As concentrações plasmáticas de sódio, lítio e potássio foram determinadas por fotometria de chama utilizando um fotômetro de chama modelo B-462 Micronal®. O princípio dessa técnica leva em consideração o fato de que os metais alcalinos quando elevados a uma temperatura alta, absorvem energia da fonte de calor e passam ao estado de excitação em sua forma atômica. Quando estes átomos resfriam, voltam ao seu estado normal não excitado e reemitem sua energia absorvida por radiação com comprimentos de onda específicos, alguns dos quais na região visível da luz (Na+: 589 nm, Li+: 670 nm, K+: 768 nm). Um metal alcalino aspirado através de uma chama de baixa temperatura, na forma nebulizada emite, depois de excitado pelo calor da chama, uma onda de frequência discreta a qual pode ser isolada por um filtro ótico. A emissão é proporcional ao número de átomos excitados e, portanto, à concentração do íon na amostra.
H20 H2O Coleta de Sangue LiCl 0,06 mmol/100g 5% do peso corporal
14 horas
antes do
inicio da
coleta
2 h 1 h Coleta de UrinaCLEARANCE DE LÍTIO E CREATININA
3.6.1 CÁLCULOS UTILIZADOS
3.6.1.1 CLEARANCE DE CREATININA (CCR)
Representa a depuração plasmática da creatinina por unidade de tempo pela totalidade dos glomérulos renais funcionantes, calculada pela fórmula (UxV1/P), sendo U a concentração urinária de creatinina, V1 o fluxo urinário minuto e P a concentração plasmática de creatinina(117,119). Os resultados foram expressos em µl/min/100g peso corporal.
O clearance de creatinina foi usado para estimar a taxa de filtração glomerular, e o clearance de lítio (CLi+) para avaliar a manipulação tubular de sódio.
3.6.1.2 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO DE SÓDIO (FENA)
Representa a fração de carga filtrada de sódio excretada pela urina num determinado período de tempo, calculada pela fórmula (CNa+/CCr x 100), sendo CNa+ o clearance de sódio e o CCr, o clearance de creatinina (120,125). Os resultados foram expressos em porcentagem (%).
3.6.1.3 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO DE POTÁSSIO (FEK)
Representa a fração de carga filtrada de potássio excretada pela urina num determinado período de tempo, calculada pela fórmula (CK+/CCr x 100), sendo CK+ o clearance de potássio e o CCr, o clearance de creatinina(120,125). Os resultados foram expressos em porcentagem (%).
3.6.1.4 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO PROXIMAL DE SÓDIO (FEPNA)
Representa a fração de carga filtrada de sódio excretada ao longo do túbulo proximal do nefro, calculada pela fórmula (CLi+/CCr x 100). Sendo CLi+ o
clearance de lítio e o CCr, o clearance de creatinina (120,125). Os resultados foram expressos em porcentagem (%).
3.6.1.5 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO PÓS-PROXIMAL DE SÓDIO (FEPPNA) Representa a fração de carga filtrada de sódio excretada ao longo dos segmentos distais do túbulo proximal do nefro, calculada pela fórmula (CNa+/CLi+ x 100) sendo CNa+ o clearance de sódio e o CLi,+ o clearance de lítio(120,125). Os resultados foram expressos em porcentagem (%).
A creatinina plasmática e urinária foi determinada pelo método colorimétrico utilizando-se o kit para dosagem de creatinina K016-2 da Bioclin®
e a proteinúria foi determinada pelo método colorimétrico utilizando-se o kit Sensiprot REF 36-200 da Labtest® e as leituras foram feitas utilizando espectrofotômetro Modelo Epoch, BioTek®. Os Valores individuais das análises da função renal se encontram no Anexo II.
3.7 EUTANÁSIA E COLETA DE MATERIAL
Para a coleta do material os animais foram eutanasiados em duas idades distintas: para a técnica de estereologia parte da prole foi eutanasiada após 16 semanas do nascimento e o restante, após 24 semanas do nascimento (Tabela 2).
NPP LPP NPE LPE
16 SEMANAS 5 5 - -
24 SEMANAS 27 19 27 19
Tabela 2. Distribuição grupos para eutanásia
Para a técnica de estereologia os animais de 16 semanas foram submetidos apenas a uma forma de eutanásia: coleta à fresco. Os animais de 24 semanas foram submetidos à eutanásia de duas formas distintas: perfusão cardíaca e coleta à fresco.
Na coleta por perfusão, parte dos animais (n=60) foi anestesiada por Isofluorano (1-5%) vaporizados em 60-70 % de O2 via inalatória. Após a anestesia, foi realizada a abertura da região abdominal até a região do tórax, com afastamento das costelas e exposição do coração. Foi inserido um cateter acoplado a um sistema de perfusão Masterflex® (Cole-Parmer®, EUA) no ventrículo esquerdo e um pequeno corte foi realizado no átrio direito para abertura do mesmo, impedindo o aumento excessivo da pressão no sistema circulatório e possibilitando o extravasamento dos líquidos. Inicialmente, foi infundido 300 ml de solução salina heparinizada 5% por todos os órgãos do animal e, em seguida, 300 ml de solução de paraformaldeído tamponado em tampão fosfato a 4%, pH 7,4 para a fixação dos tecidos. Posteriormente, foi realizada a coleta dos órgãos do animal: foram coletados os rins direitos e esquerdos, o coração e a tíbia. Os rins foram pesados, seccionados sagitalmente na sua porção central e armazenados, a tíbia foi mensurada com o auxílio de um paquímetro digital e descartada, os corações foram pesados em sua totalidade
e, em suas porções, após a dissecção do ventrículo esquerdo, os ventrículos esquerdos foram cortados sagitalmente e armazenados para posterior análise. Os órgãos coletados foram armazenados por 24 horas em solução de paraformaldeído tamponado em tampão fosfato a 4%, pH 7,4 e depois foram lavados em água corrente e armazenados em álcool 70%.
O restante dos animais (n=49) foram anestesiados por Isofluorano (1-5%) vaporizados em 60-70 % de O2 via inalatória, e após a anestesia, foram decapitados com o auxílio de guilhotina. O tórax dos animais foi aberto e os órgãos foram coletados (coração e rim). O coração foi dissecado para a separação dos ventrículos direito e esquerdo. As massas do coração total, do ventrículo esquerdo e do ventrículo direito foram mensuradas. As massas dos ventrículos foram normalizadas pelo peso corporal dos animais e pelo comprimento da tíbia (126), e usadas como índice de hipertrofia ventricular. Os órgãos foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em -80°C para as análises de biologia molecular. Também foi feita a medida da gordura retroperitoneal.