Quando comparamos a expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre as amostras de GSN, AP e CXAP observamos que não houve diferença entre a expressão gênica de HIF-1α e de sua respectiva proteína (Gráfico 6A). Por outro lado, quando comparamos a expressão gênica e imunoistoquímica de GLUT-1 notamos que em ambos os casos houve aumento de sua expressão nos tecidos tumorais quando comparado com os normais, embora haja uma perda da expressão da proteína GLUT-1 no AP
(Gráfico 6B).
Para FASN, embora haja uma tendência de que sua expressão gênica aumente à medida da carcinogênese do AP, os resultados não são significativos. A expressão da sua respectiva proteína, por outro lado, aumenta em quantidade nos tecidos tumorais (principalmente no CXAP) (Gráfico 6C). Ao contrário, a expressão gênica de adipofilina diminui nos tecidos tumorais quando comparada com os tecidos normais, diferentemente dos níveis de sua respectiva proteína, que aumentam nos tecidos tumorais (Gráfico 6D).
É importante salientar que diferenças estaticamente significantes não foram encontradas na expressão gênica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre o AP e o CXAP. Por outro lado, estas diferenças se tornam mais evidentes quando analisamos os resultados da imunoistoquímica, principalmente para as proteínas GLUT-1 e FASN.
Além disso, quando comparamos a expressão gênica e imunoistoquímica do HIF- 1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre as 4 amostras de AP residual, as 13 amostras de AP convencional e as 10 amostras de CXAP percebemos que não foram observadas diferenças na expressão destes genes entre os três grupos, embora os padrões de expressão entre os grupos estudados para FASN sejam semelhantes (Gráfico 7).
Gráfico 6 – Comparação entre a expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre amostras de GSN, AP e CXAP. Em A, não foram observadas diferenças entre a expressão gênica e imunoistoquímica deHIF-1α nos tecidos analisados. Em B, expressão gênica de GLUT-1 aumenta ao longo do desenvolvimento do CXAP e a expressão imunoistoquímica aumenta apenas no CXAP. Em C, houve uma tendência de que a expressão gênica de FASN fosse maior nos tecidos tumorais do que nos tecidos normais estudados como também pode ser observado na expressão imunoistoquímica. Em D, a expressão gênica de adipofilina foi menor nos tecidos tumorais do que nas GSN enquanto a expressão da proteína foi maior nos tecidos tumorais do que nas GSN. **p<0,01; teste Kruskal-Wallis com comparação múltipla de Dunn’s. Pontos acima da barra de erros representam outliers.
Gráfico 7 – Comparação entre a expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre 4 amostras de AP residual (APr), 13 amostras de AP convencional e 10 amostras de CXAP. Em A, B, C e D não foram observadas diferenças estaticamente significativas na expressão destes genes entre os três grupos, bem como na expressão de suas respectivas proteínas. Em C, semelhança na expressão gênica e imunoistoquímica do APr e das amostras de AP convencional e CXAP. Teste Kruskal-Wallis.
6 DISCUSSÃO
O presente estudo avaliou a expressão de genes relacionados com o metabolismo tumoral no desenvolvimento do CXAP. Nas últimas décadas, vários estudos genéticos e imunoistoquímicos tentaram elucidar a patogênese do CXAP, todavia investigações acerca das alterações metabólicas são preliminares em vários tumores de glândula e ao que diz respeito a transformação maligna do AP, as conclusões são insuficientes (Shinozaki et al., 2008; Roh et al., 2008; Demasi et al., 2010; Ito et al., 2009; do Prado et al., 2011; Kim et al., 2011; Mariano et al., 2013; Urano et al., 2015; Wang et al., 2015; dos Santos et al., 2016; de Souza et al., 2017; Soares et al., 2018; Branco et al., 2019; Cardoso et al., 2019; Díaz et al., 2019). Além disso, no melhor de nosso entendimento, somos os primeiros a investigar genes associados ao metabolismo tumoral por qRT-PCR no contexto da progressão do AP para CXAP.
Ineditamente, utilizando tecidos congelados provenientes de pacientes acometidos por estes tumores, observamos a expressão de genes relacionados com o Efeito de Warburg e, consequentemente, com o metabolismo tumoral (HIF1-α, GLUT-1, FASN e adipofilina) em GSN, AP, CXAP e AP residuais. Além disso, fizemos uma análise dos aspectos morfológicos e imunoistoquímicos relacionados com estas amostras e correlacionamos estes dados na tentativa de explicar possíveis expressões alteradas destes genes. Não pretendemos definir o papel do metabolismo nestes tumores. Ao contrário, este é um estudo inicial embasado em resultados prévios com outros tumores de glândula e na nossa experiência recente em numa série de melanomas mucosos (sinonasais e orais) e cutâneos avançados, bem como lesões melanocíticas benignas orais e cutâneas (Nascimento, 2018).
Nossos resultados sugerem que ao longo do desenvolvimento do CXAP haja mudança na expressão de alguns destes genes, embora seja prudente reconhecer limitações ao longo deste caminho, ao qual se incluem o pequeno tamanho da amostra e, em particular, que uma microdissecção prévia a expressão gênica poderia nos trazer resultados mais fiéis quanto a expressão destes genes no tecido tumoral. Além disso, os dados obtidos após análise semiquantitativa da expressão imunoistoquímica são categóricos, o que torna o cruzamento de nossos achados com a expressão gênica limitado. De todo modo, o fato de estarmos analisando amostras raras, extremamente heterogêneas, que naturalmente exibem diferentes comportamentos epidemiológicos, clínicos e microscópicos, bem como genes complexos do ponto de vista molecular, tornam todas estas limitações variáveis interessantes para análise. O número amostral, especialmente pela raridade do CXAP e tendo em vista a dificuldade de se
conseguir tecidos congelados destes tumores, não compromete nossos resultados e nos parece satisfatório.
Em relação ao perfil clínico-epidemiológico de nossos pacientes, na série atual, avaliamos na maioria dos casos, amostras provenientes de mulheres adultas em estádios avançados de progressão da doença, cuja microscopia evidenciava franca invasão à cápsula do adenoma e alto grau de pleomorfismo celular. AP acometeram pacientes duas décadas mais cedo do que sua contraparte maligna. Nenhum caso de CXAP com origem na célula mioepitelial e nenhum caso de carcinoma restrito a cápsula do AP (carcinoma intracapsular) foi estudado. Mesmo que com pontuais diferenças, certamente pelo pequeno número de amostras incluídas neste estudo, nossos dados corroboram com as principais séries disponíveis na literatura (Eveson e Cawson, 1985; Lewis et al., 2001; Stodulski et al., 2007; Matsubayashi e Yoshihara, 2007; Mariano et al., 2013; Lim et al., 2015; Hu et al., 2016; Ye et al., 2016; Suzuki et al., 2016; Lopes et al., 2017; Sedassari et al., 2017; Espinosa et al., 2018).
As células tumorais quando em hipóxia, conseguem se adaptar em um ambiente com baixos níveis de oxigênio ativando vias de sobrevivência. A via mais reconhecida adotada pelas células hipóxicas é a ativação do fator de transcrição induzido por hipóxia 1 alfa (HIF- 1α) (Wang e Semenza, 1993; Hsu e Sabatini, 2008; Masoud e Li, 2015; Schito e Semenza, 2016; Huang et al., 2018). Níveis aumentados da proteína HIF-1α já foram encontrados em neoplasias de nasofaringe, laringe, esôfago, trato gastrointestinal, fígado, pulmão, rim, bexiga, mama, ovário, cérvix, cólon, endométrio, próstata, cólon e reto, pele (melanoma) e oligodendroglioma (Jiang et al., 2001; Haugland et al., 2002; Takahashi et al., 2003; Yasuda et al., 2004; Jokilehto et al., 2006; Klatte et al., 2007; Horree et al., 2008; Simiantonaki et al., 2008; Chen et al., 2009; Jo et al., 2010; Wu et al., 2010; Zhou et al., 2010; Abraham et al., 2012; Malfettone et al., 2012; Xu et al., 2013; Huang et al., 2014; Slominski et al., 2014; Maroni et al., 2015; Zapatero et al., 2015; Aquino-Galvez et al., 2016; Zhang e Wang, 2016; Zhou et al., 2017; Huang et al., 2018; Peng et al., 2018; Xie et al., 2018), no entanto, em tumores de glândula salivar, os estudos são escassos.
Hara e colaboradores (2006), em um estudo in vitro utilizando linhagens celulares de carcinomas de glândulas salivares demonstraram que quando as células eram cultivadas em condições hipóxicas, a expressão de HIF-1α aumentava nestas linhagens (Hara et al., 2006). Além disso, nosso grupo, em um trabalho de 2012, estudou por imunoistoquímica carcinoma adenoide cístico com transformação para alto grau e descobriu que 100% dos carcinomas adenoides císticos transformados expressavam a proteína HIF‐1α (Costa et al., 2012). De modo similar, Wang e colaboradores (2015), também por imunoistoquímica, estudaram a expressão
de HIF-1α em carcinomas adenoides císticos, GSN e AP. Seus resultados demonstraram que a expressão de HIF-1α estava significativamente aumentada no carcinoma adenoide cístico em comparação com os outros dois grupos (Wang et al., 2015). Branco e colaboradores, mais recentemente, estudando carcinoma mucoepidermoide observaram que a expressão de HIF-1α estava aumentada nestes tumores (Branco et al., 2019).
Para verificar nossa hipótese de que a expressão de HIF-1α aumentaria ao longo do desenvolvimento do CXAP, conforme para outros tumores de glândula salivar, avaliamos o comportamento de sua expressão em GSN, AP e CXAP. Os resultados da expressão gênica e imunoistoquímica não mostraram diferença significativa na expressão de HIF-1α entre os diferentes tecidos estudados. Esta discrepância entre nossos resultados e àqueles da literatura citados, pode ser explicada por uma limitação de nosso estudo. Como trabalhamos com amostras coletadas ao longo do tempo e mantidas no Biobanco de duas instituições com protocolos de coleta diferentes, não somos capazes de confirmar se o fragmento do tecido tumoral de AP e CXAP foi coletado da região periférica do tumor (onde a resposta hipóxica tenderia a ser menor) ou do interior (onde a proliferação celular seria mais intensa e a resposta hipóxica maior). Reflexo disso é que a única amostra com nível de expressão discrepante das demais e consequente maior expressão de HIF-1α, foi proveniente do único caso de CXAP que apresentava necrose tecidual (comedonecrose) no fragmento de tecido utilizado para extração de RNA. Além disso, o gene HIF-1α apresenta uma regulação complexa, que não depende apenas da presença de oxigênio, mas sim de fatores de crescimento, citocinas e outras moléculas de sinalização que tendem a acumular a proteína HIF-1α nas células (Barron et al., 2016; Zhang et al., 2018).
Muito embora estudos prévios sustentem a ideia de um aumento na expressão de HIF-1α em tumores malignos, nossos resultados são amparados por outros estudos na literatura que também investigaram o papel do HIF1-α em tumores de glândula salivar. Recentemente, utilizando as mesmas técnicas deste trabalho, um grupo brasileiro analisou a expressão gênica de HIF-1α em 16 GSN obtidas a partir de excisões de mucocele, 22 tumores benignos (todos AP) e 24 tumores malignos de glândula salivar, em que nenhum foi CXAP. Seus resultados, em um grupo maior de amostras, mostraram que não existem alterações significativas na expressão de HIF-1α nos diferentes tecidos estudados (Cardoso et al., 2019). Além disso, Wijffels e colaboradores (2009), por imunoistoquímica, concluíram que, na maioria dos casos, os tumores de glândula salivar não são hipóxicos e atribuíram seus achados ao fato de que tumores salivares (seja de baixo ou alto grau) possuem crescimento lento, podendo a angiogênese acompanhar a expansão do tumor (Wijffels et al., 2008; Wijffels et al., 2009).
Neste cenário, a mudança da fosforilação oxidativa para glicólise anaeróbica em células tumorais hipóxicas é acompanhada pela necessidade aumentada de glicose e consequentemente pelo aumento em seu transporte, que é mediado por GLUT-1 (Koppenol e Dang, 2011; Burns e Manda, 2017). Ao passar do tempo, o aumento da expressão destas proteínas foi observado em tecidos tumorais de diversos tipos de cânceres, que incluem cutâneo, oral, hipofaríngeo, laríngeo, gástrico, esofágico, hepático, pancreático, colorretal, de vesícula biliar, adrenocortical, renal, pulmonar, mamário, ovariano, cervical, prostático e neuroblástico (Kawamura et al., 2001; Mineta et al., 2002; Macheda et al., 2005; Godoy et al., 2006; Mori et al., 2007; Fenske et al., 2009; Legan et al., 2009; Ganapathy et al., 2009; Knapp et al., 2012; Ramani et al., 2013; Gonzalez-Menendez et al., 2014; Grimm et al., 2014; Starska et al., 2015; Barron et al., 2016; Martel et al., 2016; Oh et al., 2017; Wang et al., 2017; Deng et al., 2018; Gonzalez-Menendez et al., 2018; ; Xiao et al., 2018; Zhang et al., 2019) e em relação aos tumores de glândula salivar, poucos estão disponíveis.
Demasi e colaboradores (2010) investigaram por imunoistoquímica a expressão de GLUT-1 em carcinoma mucoepidermoide e mostraram que sua expressão aumentava significativamente à medida que os tumores se tornavam mais agressivos (Demasi et al., 2010). Por outro lado, mais recentemente, de Souza e colaboradores (2017) investigaram também por imunoistoquímica a expressão de GLUT-1 em AP, carcinoma adenoide cístico e carcinoma mucoepidermoide e observaram diferenças na expressão de GLUT-1 entre os tumores estudados, sendo significativamente maior em carcinoma mucoepidermoide do que em AP e carcinoma adenoide cístico. Mori e colaboradores (2007), por RT-PCR, detectaram maior expressão de GLUT-1 em carcinoma adenoide cístico do que em GSN (Mori et al., 2007). Apenas um estudo investigou o papel do GLUT-1 no CXAP. Kim e colaboradores (2011) mostraram que a proteína GLUT-1 estava expressa em dezessete CXAP, sendo sua que expressão era maior nas áreas transformadas do que nas benignas residuais (Kim et al., 2011).
Para verificar nossa hipótese de que a expressão de GLUT-1, como imaginávamos para o HIF-1α, aumentaria ao longo do desenvolvimento do CXAP, avaliamos o comportamento de sua expressão nas mesmas amostras. Os resultados da expressão gênica mostraram aumento significativo na expressão de GLUT-1 nos tecidos tumorais (AP e CXAP) quando comparada com GSN, embora diferença estatística não tenha sido encontrada entre ambas as neoplasias. Ademais, quando comparamos GSN e tecido tumoral dos mesmos pacientes, o padrão de expressão aumentou significativamente no tecido tumoral. Enquanto isso, a expressão da proteína aumentou apenas no CXPA. Nossos resultados sugerem que o aumento na expressão gênica de GLUT-1 não esteja necessariamente associado com à
transformação maligna do AP, mas com a necessidade da célula (ainda que benigna) de adquirir mais glicose para sobreviver sob todas as condições impostas pelo microambiente tumoral, reforçando o papel da presença de controles regulatórios pós-transcricionais que atuam na expressão da proteína GLUT-1 no AP. No entanto, antes que novas conclusões possam ser tiradas, uma série maior precisará ser analisada.
Por outro lado, o aumento da lipogênese, marca do metabolismo reprogramado no câncer, é refletida pela maior atividade e expressão de várias enzimas lipogênicas, entre elas a FASN (como revisado em Lu et al., 2018 e Zadra et al., 2019). A expressão de FASN está aumentada em uma variedade de neoplasias malignas, tais como de cérebro, boca, esôfago, tireoide, estômago, pâncreas, pulmão, rim, cólon e reto, bexiga, mama, endométrio, ovário, próstata, sarcomas de tecido mole, mieloma múltiplo e linfoma não-Hodgkin (Kuhajda et al., 2000; Wang et al., 2001; Agostini et al., 2004; Tsuji et al., 2004; Rossi et al., 2006; Alo et al., 2007; Horiuchi et al., 2008; Walter et al., 2009; Uddin et al., 2010; Liu e Brown, 2011; De Andrade et al., 2011; Notarnicola et al., 2011; Ito et al., 2014; Rossato et al., 2014; Bauerschlag et al., 2015; Massari et al., 2016; Zhou et al., 2017; Zadra et al., 2019) e ao que diz respeito aos tumores de glândula salivar, as investigações se restringem a pouquíssimos estudos.
No passado, nosso grupo investigou sua expressão em AP, carcinoma adenoide cístico e carcinoma mucoepidermoide. Os resultados da imunoistoquímica mostraram que FASN foi mais comumente encontrada em AP e carcinoma mucoepidermoide, sugerindo que estas proteínas pareciam ser importantes na tumorigênese dos tumores da glândula salivar (Ito et al., 2009). Mais recentemente, voltamos a investigar o papel da FASN nestes tecidos e fomos pioneiros ao analisar sua expressão no CXAP. Nossos resultados mostraram alta expressão de FASN nas áreas transformadas do CXAP (Díaz et al., 2019). Alguns anos antes, porém, do Prado e colaboradores (2011) já haviam analisado amostras de neoplasias de glândula salivar benignas (que incluíram AP) e malignas (que inclui um caso de CXAP). Alta expressão de FASN foi encontrada no AP, enquanto uma expressão variável foi encontrada para os tumores malignos (do Prado et al., 2011).
Para verificar nossa hipótese de que a expressão de FASN também aumentaria no desenvolvimento do CXAP, avaliamos o comportamento de sua expressão em GSN, AP e CXAP. Os resultados da expressão gênica não mostraram diferença significativa na expressão de FASN entre os diferentes tecidos estudados, embora um aumento progressivo do número de casos que expressam a proteína ao longo da carcinogênese do AP tenha sido observado. Interessantemente, a expressão da proteína era maior (escore 2) na neoplasia maligna do que na neoplasia benigna. Esta discrepância entre os resultados da expressão gênica e
imunoistoquímica é esperada e ressalta os inúmeros controles regulatórios que atuam sobre a expressão do gene FASN (Kuhajda, 2006; Menendez e Lupu, 2007; Mashima, Seimiya e Tsuruo, 2009; Flavin et al., 2010).
Mesmo que a expressão gênica não nos forneça resultados estatisticamente significantes entre os grupos, nossos resultados mostraram que FASN parece ser, dentre todos os genes estudados neste trabalho, àquele que melhor denota a heterogeneidade entre nossas amostras. Sua expressão, tanto em AP quanto em CXAP foi variável, com muitas amostras apresentando níveis de expressão relativamente altos e discrepantes das demais. Após analisarmos cuidadosamente características epidemiológicas, clínicas, além dos níveis de expressão da proteína nestes casos, percebemos que FASN pode ser mais expressa em amostras que apresentam maiores concentrações de células luminais (Apêndice 4) e fenótipos transformados de alto grau, como os carcinomas do ducto salivar francamente invasivos e com arquitetura morfológica em estágio avançado de diferenciação.
A maioria destes achados vão de encontro aos achados de Díaz e colaboradores (2019) que mostraram que a expressão da proteína FASN estava limitada principalmente às células luminais (Díaz et al., 2019). Do mesmo modo, durante o desenvolvimento de uma dissertação de mestrado de nosso grupo – ainda em elaboração, foi avaliada a expressão da proteína FASN em outros carcinomas de glândula salivar (carcinoma do ducto salivar, carcinoma secretório, carcinoma de células acinares, carcinoma mucoepidermoide de alto grau e carcinoma adenoide cístico de alto grau). Os resultados mostraram que a expressão de FASN nestes tumores está relacionada com o grau de malignidade, sendo maior nos tumores de alto grau e nos carcinomas do ducto salivar (de Angelis, 2019). Certamente, estes resultados refletem o alto índice proliferativo destes tumores, uma vez que FASN está associada a proliferação celular, conforme descrito para o carcinoma de células escamosas oral (Agostini et al., 2004). Entretanto, estudos mais específicos observando a expressão gênica e imunoistoquímica de FASN em cada tipo celular são necessários para confirmar nossos achados.
GL são estruturas responsáveis pelo armazenamento de gordura rica em energia, sendo essenciais no câncer para o crescimento e sobrevivência celular. A expressão aumentada de adipofilina, constitutivamente relacionada com a GL e com a captação de AG, já foi relatada em vários tumores nos últimos anos, como linfoma de Burkitt, câncer colorretal, adenocarcinoma de pulmão, melanomas, lipossarcomas e sarcomas não lipomatosos e carcinoma renal de células claras (Matsubara et al., 2011; Ambrosio et al., 2012; Zhang et al.,
2014; Fujimoto et al., 2016; Fiorentzis et al., 2017; Tolkach et al., 2017; Westhoff et al., 2017; Cao et al., 2018; Song et al., 2019).
Estudos analisando a expressão de adipofilina em tumores salivares são escassos e estão concentrados principalmente naqueles com diferenciação sebácea (carcinoma epitelial mioepitelial com diferenciação sebácea e adenocarcinomas sebáceos de GSMA) e com diferenciação secretória (carcinomas secretórios de glândula salivar) (Shinozaki et al., 2008; Mariano et al., 2013; Urano et al., 2015; Soares et al., 2018). Todavia, alguns anos atrás, investigamos as GL em carcinomas adenoides císticos convencionais e naqueles com transformação para alto grau. Nossos resultados mostraram que a expressão de adipofilina foi muito maior nas áreas transformadas e que isso possivelmente refletiria o aumento da proliferação celular intensa nestas áreas (dos Santos et al., 2016). Sugerimos ainda, que nestes casos, as GL seriam rapidamente liberadas para suportar a divisão celular das células neoplásicas, conforme já descrito para alguns carcinomas mamários e hepáticos (Straub et al., 2010).
Embora a expressão de adipofilina fosse maior nos tecidos tumorais do que nos normais em todos os estudos aqui discutidos, sua sobreexpressão parece refletir em consequências clínicas diferentes, de acordo com a origem do tumor. Em amostras de câncer de mama e adenocarcinoma de pulmão, por exemplo, a superexpressão de adipofilina se correlacionou com um prognóstico marcadamente pior (Fujimoto et al., 2016; Lucenay et al., 2016). Diferentemente, para o carcinoma de células renais, ao longo dos anos, estudos relatam que altos níveis da expressão de adipofilina estão associados com um bom prognóstico (Yao et al., 2005; Yao et al., 2007; Tolkach et al., 2017; Cao et al., 2018).
De todo modo, até onde sabemos, somos os primeiros a investigar por expressão gênica e imunoistoquímica o papel da adipofilina no desenvolvimento do CXAP. Para isso, na tentativa de verificar nossa hipótese de que a expressão de adipofilina aumentaria ao longo da carcinogênese do AP, avaliamos o comportamento de sua expressão em GSN, AP e CXAP.