UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
JOÃO FIGUEIRA SCARINI
EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA DE HIF-1α, GLUT-1, FASN E ADIPOFILINA NO DESENVOLVIMENTO DO CARCINOMA EX-ADENOMA
PLEOMORFO
Piracicaba 2019
JOÃO FIGUEIRA SCARINI
EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA DE HIF-1α, GLUT-1, FASN E ADIPOFILINA NO DESENVOLVIMENTO DO CARCINOMA EX-ADENOMA
PLEOMORFO
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Estomatopatologia, na Área de Patologia.
Orientador: Profa Dra Fernanda Viviane Mariano Brum Corrêa Coorientador: Profª Drª Débora Campanella Bastos
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno João Figueira Scarini e orientada pelo Profa. Dra. Fernanda Viviane Mariano Brum Corrêa.
Piracicaba 2019
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, processo nº.: 153411/2017-1 FAPESP, processo nº.: 15/07304-0
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Odontologia de Piracicaba
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada em 26 de Julho de 2019, considerou o candidato JOÃO FIGUEIRA SCARINI aprovado.
PROFª. DRª. FERNANDA VIVIANE MARIANO BRUM CORRÊA
PROF. DR. FABRICIO PASSADOR-SANTOS
PROF. DR. LUIZ PAULO KOWALSKI
A Ata da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação a cada RNA que não teve a chance de se expressar nas páginas deste trabalho. Saiba que sofri convosco a todo descongelamento, manuseio e dosagem. Eterna gratidão por todo o aprendizado.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
“Eu gostaria de agradecer pelas inúmeras vezes que você me enxergou melhor do que eu sou. Pela sua capacidade de me olhar devagar, já que nessa vida muita gente me olhou depressa demais.” ― Padre Fábio de Mello
Agradeço a todos que tiveram paciência para me enxergar melhor:
Deus,
Você que me reviveu quando estava morto, que me achou quando estava perdido. Você que fala comigo da maneira mais bonita e inesperada. Você que é o mar revolto, mas a paz de mergulhar em um oceano desconhecido. Você que é tudo que tenho certeza que tenho. Muito obrigado por ter cuidado e modelado minha vida em suas mãos. Se foi possível caminhar sobre estas águas, foi porque minha fé me manteve sobre as ondas.
São Jorge da Capadócia,
Carreguei seu manto, vesti suas armas. Obrigado pela proteção.
Mãe, pai e irmã,
Vocês são o motivo da minha persistência. Obrigado pelo abraço apertado, afeto inabalável e inafiançável. Saibam que o maior ensinamento que me deram, com toda a humildade que carregam, é de que a maior nobreza da vida é o amor. Tenho orgulho de dizer que foram os responsáveis pela minha educação e de lembrar, que mesmo após tudo que passamos, superamos. Serei eternamente grato por nunca terem deixado de apaziguar a tempestade do meu coração.
Minha orientadora: Profa. Dra. Fernanda Viviane Mariano,
É imensurável o meu respeito pela profissional que se tornou e a admiração pela coragem, ousadia e responsabilidade que conduz sua vida e trabalho. De todos os dias convividos, experiências e conhecimentos trocados – resta um ensinamento e este guardarei com carinho ao longo de toda minha jornada: se posso sonhar, posso fazer. Muito obrigado por ser o mestre que este jovem padawan precisava. Ainda falta muito para ser Jedi, mas me sinto um pouco mais preparado porque a tive para me guiar em todos os desafios que enfrentamos. Gratidão.
Minha coorientadora: Profa. Dra. Débora Campanella Bastos,
Muito obrigado por ter visto o meu desejo de aprender e para mais do que me treinar, ter tido paciência para ensinar. Saiba que lembrarei com carinho de cada experimento que fizemos e da forma cuidadosa e responsável que me apresentou o alfabeto molecular. Seu amor pela ciência inspira e o que me tornei ao longo destes anos, em grande parte, devo ao seu investimento. Vou levar comigo o modo pelo qual suja as mãos em busca de uma coisa tão simples, mas valiosa, que é o perfume das flores. Te admiro demais.
Raísa Sales de Sá,
É como a história de um caminhante que encontrou outro pelo caminho e vendo sua necessidade, estendeu sua mão. Você que viu minha pior e melhor versão. Você que teve paciência para aceitar que fazíamos parte da evolução do outro. Você que foi amiga, irmã e porto seguro nestes anos. Você que foi paz... Obrigado por ter me dado a mão. Te amo.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), processo nº 153411/2017-1.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo nº 15/07304-0.
“Eu sou parte de uma equipe. Então, quando venço, não sou eu apenas quem vence. De certa forma termino o trabalho de um grupo enorme de pessoas!” ― Ayrton Senna
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de
Campinas, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Francisco Haiter Neto.
À Coordenadoria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de
Piracicaba, na pessoa da Profa. Dra. Karina Gonzales Silveiro Ruiz e ao Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia, em nome do coordenador Prof. Dr. Márcio Ajudarte
Lopes.
Aos Profs. Drs. Alan Roger dos Santos Silva, Edgard Graner, Jacks Jorge
Júnior, Márcio Ajudarte Lopes, Pablo Augustin Vargas, Oslei Paes de Almeida e Ricardo Della Coletta, professores das áreas de Patologia e Semiologia da Faculdade de Odontologia
de Piracicaba por todo suporte, comprometimento e ensinamentos.
Em especial, ao Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes por ter me concedido a oportunidade de atender no Orocentro, ao Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva pelo zelo profissional, atenção aos pacientes e ensinamentos ao longo dos meses em que passei sob sua supervisão nas terças-feiras e ao Prof. Dr. Edgar Graner pelos valiosos conselhos ao longo deste trabalho.
Ao Prof. Roman Carlos, colaborador do Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, por ter me recebido em sua casa e em seu ambiente de trabalho com tanto entusiasmo e respeito. Carrego comigo os ensinamentos que adquiri nos momentos que compartilhamos ao longo do mês em que estive na Guatemala.
Ao Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Estadual de Campinas, que me recebeu com tanto amor. Obrigado por ter
colaborado tanto em minha formação. Sinto uma admiração imensa por todos os professores e profissionais que compõem esta família. Agradeço também aos funcionários do Departamento, sobretudo à Ana Paula Godoy, Beth Giusti, Arethuza Souza, Ana Claudia Piaza, Adilson
Piaza e Dario Bernardo Silva. Cada um ao seu modo foi parte fundamental na construção
À Profa. Dra. Albina Altemani por toda colaboração neste e em tantos outros projetos. Obrigado por me ensinar mais que Patologia: ensinar valores como humildade e solidariedade. Não tenho palavras para dizer o quanto sou grato. Quando vou ao microscópio na sua presença, sinto como se estivesse diante de alguém que verdadeiramente tem o dom. Muito obrigado por esta chance de ‘aprender a conversar com a lâmina’.
Aos Profs. Drs. Antonio Santos Martins e Alfio José Tincani, professores do
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, aos médicos assistentes, Dr. André Del Negro e Dr. André M. Casarim e aos médicos residentes, Drs. Rebeca Dias e Mário Fernandez, que ao
longo dos últimos meses me proporcionaram momentos de grande aprendizado no Ambulatório de Cabeça e Pescoço do Hospital de Clínicas.
Ao A. C. Camargo Cancer Center por ter nos concedido boa parte das amostras deste trabalho. Em especial, ao Dr. Luiz Paulo Kowalski, Dra. Cláudia Malheiros e aos técnicos Lais Takata, Rafaela Batista e Severino Ferreira, por sempre serem tão solícitos e proativos. Sem vocês isto não seria possível.
Ao Bruno Mariz, amigo que aprendi a respeitar e admirar. Agradeço a amizade que construímos, por me ouvir e aconselhar. Você foi o irmão mais velho que não tive, o irmão que a pós-graduação me deu. À Iara Aquino, que me ensinou muitas vezes em silêncio; que me fez enxergar meu olhar mais sincero; que fez a diferença em me visitar todas às noites para simplesmente mostrar que estava lá. Com toda certeza, vocês dois foram peças fundamentais nesta conquista.
Ao Reydson Souza, companheiro de trabalho, dramas e surtos diários. Agradeço pelos exemplos de dedicação e esforço, pelos ensinamentos e amizade. Obrigado por tantas vezes repetir que daria certo, que eu iria conseguir e que você tinha certeza disso. Esta conquista também é sua!
Ao Luan César, por ter me ajudado quando nem se quer me conhecia e por, nestes anos, ter sempre nos recebido de coração aberto e sorriso no rosto. À Isabel Schausltz e Juliana
Nascimento, que me acolheram e aconselharam desde o primeiro dia. Obrigado por todos os
momentos que vivemos naqueles primeiros meses. À Patrícia Fernandes, por ser esta pessoa incrivelmente autêntica, solidária e carinhosa. Serei eternamente grato por todas as vezes que me ajudou sem cobrar nada em troca. À Maria Helena, por sua alegria contagiante, pelos almoços e cafés nos finais de semana científicos. Obrigado por ser este ser de luz. À Isadora
Ferrari por toda contribuição no tempo em que estivemos juntos na Orocentro e ao Renato Assis por todos os conselhos acadêmicos e orientações em trabalhos paralelos.
À Semiologia, minha segunda casa: do café, dos bolos de sexta-feira, da alegria, do companheirismo, do desespero pré-qualificação, do artigo aceito, do artigo negado, da família tradicional brasileira... Evidências não faltam para dizer o quanto adoro todos vocês: Raísa
Sales, Bruno Mariz, Iara Aquino, Luan César, Isabel Schausltz, Patrícia Fernandes, Diego Tetzner, Mariana Paglioni, Mauricio Dourado, Leonardo Reis, Marisol Galvis, Gabriell Borgato, Rachel Lamarck, Pedro Curioso (in memorian), Juliana Nascimento e Carolina Carneiro.
Aos demais amigos e colegas da pós-graduação e até mesmo de outros programas, em especial, Rocharles Fontenele e Juliana Campos, pelas conversas, boas risadas e amizade.
À Érika Egal, pela grata surpresa nos últimos meses. Acho que algumas conexões sensoriais aconteceram e demos certo. Obrigado por me ensinar tantas coisas, por se doar de corpo e alma, por embarcar em nossas aventuras, por ser tão solícita, tão humilde, tão você. Sua originalidade me fascina. Lembrarei com carinho de todas as nossas aventuras.
Às colegas de trabalho: Leisa Lopes, Camila de Angelis e Fernanda Borges, pelas tardes produtivas, boas risadas e companheirismo.
Aos Profs. Drs. Rebeca de Souza Azevedo, Renata Tucci, Adriele Gouvêa e
Ademar Takahama Junior, profissionais que conheci na Universidade Federal Fluminense
(UFF). Se hoje estou neste caminho, em grande parte, é porque estive durante toda minha graduação sobre o ombro de gigantes como vocês.
À Prof. Daniele Garcia, que conheci ainda no Ensino Médio. Admiro sua dedicação para fazer do ensino público um ensino de qualidade. Coincidentemente, a Genética, que me apaixonei ainda em suas aulas, hoje é minha rotina de trabalho. Muito obrigado por ter contribuído para isso.
Aos meus amigos Michelle Guimarães, Gabriela Medeiros, Nathale Cruz,
Barbara Fonseca, Fernanda Ximenes, Josué Miguel, Gustavo Vieira, Natália Lucena, Rhayssa Caetano, Mario Junior, Luiz Cláudio Pessanha pela amizade sincera e incontáveis
momentos de alegria que vivemos ao longo de tantos anos. Mesmo com a distância, o incentivo de vocês me fez mais forte. Em especial, ao Antônio Miranda pela paciência e sensibilidade em dizer que Deus é bom o tempo inteiro.
Às minhas avós, Pulcéria Souza (in memorian) e Anita Scarini (in memorian), que me ensinaram a amar como se não houvesse amanhã. Aos meus padrinhos, Marlene
Juliace e Gersy Scarini, por terem sido um porto seguro e cheio de amor por todos estes anos.
À tia Regina Célia, que sempre foi meu maior exemplo de fortaleza inabalável. Às minhas tias do coração, Vanda Bizzo e Ira Rímolo, por todas as orações e vibrações positivas nestes dois anos.
À Família Brito, em nome do Seu Valdir Brito e Dona Lenir Brito, pelo acolhimento e cuidado ao longo dos últimos anos. O carinho de vocês deixou a saudade de casa mais amena.
Ao microscópio, que se tornou meu sabre de luz desde o terceiro semestre da graduação. A música – companheira de tantos experimentos, redações e pensamentos. Ao café, amigo de tantas noites. Às incertezas da vida, dificuldades, desafios e erros...
EPÍGRAFE
“O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa,
sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem. O que Deus quer é ver a
gente aprendendo a ser capaz de ficar alegre a mais, no meio da alegria, e inda mais alegre ainda no meio da tristeza! Só assim de repente, na horinha em que se quer, de propósito – por coragem. Será? Era o que eu às vezes achava. Ao clarear do dia.”
RESUMO
O carcinoma ex-adenoma pleomorfo (CXAP), também conhecido como tumor maligno misto, é um tumor agressivo que surge em um adenoma pleomorfo (AP) pré-existente. Vários estudos tentaram elucidar sua patogênese, todavia investigações acerca das alterações metabólicas ainda são preliminares em vários tumores de glândula salivar. Neste contexto, as células tumorais conseguiriam se adaptar as condições de baixa tensão de oxigênio ativando vias de sobrevivência, como a ativação do fator de transcrição induzido por hipóxia 1 alfa (HIF-1α). Por outro lado, níveis aumentados do gene facilitador do membro 1 do transportador de glicose (GLUT-1), que possui alta afinidade pela glicose, já foram relatados em diferentes tipos de cânceres. O aumento da expressão da enzima ácido graxo sintase (FASN), que sintetiza ácidos graxos (AG) de cadeia longa, vem sendo relacionada à lipogênese aumentada, marca do metabolismo reprogramado no câncer. Como consequência, elevados níveis de lipídios elevariam a biogênese das gotas lipídicas (GL), que se acumulariam nas células. Por sua vez, a expressão de adipofilina, proteína relacionada com a GL, também estaria aumentada. Deste modo, foram analisadas por qRT-PCR a expressão de marcadores do metabolismo glicolítico (HIF-1α e GLUT-1) e lipídico (FASN e adipofilina) em 9 amostras de tecidos congelados de glândula salivar normal (GSN), 13 AP, 10 CXAP e 4 AP residuais. Validamos as reações por imunoistoquímica e verificamos se existem diferenças na expressão destes marcadores no desenvolvimento do CXAP. Nossos resultados mostraram que não houve diferença estatisticamente significante na expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α entre os tecidos estudados, enquanto a expressão gênica e imunoistoquímica de FASN tendeu a aumentar nos tecidos tumorais quando comparado com os normais. O gene GLUT-1 foi significativamente mais expresso (p<0,01) em AP e CXAP do que em GSN enquanto a expressão da proteína foi predominantemente maior em CXAP do que em GSN e AP. Em contraste, o gene adipofilina foi significativamente mais expresso (p<0,01) em tecidos normais enquanto a expressão da proteína aumento na sequência GSN-AP-CXAP. Portanto, os dados aqui apresentados sugerem que as células da GSN, quando se tornam neoplásicas, reprogramem a expressão de GLUT-1 e adipofilina para se adaptar ao microambiente tumoral e reforçam, por meio dos resultados da imunoistoquímica, possíveis mecanismos reguladores transcricionais e pós-traducionais que podem agir sobre a expressão destes genes.
Palavras-chave: Adenoma pleomorfo. Carcinoma ex-adenoma pleomorfo. Metabolismo
ABSTRACT
Carcinoma ex-adenoma pleomorphic (CXPA), or mixed malignant tumor, is an aggressive tumor that appears in a pre-existing pleomorphic adenoma (PA). In the last decades, several genetic and immunohistochemical studies have tried to elucidate the pathogenesis related to the development of CXPA, however investigations about the metabolic alterations are preliminary in several tumors of the gland. Tumor cells, when in hypoxia, can adapt to low oxygen tension conditions by activating survival pathways. The most recognized pathway adopted by hypoxic cells is the activation of the transcription factor induced by hypoxia 1 alpha (HIF-1α). However, increased levels of GLUT-1 that has high affinity for glucose have been reported in different types of cancers. Increased expression of the fatty acid synthase (FASN) enzyme, which synthesizes long chain fatty acids (FA), has been linked to to increased lipogenesis, the hallmark of reprogrammed metabolism in cancer. As a consequence, high lipid levels would increase the biogenesis of lipid droplets (GL), which would accumulate in cells. In turn, the expression of adipophylline, GL-related protein, would also be increased. Thus, the expression markers of the glycolytic metabolism (HIF-1α and GLUT-1) and lipid metabolism (FASN and Adipophilin) were analysed by the qRT-PCR method in 9 samples of frozen tissues of normal salivary gland (NSG), 13 PA, 10 CXPA and 4 residual PA. The reactions were validated by immunohistochemistry and differences in the expression of these markers in the development of CXAP were also analysed. Our results showed that there was no statistically significant difference in HIF-1α gene expression and immunohistochemistry among the tissues studied, while FASN gene expression and immunohistochemistry tended to increase in tumor tissues when compared to normal tissues. GLUT-1 was significantly more expressed (p<0.01) in PA and CXPA than in normal tissues, although protein is mainly expressed in transformed cells than in PA and NSG. In contrast, adipophilin (p<0.01) was significantly more expressed in NSG than in tumor tissues while the expression of the protein was lower in NSG and higher in tumor tissues. Therefore, the data presented here suggest that NSG cells, as they become neoplastic, reprogram the expression of GLUT-1 and adipophilin to adapt to the tumor microenvironment. The gene expression findings were reinforced through immunohistochemical results and suggest that possible transcriptional and post-translational regulatory mechanisms may be involved on the expression of these genes.
Keywords: Pleomorphic adenoma. Carcinoma ex pleomorphic adenoma. Tumor metabolism.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACACA – Malonil-CoA pela Acetil-Coa Carboxilase
ADPR – Proteína Relacionada à Diferenciação de Adipócitos
AFIP – Armed Forces Institute Of Pathology – Instituto de Forças Armadas da Patologia AG – Ácido Graxo
AKT – Proteína Quinase B
AO-519 – Antígeno Oncogênico-519 AP – Adenoma Pleomorfo
ARNT – Receptor de Hidrocarboneto de Arila ATP – Adenosina Trifosfato
BSA – Albumina Sérica Bovina CBP – Proteína de Ligação a CREB CoA – Acetil-Coenzima A
CT – Limite do Ciclo C-TAD – Terminal COOH
CXAP – Carcinoma Ex-Adenoma Pleomorfo DAB – Diaminobenzidina Tetra-Hidroclorídrica E3 – Proteína Ligase de Ubiquitina E3
EGFR – Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico ERK1-2 – Sinal Quinase
FASN – Enzima Ácido Graxo Sintase FBI-1 – Proto-Oncogene Pokemon
FDG-PET – Tomografia por Emissão de Pósitrons de 18F-Deoxi-Glicose FIH-1 – Fator Inibidor de HIF-1
GL – Gotas Lipídicas
GLUT – Transportadores de Glicose
GLUT-1 – Facilitador do Membro 1 do Transportador de Glicose GP – Glândula Parótida
GS – Glândula Submandibular GSL – Glândula Sublingual
GSMA – Glândula Salivar Maior GSME – Glândula Salivar Menor GSN – Glândula Salivar Normal H2O2 – Peróxido de Hidrogênio HE – Hematoxilina e Eosina
HIF – Fator de Transcrição Induzido por Hipóxia
HIF-1α – Fator de Transcrição Induzido por Hipóxia 1 Alfa HMGA2 – Grupo de Alta Mobilidade Humana A
HMIT – H+/Myo-Inositol Transporter
Hsp90 – Inibidores da Proteína 90 do Choque Térmico IARC – Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer IGF-I – Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I IRS – Receptor de Insulina
kD - Kilodaltons
MALT – Tecido Linfoide Associado à Mucosa Mdm2 – Homólogo do Duplo Minuto 2 do Rato MEK – Proteína Quinase Ativada por Mitógeno mTOR – Alvo Mecanicista da Rapamicina MYC – Proto-Oncogene N-MYC
NADPH – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
NCBI – National Center for Biotechnology Information – Centro Nacional de Informação Biotecnológica
ng – Nanograma nm – Nanômetro
N-TAD – Terminal NH2
OCT – Optimal Cutting Temperature – Composto com Temperatura de Corte Ideal ODDD – Domínio de Degradação de Oxigênio
OMS – Organização Mundial de Saúde
OXPAT – Proteína de Gotículas Lipídicas do Miocárdio P300 – Homólogo p300 da Proteína de Ligação a CREB PBS - Solução Tampão Fosfato-Salino
pH – Potencial Hidrogeniônico PHD – Prolil Hidroxilases
PI3K – Fosfatidil Inositol-4,5-Bisfosfato-3-Quinase PLAG1 – Gene 1 do Adenoma Plemorfo
PPAR – Receptor Ativado por Proliferados de Peroxissomas PTEN – Gene Supressor de Tumor
pVHL – Proteína Von Hippel-Lindau
qRT-PCR – Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real qsp – ‘Quantidade Suficiente Para’
RHEB – Homólogo RAS Enriquecido no Cérebro RNA – Ácido Ribonucleico
mRNA – RNA mensageiro
SLC2A – Família de Portadores de Soluto 2 SOE – Sem Outra Especificação
SREBP-1c – Proteína de Ligação ao Elemento Regulador de Esterol TAD – Domínios de Transativação
TIP47 – Proteína que Interage na Cauda de 47kD TP53 – Gene Supressor de Tumor P53
USP2a – Protease 2a Específica de Ubiquitina μl – Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 REVISÃO DA LITERATURA 21
ADENOMA PLEOMORFO E SUA TRANSFORMAÇÃO MALIGNA 21
CARCINOMA EX-ADENOMA PLEOMORFO 25
METABOLISMO NA PATOGÊNESE DO CÂNCER 29
2.3.1 Efeito de Warburg 30
2.3.2 Microambiente tumoral e o fator de transcrição induzido por hipóxia 1α 32 2.3.3 Microambiente tumoral e o transportador de glicose 1 36 2.3.4 Microambiente tumoral e a enzima ácido graxo sintase 39 2.3.5 Microambiente tumoral, gotas lipídicas e a adipofilina 42
ALTERAÇÕES METABÓLICAS NO DESENVOLVIMENTO DO CXAP 44
3 PROPOSIÇÃO 46
PROPOSIÇÃO GERAL 46
PROPOSIÇÕES ESPECÍFICAS 46
4 MATERIAL E MÉTODOS 47
DESENHO EXPERIMENTAL 47
ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DA AMOSTRA 48
ANÁLISE MORFOLÓGICA DA PEÇA CIRÚRGICA 48
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA 49
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA 51
ANÁLISE ESTATÍSTICA 53
5 RESULTADOS 54
ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DA AMOSTRA 54
ANÁLISE MORFOLÓGICA DA CONGELAÇÃO E DA PEÇA CIRÚRGICA 57
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA 60
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA 63
CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA 70
6 DISCUSSÃO 73
7 CONCLUSÃO 82
EXPRESSÃO GÊNICA 82
EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA 82
CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA 83
REFERÊNCIAS* 84
APÊNDICES 108 APÊNDICE 1 – Fichas de avaliação utilizadas para análise neste estudo 108 APÊNDICE 2 – Análise microscópica dos fragmentos de tecido utilizados neste estudo 111 APÊNDICE 3 – Análise da integridade de amostras de GSN e AP utilizadas neste estudo 113 APÊNDICE 4 – Análise das expressões gênicas alteradas (outliers) neste estudo 114
ANEXOS 116
ANEXO 1 – Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa FOP/UNICAMP 116
1 INTRODUÇÃO
Estudos estimam que 0,5 a 3% das neoplasias malignas que acometem o corpo humano se originam em uma glândula salivar (Frazell, 1954; Batsakis e Regezi, 1979; Chatterjee e Panda, 2000; Speight e Barret, 2002; Lam et al., 2015). Em 2018, segundo a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC) cerca de 50 mil casos de neoplasias malignas de glândulas salivares foram relatados, sendo 1462 apenas no Brasil. Estima-se para o ano de 2040 o surgimento de aproximadamente 80 mil novos casos no mundo, dos quais 2554 ocorrerão na população brasileira. Além disso, cerca de 450 pacientes morreram em decorrência desta doença no Brasil no último ano (Ferlay et al., 2019).
Os tumores de glândula salivar representam um grupo muito diversificado e heterogêneo de neoplasias benignas e malignas com características e comportamento biológico complexos (Batsakis et al., 1983; Chatterjee e Panda, 2000; Lubin et al., 2018; Carlson e Schlieve, 2019). Dentre estes, o adenoma pleomorfo (AP) e o carcinoma ex-adenoma pleomorfo (CXAP) constituem um interessante modelo para o estudo dos mecanismos relacionados com a transformação maligna (Altemani et al., 2005; Mariano et al., 2013).
AP ou tumor misto é a neoplasia mais comum das glândulas salivares e representa aproximadamente 50-60% destes tumores (Evenson e Cawson, 1985; Spiro, 1986; Dulguerov et al., 2017; Bell et al., 2017; Silva et al., 2018). Pacientes de todas as faixas etárias podem ser acometidos, embora uma maior prevalência em mulheres entre a 5ª e 6ª década de vida possa ser observada (Eveson e Cawson, 1985; Lopes et al., 2017; Bell et al., 2017; Espinosa et al., 2018). Os tumores surgem, principalmente na glândula parótida (GP), seguida pelas glândulas salivares menores (GSME) do palato e glândula submandibular (GS) e apresentam-se, na maioria dos casos, como nódulos discretos, assintomáticos e de crescimento lento (Eveson e Cawson, 1985; Panoussopoulos et al., 2002; Jorge et al., 2002; Korba et al., 2017). Apesar de benignos, 40% dos AP podem se tornar refratários ao tratamento inicial, sendo esta recorrência associada à técnica cirúrgica empregada (Henriksson et al., 1998; Abu-Ghanem et al., 2016). Além disso, a transformação maligna para um CXAP pode ocorrer em aproximadamente 6% de todos os casos (Chooback et al., 2017; Singh et al., 2017; Silva et al., 2018).
CXAP, também conhecido como tumor maligno misto, é descrito como um tumor raro e agressivo. Sua prevalência representa aproximadamente 3% a 5% de todas as neoplasias de glândulas salivares e 11,6% de todas as neoplasias malignas nesta localização anatômica (Mariano et al., 2013; Hu et al., 2016; Chooback et al., 2017; Sedassari et al., 2017). Manifesta-se geralmente na 6ª e 7ª décadas de vida, preferencialmente em mulheres e frequentemente
afetando a GP, mas podendo acometer também GS e GSME (Sedassari et al., 2017; Seethala e Stenman, 2017). Histologicamente, CXAP são subclassificados quanto à invasão, em (1) carcinoma intracapsular (contido pela cápsula do AP pré-existente), (2) minimamente invasivo (infiltração do tecido extracapsular a uma distância ≤ 1,5mm) e francamente invasivo (infiltração > 1,5mm). CXAP intracapsular e minimamente invasivo tendem a exibir comportamento biológico de baixo grau, semelhante ao do AP com margens livres. Em contraste, o CXAP francamente invasivo apresenta comportamento mais agressivo e está associado ao aparecimento de metástases, ocorrência de recidivas e piores taxas de sobrevida (Zbären e Stauffer, 2007; Hu et al., 2016; Ihrler et al., 2017; Williams et al., 2017; Seethala e Stenman, 2017; de Morais et al., 2019).
A literatura científica tem sido enriquecida com importantes trabalhos que visam esclarecer os mecanismos de transformação maligna do AP, embora a exata patogênese de sua carcinogênese permaneça obscura (Sedassari et al., 2017; Asahina et al., 2019; de Morais et al., 2019). Recentemente, o avanço do conhecimento genético no CXAP tem demonstrado que a sua patogênese pode estar associada ao acúmulo de alterações moleculares no AP (Sedassari et al., 2017). O estudo do metabolismo, por outro lado, entusiasmado nas últimas décadas (mesmo em outros tumores de glândulas salivares) ainda carece de mais investigações (Shinozaki et al., 2008; Roh et al., 2008; Ito et al., 2009; Demasi et al., 2010; do Prado et al., 2011; Kim et al., 2011; Mariano et al., 2013; Urano et al., 2015; Wang et al., 2015; dos Santos et al., 2016; de Souza et al., 2017; Soares et al., 2018; Branco et al., 2019; Cardoso et al., 2019; Díaz et al., 2019).
Neste contexto metabólico, sabe-se que as células malignas são caracterizadas pela sua elevada capacidade de divisão, o que aumenta sua demanda de energia e macromoléculas – percepção brilhantemente descrita por Otto Warburg e colaboradores em 1924 e mais bem referida como Efeito de Warburg (Warburg et al., 1924). Segundo este fenômeno, na presença de oxigênio as células normais usariam as mitocôndrias para metabolizar a glicose em adenosina trifosfato (ATP), por meio da fosforilação oxidativa. No câncer, sob condições anaeróbicas, as células produziriam grandes quantidades de lactato por meio da glicólise aeróbica, o que propiciaria não só a proliferação celular como também a manutenção e progressão da doença (Warburg et al.,1924; Cori e Cori, 1925; Warburg, 1927; Mokrowiecka et al., 2017; Schcolnik-Cabrera et al., 2018).
Em tumores sólidos, à medida que a neoplasia se expande rapidamente, as células malignas formam grandes massas tumorais, que levam à obstrução e compressão dos vasos sanguíneos em torno dessas massas e/ou ultrapassam os limites de difusão de seu suprimento
sanguíneo local. Seja qual for a forma, a progressão tumoral levará à hipóxia e à estabilização do fator de transcrição induzido por hipóxia 1 alfa (HIF-1α) (Wang e Semenza, 1993; Masoud e Li, 2015; Schito e Semenza, 2016; Huang et al., 2018). Além disso, a fim de alcançar uma taxa glicolítica que é aproximadamente 30 vezes maior do que o normal, as células neoplásicas absorvem glicose rapidamente e em altas taxas. Os transportadores de glicose (GLUT) são essenciais neste processo e permitem o transporte de glicose por um mecanismo de difusão facilitada (Rumsey et al., 1997; Macheda et al., 2005; Barron et al., 2016; Galochkina et al., 2019). A expressão do transportador de glicose 1 (GLUT-1) pode ser induzida pelo fator HIF-1α em células malignas e tanto a expressão de GLUT-1 como HIF-HIF-1α vem sendo relatada e relacionada com metabolismo glicolítico e invasão (Takata et al., 1990; Joost e Thorens, 2001; Zhao e Keating, 2007; Denko, 2008; Vaupel e Mayer, 2014; Kujan et al., 2017; Seleit et al., 2017; Soni e Padwad, 2017; Harrison et al., 2018).
Os lipídios, por sua vez, são biomoléculas importantes para o metabolismo e armazenamento de energia, compõem membranas celulares e atuam como moléculas de sinalização (Röhrig e Schulze, 2016). Muitos deles são sintetizados a partir de ácidos graxos (AG), constituintes essenciais de todos os lipídios da membrana celular e importantes substratos para o metabolismo energético (Menendez e Lupu, 2007). A enzima ácido graxo sintase (FASN) é responsável pela biossíntese endógena de AG de cadeia longa, necessária para manter principalmente um fornecimento constante de lipídios para produção de fosfolipídios de membrana. Vários estudos demonstraram que FASN desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral (Flavin et al., 2010; Bauerschlag et al., 2015; Lu et al., 2018).
Gotas lipídicas (GL) são encontradas no citoplasma de quase todos os tipos de células e desempenham um papel importante na homeostase lipídica celular. São constituídas por um centro rico em lipídios e recobertas por uma camada única de fosfolipídios e inúmeras proteínas, ao qual se inclui a adipofilina (Brasaemle, 2007; Boussahmain et al., 2013). A adipofilina (ou perilipina-2 ou proteína relacionada com a diferenciação de adipócitos – ADPR) vem sendo correlacionada com a tumorigênese por meio da adaptação à hipóxia (Saarikoski et al., 2002; Conte et al., 2016; Westhoff et al., 2017) e no microambiente tumoral, o aumento de sua expressão vem sendo relatada em vários tumores nos últimos anos, como linfoma de Burkitt, câncer colorretal, adenocarcinoma de pulmão, melanomas, lipossarcomas e sarcomas não lipomatosos e carcinoma renal de células claras (Matsubara et al., 2011; Ambrosio et al., 2012; Zhang et al., 2014; Westhoff et al., 2016; Fujimoto et al., 2016; Fiorentzis et al., 2017; Tolkach et al., 2017; Cao et al., 2018; Song et al., 2019).
Diante disso, a partir do crescente papel do metabolismo no desenvolvimento e progressão tumoral, este estudo teve como objetivo verificar a expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina na progressão sequencial do AP para CXAP.
2 REVISÃO DA LITERATURA
ADENOMA PLEOMORFO E SUA TRANSFORMAÇÃO MALIGNA
AP ou tumor misto é a neoplasia mais comum das glândulas salivares e representa aproximadamente 50-60% destes tumores (Eveson e Cawson, 1985; Spiro, 1986; Bell et al., 2017; Dulguerov et al., 2017; Silva et al., 2018). Segundo dados do Instituto de Patologia das Forças Armadas dos Estados Unidos (AFIP) o AP constitui 66% dentre todos os tumores benignos, sendo 67% dos benignos de GSMA e 63% dos de GSME (Ellis e Auclair, 2008). Podem ocorrer em qualquer local onde o tecido salivar é encontrado. A maioria surge na GP, seguida pelas glândulas salivares menores do palato e GS. Dentre outras localizações, em sequência decrescente de acometimento, podem acometer mucosa jugal e o lábio superior, sendo raros em lábio inferior e língua. Em glândulas lacrimais, o AP representa a neoplasia epitelial mais comum, correspondendo a 50% dos tumores epiteliais desta localização (von Holstein et al., 2013; Harrison et al., 2018). Entretanto, em raros casos já foram encontrados no conduto auditivo externo, cavidade nasal, seio maxilar e nasofaringe (Sciandra et al., 2008; Vento et al., 2016; Bowman et al., 2019). Além disso, AP formam cerca de 0,8% de todas as neoplasias primárias de glândulas salivares na traqueia (Gaissert e Mark, 2006).
Dados epidemiológicos revelam que a idade média dos pacientes acometidos por esta neoplasia é de 43 anos, sendo mais prevalente entre a 5ª e 6ª década de vida (Eveson e Cawson, 1985; Bell et al., 2017; Lopes et al., 2017; Espinosa et al., 2018). Há discreta predileção pelo sexo feminino e aproximadamente 17% dos pacientes têm menos de 30 anos de idade (pico de prevalência entre os 20 e 29 anos). Além disso, mesmo que incomuns, AP podem acometer crianças e adolescentes (Eveson e Cawson, 1985; Jorge et al., 2002; Bell et al., 2017; Lopes et al., 2017; Espinosa et al., 2018).
Clinicamente, como esperado para lesões benignas de glândulas salivares, AP apresentam-se normalmente como nódulos palpáveis bem definidos, discretos e móveis, geralmente assintomáticos e de crescimento lento, mas que podem evoluir para grandes massas, caso não sejam tratados (Panoussopoulos et al., 2002). Quanto aos sintomas, a queixa mais comum é de uma assimetria do ângulo mandibular e da região pré-auricular, bem como um abaulamento ou massa móvel bem definida que não está aderida à pele. Normalmente a presença de sintomas está acompanhada do aumento de tamanho, que produz sensação de dor, embora o traço característico seja a falta de paralisia facial, mesmo que o tumor atinja um tamanho exacerbado (Korba et al., 2017).
Macroscopicamente, em GSM, AP apresentam-se como amostras únicas e arredondadas, bem delimitadas e encapsuladas, de tamanho variável. Tumores de GSME, ao contrário, tendem a ser não não-encapsulados e pouco delimitados. À superfície de corte, exibem coloração branca e brilhante, e sua consistência varia de amolecida a fibrosa, a depender da quantidade de estroma (Ellis e Auclair, 2008; Skálová et al., 2012). Microscopicamente, a assinatura do AP é o pleomorfismo arquitetural. É notoriamente reconhecido que os elementos epiteliais e glandulares se misturam em quantidades variáveis de estroma extracelular (mucoide, mixoide ou condroide). Tem sido proposto que a neoplasia seja classificada de acordo com a composição relativa de componentes celulares e estromais em (1) AP hipocelular ou mixoide - com estroma rico (50-80% de estroma), (2) AP clássico – com equilíbrio entre os componentes (30 a 50% de estroma) e (3) AP hipercelular (com menos que 30% de estroma). AP mixóides são mais comuns e representam mais da metade dos casos, seguidos pelo subtipo clássico e, por último, hipercelular (Naeim et al., 1976; Seifert et al., 1976; Stennert et al., 2001; Webb e Eveson et al, 2001; Zbären e Stauffer, 2007; Park et al., 2012; Dulguerov et al., 2017). Em GSMA, os AP são envolvidos por uma camada de tecido fibroso denominada cápsula, que geralmente está incompleta em 69% dos AP mixóides, 30% dos AP clássicos e 18% dos AP hipercelulares (Naeim et al., 1976). Além disso, em alguns casos, nódulos tumorais vistos como protuberâncias nas bordas do tumor e separados por tecido fibroso da massa tumoral principal (mas ainda dentro da cápsula principal do tumor) podem ser encontrados e são referidos como pseudópodes. Estes são diferentes dos nódulos tumorais que se configuram na vizinhança da neoplasia, aproximadamente 5-8,5mm do nódulo tumoral principal, melhor referidos como nódulos satélites, muito mais frequentes em tumores maiores (Stennert et al., 2001; Zbären e Stauffer, 2007; Orita et al., 2010; Park et al., 2012; Li et al.; 2014; Dulguerov et al., 2017). No mais, em 5% dos AP, ainda podem ser encontrados vários tipos de cristaloides, como cristaloides colágenos e cristaloides ricos em tirosina, estruturas morfologicamente compostas por fibras eosinofílicas que compreendem colágeno tipo I e III (Campbell et al., 1985; Skalova et al., 1992; Bellizzi e Mills, 2008; Okano et al., 2019).
O tratamento de referência é a excisão cirúrgica completa da neoplasia primária, sem necessidade de tratamento adjuvante de rotina (Loughlin et al., 2019). As opções incluem enucleação, parotidectomia superficial e parotidectomia total. Recentemente, a dissecção extracapsular tornou-se mais comum, envolvendo a excisão do tumor encapsulado com tecido normal saudável, sem dissecção do nervo facial (Sood et al., 2016). A parotidectomia parcial e a dissecção extracapsular estão associadas a taxas de recidiva de 2-5%, enquanto a radical é de
apenas 0-0,4% e com estudos anteriores na literatura relatando taxas de recorrências para a enucleação entre 20 e 45% (Dulguerov et al., 2017; Loughlin et al., 2019).
A recorrência, que normalmente ocorre de 2-15 anos após cirurgias iniciais pode estar relacionada aos fatores que constituem a identidade microscópica do tumor, bem como àqueles inerentes e relacionados à cirurgia (Abu-Ghanem et al., 2016). Quanto as variáveis relacionadas à microscopia, a espessura da cápsula ou a falta dela, pseudopodia, nódulos satélites e o tamanho do tumor estão mais bem categorizados como agentes causais neste contexto. Quanto as variáveis relacionadas à cirurgia, a excisão inadequada relacionada ao tipo de cirurgia, as margens cirúrgicas positivas ou menores que 1mm, a punção tumoral durante a cirurgia (rompimento da cápsula do tumor) e/ou derramamento tumoral no campo cirúrgico, predispõem a recorrência (Henriksson et al., 1998; Stennert et al., 2001; Zbären e Stauffer, 2007; Orita et al., 2010; Park et al., 2012; Li et al.; 2014; Dulguerov et al., 2017), que são mais frequentes no subtipo mixoide (onde a cápsula é mais fina e incompleta) e hipocelular (Patey e Thackray et al., 1958; Seifert et al., 1976; Skalova et al., 2012; Robertson et al., 2014). Por último, segundo alguns estudos, o acometimento inicial da neoplasia em idades mais precoces também favorece a recorrência (McGregor et al., 1988; Abu-Ghanem et al., 2016; Andreasen et al., 2016).
AP recorrentes são frequentemente multinodulares (50-100%) (Stennert et al., 2004; Abu-Ghanem et al., 2016) e normalmente estão associados com um aumento na taxa de complicações pós-operatórias (o risco de lesão do nervo facial é maior), na taxa de re-recorrência e na transformação maligna (0–16%) (Andreasen et al., 2016; Dulguerov et al., 2017; Chooback et al., 2017; Singh et al., 2017; Silva et al., 2018).
Na transformação maligna do AP, de modo simplório, o CXAP representaria a transformação carcinomatosa do componente epitelial dentro de um AP. Alguns autores mensuraram o risco desta transformação, que segundo suas conclusões, aumentaria com a duração da doença: 1,5% aos 5 anos e 10% após 15 anos (Singh et al., 2017). Em contrapartida, para AP negligenciados por longa data, o potencial de transformação aumentaria e estima-se que 2 a 40% dos pacientes estariam propensos a desenvolver a neoplasia maligna (Abu-Ghanem et al., 2016). Além do mais, para pacientes com recorrências de AP, a taxa de transformação maligna seria de 3,3% (Andreasen et al., 2016). Um estudo recente, no entanto, estimou outros indicadores de risco para a progressão do AP para CXAP por meio de modelos matemáticos. Regressões ordinais uni e multivariadas evidenciaram que o tamanho do tumor e a idade do
paciente também são fatores de risco independentes para a transformação maligna dos AP (Egal et al., 2018).
Neste contexto, vários fatores foram implicados ao desenvolvimento do CXAP, principalmente concernentes a célula mioepitelial (Martins et al., 2005; de Araújo et al., 2006; de Araújo et al., 2007; Silva et al., 2015). Intrigantemente, foi evidenciado que durante a progressão maligna, células mioepiteliais – que circundam as células epiteliais malignas do lúmen – se tornariam mais diferenciadas e produziriam grandes quantidades de matriz extracelular e maior concentração de maspina (Sternlicht e Barsky; 1997; Barsky, 2003; Martins et al., 2005; de Araújo et al., 2006). Assim, as áreas de carcinoma que se desenvolveriam dentro do ducto, seriam separadas do estroma por uma barreira formada por células mioepiteliais benignas, mas diferenciadas (Martins et al., 2005; de Araújo et al., 2006; Ye et al., 2017).
Mesmo que a célula mioepitelial tenha um papel importante na contenção das células epiteliais malignas, pelo menos na transformação maligna do AP, seus mecanismos parecem falhar e elas tendem a desaparecer à medida que o tumor avança (Silva et al., 2015). Por outro lado, referente a transformação das células mioepiteliais, o reconhecimento de uma neoplasia verdadeiramente maligna é mais desafiador e os processos implícitos na transformação ainda são pouco explorados. Ao que parece, esses tumores carecem de pleomorfismo celular e a identificação de um crescimento invasivo é mandatório para o diagnóstico de malignidade (Sedassari et al., 2017).
De todo modo, parece mais correto assumir que a patogênese da transformação maligna do AP, independente da histogênese luminal ou mioepitelial, ainda não é clara. Todavia, é inegável que um grande avanço tem sido alcançado nos últimos anos, principalmente no que diz respeito a importância da instabilidade genômica, refletida nas modificações epigenéticas e mutações sucessivas associadas a doença (de Morais et al., 2019). Adicionalmente, rearranjos e fusões relacionadas com o gene 1 do AP (PLAG1) e grupo de alta mobilidade humana A (HMGA2) foram relatadas, mesmo que ainda pouco se conheça sobre os reais impactos destes mecanismos gênicos sobre a patogênese da transformação (Asahina et al., 2019).
CARCINOMA EX-ADENOMA PLEOMORFO
O CXAP, também conhecido como tumor maligno misto, é descrito como uma neoplasia rara e agressiva, que surge em um AP e que possui patogênese pobremente entendida. Sua prevalência representa aproximadamente 3% a 5% de todas as neoplasias de glândulas salivares e 11,6% de todas as neoplasias malignas que acometem estes sítios (Mariano et al., 2013; Hu et al., 2016; Chooback et al., 2017; Sedassari et al., 2017). Interessantemente, a última edição do texto da OMS esclareceu que o diagnóstico de CXAP não deve ser mais considerado como autossuficiente, sendo sua biologia reflexo do fenótipo carcinomatoso desenvolvido no AP e da sua extensão além da cápsula do AP pré-existente (como revisado em Williams et al., 2017; Seethala e Stenman, 2017).
O tempo de evolução da doença é geralmente longo, podendo variar de meses até décadas (média de nove anos). A apresentação clínica mais comum do CXAP é similar àquelas comuns em todas as neoplasias malignas das glândulas salivares, onde um nódulo ou aumento de volume acomete a área da glândula salivar acometida, com crescimento lento, assintomático, mas que logo cursa com sintomas adjacentes significativos (como dor, crescimento rápido, fixação nas estruturas adjacentes, envolvimento dos nervos ou metástase cervical) (Olsen e Lewis, 2001; Lüers et al., 2009). A dor é consequência da extensão do tumor para tecidos adjacentes e consequente envolvimento dos ramos do nervo facial (Zbären e Stauffer, 2007; Hu et al., 2016).
Quanto ao sítio anatômico acometido, frequentemente afetam a GP (67%), ainda que possam surgir também na GS (15%), GSL (<1%) e GSME (18%), principalmente naquelas localizadas no palato (Moberger e Eneroth et al., 1968; Mariano et al., 2013; Seethala e Stenman, 2017; Singh et al., 2017). Embora raro, CXAP também foram descritos em glândula lacrimal, mama, traqueia e cavidade nasal (Cho et al., 1995; Baredes et al., 2003; Hayes et al., 2005; Ding et al., 2007). Manifestam-se geralmente na 6ª e 7ª décadas de vida (cerca de 1 a 2 décadas mais tarde do que no AP), com trabalhos relatando predileção pelo sexo masculino (Lewis et al., 2001; Stodulski et al., 2007; Lim et al., 2015; Hu et al., 2016; Ye et al., 2016; Suzuki et al., 2016), feminino ou nenhuma predileção por sexo (Matsubayashi e Yoshihara, 2007; Mariano et al., 2013; Sedassari et al., 2017).
Macroscopicamente, na grande maioria dos casos, apresentam limites pouco definidos, com infiltração do parênquima glandular normal e estruturas adjacentes. Focos de necrose e hemorragia podem ser revelados à superfície de corte (Ellis e Auclair, 2008). Microscopicamente, as neoplasias epiteliais que surgem em um AP abrangem um amplo
espectro de padrões histológicos. Mais frequentemente, apenas um tipo histológico é encontrado, ainda que mais de um subtipo possa estar presente (Rosa et al., 1996; Lewis et al., 2001; Mariano et al., 2013).
Por definição, CXAP deve surgir em associação com um componente benigno, que exige evidência histológica de AP coexistente ou pré-existente (diagnóstico histológico prévio). Normalmente, a neoplasia maligna pode ser dividida em dois grupos principais, a considerar seu componente celular alterado: (1) carcinomas apenas com diferenciação epitelial (luminal), provavelmente derivadas de células já comprometidas com a diferenciação das células do lúmen ductal e (2) carcinomas com um componente mioepitelial, provavelmente derivadas de um precursor comum entre as células mioepiteliais e ductais – as células bipotentes (Sato et al., 1984; Altemani et al., 2005).
Além disso, o conceito de estratificação por invasão, parece ter sido mais bem aceito e expandido nos dois últimos anos. Com isso, o tumor passa a ser classificado quanto à extensão além de sua cápsula em (1) carcinoma não invasivo – intracapsular (contido pela cápsula), (2) minimamente invasivo (infiltração do tecido extracapsular a uma distância ≤ 1,5mm) e francamente invasivo (infiltração >1,5 mm) (LiVolsi e Perzin, 1977; Hu et al., 2016; Williams et al., 2017; Seethala e Stenman, 2017; de Morais et al., 2019).
O diagnóstico histológico nem sempre é simples, primeiramente porque o próprio AP pode apresentar características histológicas atípicas (embora genuínas) e segundo porque a porção maligna pode substituir completamente o AP residual, que a depender do tamanho da área transformada, pode estar restringido a pequenas áreas hialinizadas (Lewis et al., 2001). Além disso, AP podem ser camuflados pelo carcinoma ou ainda apresentar alterações degenerativas, como cicatrizes, calcificações distróficas, necrose e hemorragia (Di Palma, 2013).
Segundo a história evolutiva do CXAP, o componente carcinomatoso está primeiramente contido pela cápsula do AP (Logasundaram et al., 2008). Como visto, durante a transformação das células luminais presentes nas estruturas tubulares neoplásicas, as células mioepiteliais seriam provavelmente estimuladas para alcançar uma diferenciação, na tentativa de impedir a progressão. Este mioepitélio modificado vai à medida que os ductos vão se dilatando preenchidos por células carcinomatosas, se comprimindo e desaparecendo (Altemani et al., 2005). Além disso, a ruptura da membrana basal confinante das estruturas ductais permite a infiltração consecutiva das células malignas na matriz do AP. Independente da origem (células luminais ou mioepiteliais), a partir deste momento, à medida que evolui, a neoplasia tende a ser mal definida e infiltrar o tecido glandular salivar adjacente. A área transformada, geralmente
apresenta contraste morfológico das áreas benignas, com células malignas apresentando pronunciado pleomorfismo nuclear e aumento do número de mitoses. Invasão perineural, vascular e linfática, necrose e hemorragia normalmente aumentam à medida que o tumor invade a cápsula e torna-se francamente invasivo (Di Palma, 2013) (Figura 2).
Figura 2 – Ilustração esquemática evidenciando a progressão do AP para CXAP de acordo com a célula transformada. Em A, o componente carcinomatoso está primeiramente contido pela cápsula do AP (CXAP intracapsular). À medida que há ruptura da membrana basal confinante nas estruturas ductais, a infiltração alcança a matriz do AP. Em B, transformação da célula mioepitelial, que nos estágios iniciais de proliferação ainda está contida pela cápsula do AP (CXAP intracapsular). Independente da origem, a partir do momento em que alcançam a matriz do AP, à medida que evoluem, infiltram o tecido extracapsular: CXAP minimamente invasivo (infiltração do tecido extracapsular a uma distância ≤ 1,5mm) e francamente invasivo (infiltração > 1,5mm)
Adaptado de Williams et al., 2017
Carcinomas compostos apenas por células luminais estão mais suscetíveis a se desenvolver em um AP e podem ser, normalmente, adenocarcinoma SOE ou carcinoma do ducto salivar (Ihrler et al., 2017). Os achados na literatura suportam a hipótese de que um carcinoma intraductal é necessário como uma lesão precursora obrigatória (excluindo-se carcinomas com diferenciação mioepitelial) (Ihrler et al., 2017). Porém, mesmo que raros, casos
de carcinoma mucoepidermoide, carcinoma de células acinares, carcinoma sarcomatóide, carcinoma epidermoide, carcinoma indiferenciado, carcinoma oncocítico, carcinoma de células basais, carcinosarcoma e adenocarcinoma de células claras já foram descritos (LiVolsi e Perzin et al., 1977; Spiro et al., 1977; Tortoledo e Luna, 1984; Gnepp, 1993; Olsen e Lewis, 2001; Altemani et al., 2005; Mariano et al., 2013; Endo et al., 2018).
CXAP com componente mioepitelial, por outro lado, também são relatados, embora sejam menos comuns do que CXAP com apenas diferenciação epitelial. Podem ser subdivididos em carcinomas que exibem tanto malignidades epiteliais e mioepiteliais quanto àqueles com malignidade mioepitelial exclusiva (Demasi et al., 2010; Antony et al., 2012). Normalmente, carcinomas com diferenciação mioepitelial podem se apresentar como carcinoma mioepitelial, carcinoma epitelial-mioepitelial, carcinoma adenoide cístico e adenocarcinoma polimorfo (Altemani et al., 2005; Kim et al., 2011). No entanto, quando apenas as células mioepiteliais se transformam, os carcinomas mioepiteliais originados, normalmente se apresentam como neoplasias com células policlonais e arredondadas, citoplasma moderado a abundante e núcleo claro (Logasundaram et al., 2008).
A principal modalidade de tratamento é a remoção cirúrgica, que deve ser radical em CXAP francamente invasivos ou com acometimento do nervo facial (em casos de envolvimento da GP) (Olsen e Lewis, 2001; Nouraei et al., 2005). A necessidade de esvaziamento cervical ocorre nos tumores com metástase regional. Radioterapia pós-operatória é usada para doenças com alto grau de malignidade, em casos de margem comprometida, ou quando há invasão linfonodal, vascular ou perineural (Lüers et al., 2009). A combinação de radioterapia e quimioterapia é indicada para pacientes com doença disseminada (Olsen e Lewis, 2001; Lüers et al., 2009).
CXAP precoces (intracapsulares e minimamente invasivos) tendem a exibir comportamento biológico de baixo grau, semelhante ao do AP com margens livres (Zbären e Stauffer, 2007). Isto porque exibem bom prognóstico, sem metástases à distância ou óbito e melhor sobrevida livre de doença, embora alguns casos relatados de CXAP intracapsular tenham apresentado invasão vascular e perineural, bem como metástase linfonodal e óbito (Katabi et al., 2010; Griffith et al., 2014; Rito e Fonseca, 2016; Ihrler et al., 2017).
Por outro lado, CXAP francamente invasivos representam a maior gama de trabalhos publicados – o que provavelmente reflita sua maior prevalência quando comparado aos outros subtipos – e apresentam comportamento mais agressivo, originando metástases à distância (principalmente para pulmão), recidivas e morte (Tortoledo et al., 1984; Zbären e Stauffer, 2007; Ihrler et al., 2017). Entretanto, enquanto o carcinoma mioepitelial e o carcinoma
epitelial-mioepitelial parecem representar subtipos histopatológicos de baixo grau de CXPA, os outros carcinomas originados (carcinoma do ducto salivar, adenocarcinoma SOE e carcinoma epidermoide) tendem a ter comportamento de alto grau (de Brito et al., 2016; Ye et al., 2017). Além disso, CXAP são uma das neoplasias mais agressivas das glândulas salivares, apresentando sobrevida em 5 anos próxima de 50% (Lingen, 2010; Som e Bandwein, 2003; Ye et al., 2016).
Recorrências locais e regionais ocorrem em 23% e 18% respectivamente e mudam drasticamente o prognóstico dos portadores de CXAP. Quando ocorrem, resultam em uma média de sobrevida de menos de um ano após descoberta (Olsen e Lewis, 2001). As taxas de sobrevida dos portadores deste carcinoma variam entre os diferentes estudos. Por exemplo, Olsen e Lewis (2001) encontraram uma taxa de sobrevida livre de doença em 37% de 73 casos, enquanto Zbären e Stauffer (2007) em 76% de 24 casos. As diferenças podem ser explicadas pelas diferentes prevalências de grau de invasão e comportamento biológico de cada tumor (Ihrler et al., 2017).
METABOLISMO NA PATOGÊNESE DO CÂNCER
O metabolismo pode representar a soma de todas as reações químicas que ocorrem dentro de uma célula e entendê-lo, bem como compreender suas formas de regulação, é de certa forma perceber como o organismo funciona (Ferreira, 2010). O metabolismo do câncer é uma das áreas mais antigas de pesquisa em biologia do câncer, precedendo descobertas genômicas importantes (como a descoberta dos oncogenes e genes supressores de tumor) em cerca de 50 anos (de Berardinis e Chandel, 2016).
Entretanto, foram só nas últimas décadas, que seu verdadeiro papel na transformação maligna foi estabelecido na literatura científica mundial (Hsu e Sabatini, 2008; Vander Heiden et al., 2009; Coller, 2014; Sullivan et al., 2016; Potter et al., 2016; Chen et al., 2017; Schcolnik-Cabrera et al., 2018). Por outro lado, os avanços dos últimos anos ampliaram o que se sabia acerca do conhecimento dos processos associados à transformação maligna de um tecido. Em 2000, por exemplo, Hanahan e Weinberg em um estudo original causou impacto na comunidade científica global ao citar seis marcas do câncer, a saber: (1) proliferação descontrolada, (2) resistência à apoptose, (3) angiogênese, (4) imortalidade replicativa, (5) invasão e metástase, e (6) evasão de genes supressores de tumor (Hanahan e Weinberg, 2000). Alguns anos depois, adicionalmente, os mesmos autores ampliaram a lista original e a reprogramação metabólica, a instabilidade genômica, a inflamação promotora de tumor, e o
escape do sistema imune foram referidos como fatores emergentes e essenciais para sustentar a proliferação descontrolada das células neoplásicas (Hanahan e Weinberg, 2000; Hanahan e Weinberg, 2011; Potter et al., 2016). Neste contexto, parece impraticável referir o fenótipo metabólico na patogênese da doença, sem mencionar o Efeito de Warburg – hipótese postulada há quase um século, mas que se mantém fundamentada até os dias atuais (Potter et al., 2016).
2.3.1 Efeito de Warburg
Em organismos multicelulares, as células são expostas a um suprimento constante de nutrientes. Quando a disponibilidade de nutrientes excede o nível necessário para sustentar a divisão celular, o organismo necessita de sistemas de controle que freiem a proliferação celular individual exacerbada. Normalmente, isto é facilmente controlado, porque as células humanas não absorvem nutrientes de seu ambiente, a menos que sejam estimuladas por fatores de crescimento (Hsu e Sabatini, 2008).
Entretanto, no câncer, as células malignas conseguem superar a dependência do fator de crescimento por meio de mutações genéticas que alteram funcionalmente vias de captação e metabolismo de nutrientes (Vander Heiden et al., 2009; Icard et al., 2018). Com isso, aumentam sua demanda de energia para sobreviver nas condições impostas pela neoplasia – percepção brilhantemente descrita por Otto Warburg e colaboradores em 1924 e reconhecida com o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1931 (Warburg et al., 1924; Brand, 2010).
Assim, na presença de oxigênio, as células normais usariam as mitocôndrias para metabolizar a glicose em ATP, por meio da fosforilação oxidativa. Sob condições anaeróbicas, por outro lado, as células produziriam grandes quantidades de lactato por meio da glicólise aeróbica (Cori e Cori, 1925; Warburg, 1927). Além disso, diante das observações de Warburg, acreditava-se que as células neoplásicas desenvolveriam um defeito na mitocôndria, que ficariam disfuncionais. Isto prejudicaria à respiração aeróbica e tornaria a célula dependente do metabolismo glicolítico para sobreviver, o que significa que indiretamente, as células neoplásicas escolheriam produzir ATP pela glicólise e não pela fosforilação oxidativa, mesmo na presença de amplo oxigênio (Warburg et al., 1924; Warburg, 1956).
Este fenômeno, denominado Efeito de Warburg (Warburg et al., 1924; Warburg, 1956), universalmente conhecido e considerado o padrão de referência para o metabolismo no câncer, entretanto, apresenta um parodoxo. A glicólise não tem a mesma eficiência para a produção de ATP que a fosforilação oxidativa, então por que as células em proliferação mudariam para um metabolismo menos eficiente? Para Vander Heiden e colaboradores (2009),
duas explicações são possíveis: a primeira delas, é que a produção ineficiente de ATP se daria apenas quando os recursos são escassos – o que não é o caso das neoplasias humanas, que dispõem de um fornecimento contínuo de glicose e outros nutrientes no sangue circulante; e o segundo, que se refere as reais necessidade metabólicas das células em proliferação, que se estendem além do ATP (como revisado em Vander Heiden et al., 2009 e Zaidi et al., 2013).
A título de exemplo, uma célula em proliferação para replicar todo o seu conteúdo celular e produzir duas células filhas viáveis na mitose, requerem não só ATP, mas também nucleotídeos, ácidos graxos, lipídios de membrana e proteínas (Vander Heiden, Cantley e Thompson, 2009; Zaidi et al., 2013; Valli et al., 2014; Schcolnik-Cabrera et al., 2018). A via glicolítica se prestaria então à produção de biomassa, após um desvio efetivo de glicose para fornecer fontes de carbono a outras vias metabólicas a fim de sintetizar substrato (aminoácidos, lipídios e nucleotídeos) para sustentar a rápida taxa de crescimento durante a proliferação de células tumorais (Courtnay et al., 2015; Gentric et al., 2017).
Mesmo que o Efeito de Warburg seja considerado uma marca metabólica do câncer, sua patogênese, ainda no século XXI, continua incerta e controversa. Nas últimas décadas, estudos que contrariam a teoria original de Warburg foram estipuladas e sugerem que a maioria das mitocôndrias tumorais não apresentam defeitos na capacidade de realizar a fosforilação oxidativa (Weinhouse, 1976; Burns e Manda, 2017). Em vez disso, nas células em proliferação, o metabolismo mitocondrial seria reprogramado para enfrentar os desafios da síntese de macromoléculas. Essa possibilidade nunca foi considerada por Warburg e seus contemporâneos, mas vem sendo enfatizada na literatura nos últimos anos (Vander Heiden et al., 2009; Ward e Thompson, 2012; Burns e Manda, 2017).
De qualquer forma, independente do mecanismo real implicado, é consenso científico que a principal consequência deste fenômeno, após a produção maciça de ácido lático, seja o aumento da acidez extracelular, que torna o microambiente ácido e compromete a integridade e organização da matriz extracelular (Menendez e Lupu, 2007; Schwartz et al., 2017; Icard et al., 2018). Há evidências de que um pH extracelular pode promover invasão e comportamento metastático, bem como ativação de enzimas proteolíticas e destruição de matriz (Harguindey et al., 2005; Cardone et al., 2005; Schwartz et al., 2017; Mokrowiecka et al., 2017; Tekade e Sun, 2017; Schcolnik-Cabrera et al., 2018).
2.3.2 Microambiente tumoral e o fator de transcrição induzido por hipóxia 1α
Diante deste cenário, é interessante compreender o efeito de Warburg no microambiente tumoral. Em tumores sólidos, à medida que o tumor se expande rapidamente, as células malignas formam grandes massas tumorais, que levam à obstrução e compressão dos vasos sanguíneos em torno dessas massas e/ou ultrapassam os limites de difusão de seu suprimento sanguíneo local. Seja qual for a forma, a progressão tumoral levará à hipóxia e à estabilização do fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF), recentemente descrito como um regulador chave da hipóxia, gerindo respostas celulares e fisiológicas necessárias na adaptação do microambiente diante dos baixos níveis de oxigênio (Wang e Semenza, 1993; Hsu e Sabatini, 2008; Masoud e Li, 2015; Schito e Semenza, 2016; Huang et al., 2018).
A via mais reconhecida adotada pelas células hipóxicas é a ativação do fator de transcrição induzido por hipóxia 1 (HIF-1). Estruturalmente, consiste em um heterodímero composto por uma subunidade alfa, composta por três isoformas (1, 2 e 3), cuja expressão é induzida sob condições hipóxicas, e outra subunidade β (HIF-1β), também conhecido como translocador nuclear de receptor de hidrocarboneto de arila (ARNT), que é expresso constitutivamente (Kujan et al., 2017).
A subunidade alfa do HIF-1 (HIF-1α) possui dois domínios de transativação (TAD): terminal NH2 (N-TAD) e terminal COOH (C-TAD). Esses dois domínios são responsáveis pela atividade transcricional do HIF-1α. Quando o C-TAD interage com a proteína de ligação a CREB (CBP) e seu homólogo p300 (CBP/p300), sua transcrição gênica sob hipóxia é modulada. O N-TAD, por outro lado, é responsável por estabilizar o HIF-1α contra a degradação. Como consequência, enquanto o oxigênio está presente, o HIF-1α é rapidamente degradado ou desativado (Kujan et al., 2017) e a partir do momento que os níveis diminuem, 1α se estabiliza e se transloca para o núcleo, onde dimeriza com 1β e é ativado. HIF-1β, diferentemente, possui domínio de degradação de oxigênio (ODDD) sobrepondo N-TAD em todas as estruturas, o que explica sua estabilidade em condições estáveis de oxigênio (Masoud e Li, 2015).
Três isoformas relacionadas ao HIF-α eram conhecidas: HIF-1α, HIF-2α, e HIF-3α. Semelhante a isoforma 1, HIF-2α também é estabilizada por hipóxia e dimeriza com o HIF-1β, apresentando 48% de similaridade na sequência de aminoácidos. Todavia, mesmo que possuam muitas semelhanças, não são redundantes. A isoforma 1 regula a expressão de genes relacionados a via glicolítica e direciona as vias apoptóticas, enquanto a isoforma 2 estimula o crescimento do tumor e angiogênese. Mais do que isso, HIF-1α desempenha um papel crítico
nas respostas iniciais (2-24h) à hipóxia grave (<0,1% O2), enquanto o HIF-2α afeta a hipóxia crônica (48-72h) (Soni e Padwad, 2017). Até 2013, por outro lado, pouco se sabia sobre a isoforma 3, que hoje parece regular negativamente a capacidade de ligação de HIF-1α ao DNA
(Torii et al., 2013). Independentemente dos níveis de oxigênio, HIF-1α é constitutivamente transcrito e
sintetizado. Porém, como discutido nos parágrafos anteriores, a normóxia leva à rápida degradação do transcrito de HIF-1α, ao passo que sob condições de hipóxia, o transcrito torna-se estável e com atividade transcricional ativa, por meio de várias vias e modificações pós-traducionais (hidroxilação, acetilação, ubiquitinação, fosforilação, sumoilação, S-nitrosação) (Masoud e Li, 2015; Soni e Padwad, 2017).
Sob normóxia, enzimas dependentes de oxigênio chamadas de prolil hidroxilases (PHD) se ligam ao HIF-1α e hidroxilam 2 resíduos de prolina e acetilam um resíduo de lisina, aumentando sua afinidade com a proteína von Hippel-Lindau (pVHL), uma proteína supressora de tumor e um dos componentes reconhecidos de uma proteína ligase de ubiquitina E3 (E3). O reconhecimento do 1α pelo pVHL leva a ubiquitinação e degradação proteossomal de HIF-1α – regulação negativa. Como a ação de hidroxilação de PHD requer a presença de oxigênio, sob condições hipóxicas, nem hidroxilação nem acetilação de HIF-1α ocorrem, resultando na estabilização de sua estrutura (Masoud e Li, 2015; Kujan et al., 2017; Soni e Padwad, 2017).
Por outro lado, uma via de regulação negativa independente de pVHL pode ser ativada. Enquanto o pVHL regula a estabilização do HIF-1α, esta via regula sua transativação. Como visto, O HIF-1α é estabilizado quando dimeriza com HIF-1β no núcleo. Em normóxia, um fator inibidor de HIF-1 (FIH-1), também conhecido como asparginil hidroxilase, dependente de oxigênio, bloqueia a interação entre o domínio C-TAD no HIF-1α e o co-ativador CBP/p300, anulando a transcrição gênica mediada por HIF-1α. Sob hipóxia, a atividade de FIH é reduzida, resultando na ativação transcricional dos genes alvo (Dann et al., 2002; Lando et al., 2002; McNeill et al., 2002) (Figura 3).
Em condições não hipóxicas, fatores de crescimento, citocinas e outras moléculas de sinalização tendem a acumular a proteína HIF-1α nas células. A via de sinalização fosfatidil inositol-4,5-bisfosfato-3-quinase (PI3K)/ proteína quinase B (AKT) é um membro de uma família de lipídios e proteínas quinases ativadas por fatores de crescimento que incluem o receptor do fator de crescimento epidérmico – EGFR, o fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I) e o receptor de insulina (IRS) (Barron et al., 2016; Zhang et al., 2018). A ativação da via resulta em aumento da tradução de HIF-1α. Por outro lado, certos fatores de crescimento ativam o RAS, que por sua vez, estimulam cascata de sinalização extracelular
regulada por sinal quinase (ERK1-2) da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK), também aumentam a tradução da proteína HIF-1α. ERK quinase, ademais, regula a ativação a nível transcricional, por aumentar a formação do complexo HIF-1α/p300 (Jiang et al., 2001; Semenza, 2002; Masoud e Li, 2015).
Figura 3 – Mecanismo de hipóxia dependente de oxigênio. Enquanto o oxigênio está presente, o HIF-1α é rapidamente degradado ou desativado. Entretanto, sob condições de hipóxia, a atividade de PHD e FIH é reduzida e o HIF-1α é capaz de se translocar para o núcleo, onde o HIF1‐β é localizado. O HIF1-α é estabilizado quando dimeriza com HIF1‐β. Em seguida, forma um complexo com proteína de ligação a p300/CBP, ambos os quais são capazes de regular a estrutura da cromatina. Este complexo ativado é capaz de ativar a transcrição de uma série de genes associados com a manutenção da homeostase do oxigênio
Adaptado de Kujan et al., 2017
Além disso, foi observado que a perda do gene supressor de tumor p53 (ou TP53), referido como guardião do genoma, em certos tipos de tumores, está associada a níveis elevados de HIF-1α. Em condições de normóxia, HIF-1 se liga à p53, permitindo que o homólogo do duplo minuto 2 do rato (Mdm2) regule a ubiquitinação do HIF-1α e a degradação proteossomal.
