanto a proteína HIF-1α foi expressa em um caso (12,5%) (Figura 9). É importante salientar que todos os casos positivos para HIF-1α apresentaram apenas escore 1. O escore 2 aumentou em proporção para as proteínas GLUT-1, FASN e adipofilina à medida que havia progressão da doença (Gráfico 4 A, B, C e D).
Gráfico 4 – Expressão das proteínas HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre amostras de GSN, AP e CXAP por escores de quantidade. Em A, não se observam diferenças entre a expressão de HIF-1α nos tecidos estudados. Em B, aumento da expressão de GLUT-1 apenas no CXAP. Em C e D foi observado aumento na expressão de FASN e Adipofilina na sequência GSN-tecido tumoral.
Em relação a expressão imunoistoquímica do AP residual, a proteínas HIF-1α e FASN foram expressas em 3 dos casos (75%). A proteína GLUT-1 foi expressa em apenas 1 caso (25%) enquanto adipofilina foi expressa em todos os casos. Não notamos diferenças entre os resultados encontrados para as amostras de AP residual e as amostras de AP convencional e CXAP estudadas, embora mais casos de AP residual tenham expressado as proteínas HIF-1α e GLUT-1 (Gráfico 5) (Figura 10).
Gráfico 5 – Expressão das proteínas HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre 4 amostras de AP residual (APr), 13 amostras de AP convencional e 10 amostras de CXAP, por escores de quantidade. Em A, presença de mais casos que expressam HIF-1α em APr do que AP convencional e CXAP. Em B, presença de expressão de GLUT-1 no APr. Em C, semelhança na expressão de APr e as amostras de AP convencional e CXAP. Em D, positividade de todos os casos de APr para a proteína adipofilina.
Figura 7 – Aspectos histológicos e imunoistoquímicos observados na GSN (cabeça de seta) adjacente a um AP (A). Em B, fragmento de parótida normal, rico em ácinos serosos, tecido adiposo, ductos e vasos hiperemiados. C, ausência da expressão da proteína HIF-1α na GSN analisada. D, ausência da expressão da proteína GLUT-1 na GSN analisada. E, ausência de expressão da proteína FASN no citoplasma das células da GSN analisada. F, ausência de expressão da proteína adipofilina nos ácinos da GSN analisada. Aumento original: B (x40); C, D, E e F (x100).
Figura 8 – Aspectos histopatológicos e imunoistoquímicos observados no AP. A, fragmento de tecido mole constituído por neoplasia bem encapsulada. Note área hipercelulares entremeadas em áreas hipocelulares que correspondem a matriz produzida pelo tumor. B, proliferação de células epiteliais em um estroma mixoide. Note formação importante de estruturas ductiformes. C, ausência da expressão da proteína HIF-1α em células mioepiteliais. D, ausência da expressão da proteína GLUT- 1 na membrana celular das células luminais e mioepiteliais. E, expressão da proteína FASN nas células luminais que revestem as estruturas ductiformes. F, expressão da proteína adipofilina nas células que compõem o AP. Notar marcação dita “em gotas” no citoplasma das células. Aumento original: B, C, D e F (x40); E (x100); no detalhe de C, D e F (x100).
Figura 9 – Aspectos histopatológicos e imunoistoquímicos encontrados no CXAP. A, Carcinoma do ducto salivar em fase precoce de invasão a cápsula do adenoma. B, cordões de células luminais com alto pleomorfismo celular, apresentando núcleos proeminentes e citoplasma eosinofílico. C, ausência de expressão da proteína HIF-1α no núcleo das células, embora o citoplasma apresente marcação de fundo inespecífica. D, expressão da proteína GLUT-1 na membrana de células luminais em carcinoma intraductal. E, expressão da proteína FASN nas células luminais que revestem as estruturas ductiformes. Notar ausência de expressão das células mioepiteliais (cabeça de seta). F, expressão da proteína adipofilina nas células luminais em proliferação. Notar marcação dita “em gotas” no citoplasma das células. Aumento original: B (x10); C e E (x100); D e F (x40); no detalhe de B (x40) e D (x100).
Figura 10 – Aspectos histopatológicos e imunoistoquímicos observados em área de AP residual (cabeça de seta) utilizado neste estudo. A, fragmento de tecido mole evidenciando áreas de transformação carcinomatosa e AP residual (8). B, proliferação de células epiteliais benignas em um estroma mixoide. Note formação importante de estruturas ductiformes. C, expressão da proteína HIF-1α em raras células benignas. D, ausência de expressão de GLUT-1 em células benignas. E, forte expressão da proteína FASN restrita as células luminais benignas. F, expressão de adipofilina nas células mioepiteliais que compõem o remanescente benigno que compõe a neoplasia. Notar marcação dita “em gotas” no citoplasma das células. Aumento original: B, C e F (x20); D (x10); E (x40); no detalhe de C, D, E, F (x100).