Estudos do nosso grupo de pesquisa, usando o mesmo modelo utilizado nesta dissertação, vêm demonstrando redução do peso ao nascer na prole de ratas submetidas à restrição proteica gestacional (71,72,99,133). Ao avaliarmos a prole ao nascimento, demonstramos, novamente, que a restrição proteica gestacional está diretamente associada à redução ponderal ao nascer, como já estabelecido também por outros autores (64,89). Alguns estudos demonstraram que a redução do conteúdo proteico da dieta pode exercer influência sobre a ingestão alimentar e a massa ponderal da rata prenhe (135,136). Entretanto, em nosso estudo, não constatamos alterações na massa das mães LP, nem no número de filhotes e na proporção de machos e fêmeas das ninhadas.
Foi demonstrado que a desnutrição proteica gestacional diminui a atividade bem como a concentração da enzima placentária 11β-HSD-2, promovendo aumento da exposição fetal aos glicocorticoides (31,33,35). A diminuição tanto na concentração quanto na atividade da 11β-HSD-2 pode, ainda, estar relacionada com o transporte placentário de nutrientes. Um estudo em camundongos knockout para 11β-HSD-2 demonstrou ineficiência do transporte nutricional, principalmente envolvendo aminoácidos, e diminuição da vascularização placentária (26). Embora saiba-se que a placenta é capaz de se autorregular, afim de promover maior eficiência no transporte de nutrientes através de mecanismo compensatório, isso não parece ser suficiente nos casos de restrição proteica, principalmente, no período final da gestação onde o crescimento fetal se dá de forma mais acelerada e predominante (29).
Em síntese, podemos relacionar o baixo peso ao nascer encontrado neste modelo diretamente com condições as quais o feto é submetido durante a gestação: (i) o estresse nutricional decorrente da restrição proteica materna causa uma elevação de atividade do eixo HPA e consequentemente aumento dos níveis plasmáticos de esteroides (em especial no rato de corticosterona) associada á supressão e menor atividade da enzima placentária 11β-HSD-2 expondo o feto a elevados níveis destes hormônios; (ii) Ou ainda, no feto o downregulation de receptores hipotálamo-hipocampais, manteria ativado o eixo
HPA durante a ontogênese promovendo uma redução no crescimento fetal e maturação dos tecidos e órgãos (134).
Um dos efeitos mais descritos na literatura acerca da programação fetal é o baixo peso ao nascer que está diretamente relacionado ao desenvolvimento de doenças na vida adulta, como doença renal crônica e hipertensão arterial, dentre outras (42,66,137). Como referido acima, vários modelos de estudo associam o envolvimento de privação nutricional, seja ela proteica ou de outros nutrientes essenciais para o bom desenvolvimento fetal, com a susceptibilidade de desenvolvimento de doenças metabólicas na idade adulta, principalmente quando há o rápido ganho de peso (catch-up growth) após o nascimento (41,42,138).
Os modelos experimentais de restrição proteica gestacional podem se dividir entre aqueles cuja restrição proteica se restringe ao período gestacional (LPG) ou, esta restrição ocorre durante a gestação e amamentação (LPGA). Nesta dissertação, propusemos um modelo de compatibilidade entre o ambiente intrauterino e extrauterino utilizando o modelo LPGA. Assim, ao manter a dieta durante o período de lactação, os animais mantiveram o baixo peso comparado ao controle até a idade adulta, sem o fenômeno catch-up growth. Entretanto, esta observação não repercutiu ou foi acompanhada por alterações da massa dos órgãos aqui estudados, quando feita a normalização pelo comprimento da tíbia.
Foi sugerida a hipótese de que em LPG, como o organismo de um recém- nascido com crescimento intrauterino restrito teria sido exposto a baixa concentração de insulina e IGF1, quando confrontado com concentrações elevadas desses hormônios na vida extrauterina, desenvolveria resistência à insulina como mecanismo de defesa para a hipoglicemia. Essa hipótese traz implicações clínicas de extrema importância, indo diretamente de encontro à prática neonatal comum da superalimentação utilizada nos recém-nascidos de baixo peso (138).
Utilizando um modelo LPG que apresentou catch-up growth induzido pelo retorno à dieta padrão, imediatamente após o nascimento, um estudo prévio relata, aumento na adiposidade e hipertrofia de adipócitos na 38ª semana de vida (139). Em outro estudo observaram aumento de adiposidade também relacionado a hiperplasia de adipócitos(140). Na presente dissertação, os animais LP apresentaram índice de adiposidade significativamente menor
comparado ao grupo NP demonstrando a diferença nos modelos. Entretanto, no modelo LPGA tem sido relatado fenótipo de resistência à insulina em ratos machos e fêmeas da prole (136,141) associado a alterações na expressão de proteínas chave na via de sinalização da insulina (141,142).
Atualmente, podemos dizer que a programação fetal resulta do estrito balanço entre a carga genética do indivíduo e a sua interação com ambiente onde ele está se desenvolvendo. Ela pode afetar o desenvolvimento do indivíduo em diversos níveis: genético, celular, orgânico ou sistêmico. Hales e Barker em 1992 propuseram a hipótese do fenótipo econômico (22,143). Essa hipótese sugere que um mesmo genótipo poderia dar origem a diferentes fenótipos, a depender de influências ambientais precoces sobre suas vias do desenvolvimento. As “sinalizações” enviadas pelo ambiente poderiam ser usadas como preditores, determinando, a partir de um grupo de trilhas de desenvolvimento a serem seguidas. Dessa forma, se a nutrição fetal fosse pobre, uma resposta adaptativa ocorreria e levaria a alterações no metabolismo desse indivíduo. Na vida extrauterina, se o ambiente se mantivesse pobre em nutrientes, esse indivíduo estaria bem adaptado e teria melhores chances de sobrevivência. No entanto, se existisse incompatibilidade entre os ambientes predito e encontrado (mismatch), teríamos um problema se estabelecendo (144).
De acordo com Neel (145), “genes econômicos” ou “poupadores” selecionados pelo organismo em momentos de privação nutricional, poderiam aumentar a capacidade de estocar gorduras. Esses genes trariam vantagem ao indivíduo em ambientes de baixo aporte calórico, reduzindo a utilização da glicose e limitando o crescimento do organismo. Caso estes indivíduos fossem expostos, no período pós-natal, a ambiente sem qualquer limitação nutricional ou restrição de gasto energético, estes teriam risco aumentado para o desenvolvimento de diabetes tipo 2, bem como obesidade e síndrome metabólica (146). De acordo com esta hipótese, os “poupadores” poderiam ter permitido a nossos ancestrais sobreviverem em períodos de grande restrição alimentar (denominada “caça-estocagem”), no entanto hoje, nos colocam sob o risco do desenvolvimento de doenças, especialmente à medida que dietas com maior aporte calórico são utilizadas e a longevidade aumentou. Modelos unicamente genéticos não conseguem explicar como os efeitos dessa restrição calórica na gestação ou no início da vida afetariam a saúde desse próprio
indivíduo. Esta afirmação foi sustentada por estudo de coorte, durante a fome holandesa, e confirmado por diferentes modelos animais (23,24).
A ontogênese é um processo regido por uma série de fatores químicos onde a concentração e tempo em que os mesmos aparecem podem afetar diretamente o resultado final. Assim, mesmo pequenas mudanças no ambiente intrauterino poderiam ter efeito devastador nesse processo delicado. As condições às quais a mãe e consequentemente o embrião/feto são expostos, como estresse psicológico e/ou nutricional, têm papel crucial durante a nefrogênese. Em humanos, a nefrogênese se inicia na 5ª semana de gestação e se completa entre as 32ª e 36ª semana (147) e, em ratos, no 9º dia sendo finalizada apenas no período pós-natal, entre o 8º e 11º dia de vida (148). O desenvolvimento renal é particularmente vulnerável à restrição proteica gestacional e, embora não totalmente elucidado, vários mecanismos têm sido sugeridos como direta ou indiretamente envolvidos na gênese/manutenção dos distúrbios do desenvolvimento. Além disso, o período exato em que a restrição proteica pode induzir mudanças ainda não é totalmente esclarecido.
Estudos do nosso grupo de pesquisa têm demonstrado que, quando a restrição proteica (6% caseína) é feita somente no período gestacional, o modelo de estudo LPG, a prole com 12 dias de vida apresenta redução de 28% no número de nefros em relação ao seu controle (47), Além disso, nosso grupo demonstrou que no 14,5º dia gestacional ocorre redução de 28% nos brotamento da árvore nefrogênica (65). Posteriormente, demonstramos que, no 15º dia gestacional, as células tronco do CAP nefrogênico estão reduzidas em 28% (149). Neste estudo, foi observado que na 16ª semana de vida, estes animais apresentavam redução de 27% no número de nefros (47) sendo esta proporção bem próxima à redução das estruturas nefrogênicas, assim, nossa suposição foi que esta redução fosse determinada no ambiente intrauterino.
Surpreendentemente, na presente Dissertação, onde a restrição proteica se prolongou por mais 3 semanas, verificamos perda adicional de 10% dos nefros, isto é, redução de 38% dos nefros na 16ª semana de vida. Desta forma, podemos afirmar que o período de nefrogênese pós-natal em ratos é susceptível a modificações ambientais e, é de extrema importância para a definição do número final de nefros. Podemos supor que o número de células progenitoras de nefros, presentes até aproximadamente 10 dias de vida, poderia ser
acentuadamente reduzido, por apoptose e/ou autofagia, devido à falta de componentes básicos estruturais que permitissem a formação de novas estruturas. Este é um evento importante a ser investigado. Adicionalmente, seria interessante investigar os efeitos da restrição, apenas no período de amamentação sobre a nefrogênese. Devemos salientar que este é um fator importante apenas em roedores e não pode ser extrapolado em caso de outras espécies, como seres humanos, onde a nefrogênese termina durante a gestação.
O aumento no transporte renal de sódio num nefro hiperfiltrante como consequência ao aumento da pressão de ultrafiltração e à sobrecarga imposta pelo número reduzido de unidades, bem como ativação do sistema nervoso simpático são alguns dos mecanismos etiopatogênicos já propostos para explicar a associação entre redução no número de nefros e o desenvolvimento de hipertensão arterial sistêmica na prole LP (150,151). Neste cenário os glomérulos remanescentes exibem significativa hipertrofia compensatória (75). No presente estudo, na 16ª semana de vida, os animais LP apresentaram aumento de 62% no volume glomerular, enquanto que no nosso modelo LPG este aumento de volume do tufo, em animais da mesma idade, foi em torno de 17%. Essa adaptação se dá a partir da elevação da pressão hidrostática intraglomerular compensatória que submete as unidades funcionais isoladas a estresse funcional e comprometimento morfológico dos glomérulos perpetuando ciclo vicioso que contribui para perda progressiva de nefros.
Também não há dúvidas sobre a influência do sistema renina- angiotensina-aldosterona (RAA) na nefrogênese, desde a regulação da resistência capilar, à composição e ao volume do fluido extracelular e, em particular, à distribuição do sódio (152–154). Entretanto, se esse sistema tem papel causal ou associativo na programação intrauterina da hipertensão arterial ainda é um tema em discussão. A maioria dos trabalhos na área sugerem que no crescimento intrauterino restrito há uma supressão do sistema renina- angiotensina-aldosterona fetal, particularmente de receptores AT2, o que poderia ser um mecanismo causal para a redução do número de nefros (155).
Os achados sobre a função renal têm papel importante sobre os eventos pressóricos observados em nosso modelo. A aferição da pressão arterial se deu pelo método indireto de pletismografia caudal semanalmente a partir da 16ª
semana de vida até o sacrifício dos animais na 24ª semana de vida. Modificações pressóricas foram observadas com diferença significativa entre os grupos a partir da 22ª semana nos animais tratados (com enriquecimento do ambiente ou não) em comparação com o grupo controle.
A associação entre a programação fetal e pressão arterial e a exposição excessiva aos glicocorticoides na vida fetal já foi reiteradamente documentada (37,38,134,155). Em carneiros, a exposição fetal a níveis elevados de dexametasona produziu animais de peso normal, porém com número reduzido de nefros e hipertensos aos 3-4 meses de vida (156). Em adultos, níveis plasmáticos de cortisol são inversamente proporcionais ao peso de nascimento (17), o que pode, por sua vez, contribuir diretamente para a elevação pressórica nestes estudos (25,39).
Alguns achados em modelos animais demonstraram que existe diferença nas respostas fisiopatológicas ao ambiente intrauterino adverso entre os sexos. Hormônios sexuais, sob a modulação do sistema RAA, são mecanismos propostos para explicar essas diferenças. Em modelos animais de restrição nutricional geral de leve a moderada, o aumento da pressão arterial é mais exacerbado nos animais machos da prole (157,158). Apenas a restrição proteica severa nas mães produz efeitos semelhantes em ambos os sexos da prole (151,155).
Sempre se faz necessário o destaque para o envolvimento apenas do período de gestação para os modelos de estudo e, como visto, o impacto do período de lactação poderia implicar em quadro muito mais severo ou precoce da doença. Com os estudos que observaram o envolvimento do sexo dos animais, torna-se evidente a implicação neuroendócrina na programação da hipertensão arterial, sendo que o eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal pode estar envolvido, ao mesmo tempo, como o alvo das influências ambientais ou como o mediador das relações entre eventos precoces e hipertensão na vida adulta (37,40,72).
Os mecanismos e as vias fisiopatológicas que intermediam o desenvolvimento da hipertensão arterial, embora ainda pouco compreendidos, são provavelmente múltiplos e complexos, e grande parte das investigações das origens intrauterinas dessa doença na atualidade, tem sido direcionada para os rins, o sistema neuroendócrino e a árvore vascular (155).
Como já descrito, o fenótipo hipertensivo poderia ser promovido por resposta exacerbada de neuromoduladores (como o óxido nítrico e a vasopressina) em regiões responsáveis pelo controle neural do metabolismo hidrossalino e da pressão arterial (123,159,160). O controle hemodinâmico renal associado à homeostase cardiovascular é determinado por mecanismos neuro- humorais, dentre os quais estão o sistema nervoso autônomo e o SRA. O receptor de angiotensina tipo 1 (AT1R) faz o intermédio da maioria das funções biológicas clássicas da angiotensina II (AngII) e desempenha função crítica no controle da atividade simpática nervosa, da regulação da pressão arterial, do balanço hidro-eletrólito, da sede e da excreção de hormônios e, sobretudo, sobre a função renal (71). Estudos observaram que o núcleo do trato solitário (NTS) tem importante função no processamento e modulação do reflexo pressoreceptor, da atividade colinérgica e não-colinérgica/não-adrenérgica aferente e das vias simpáticas eferentes cardíacas, vasculares e renais, todas reguladas por mecanismos dependentes de AT1R (71,133,160,161). No presente estudo, a elevação pressórica foi acompanhada por sensível aumento do índice cardíaco (duplo-produto) sugerindo acentuada elevação da atividade simpática cardíaca nos animais da prole LP comparados ao grupo NP.
Resultados prévios encontrados por diversos grupos, incluindo o nosso, acerca das modificações renais na prole de mães submetidas à restrição proteica durante a gestação, nos permite aventar algumas hipóteses que possam suportar o efeito da lactação de acordo com a função renal avaliada pelos clearances de creatinina e lítio sobre esses achados. Ao observar os resultados dos clearances da prole, com 24 semanas de vida em nosso modelo experimental, não observamos diferenças significativas na taxa de filtração glomerular, estimada pelo CCr bem como na proteinúria, sugerindo a preservação da função e morfologia renal glomerular (162). Neste modelo de estudo, pode ser observado ainda, que na 24ª semana de vida, a prole do grupo LP apresenta redução fracional da excreção de sódio, quando comparado com a prole NP. Esta carga excretada reduzida não foi decorrente de modificações na filtração glomerular, mas sim, de alterações funcionais tubulares, caracterizadas pela reabsorção excessiva proximal de sal e água (106,121,163). Não podemos afastar a possibilidade que esta alteração no transporte tubular de sódio e água, associada à elevação pressórica observada, esteja relacionada a
respostas neuro-humorais peculiares da programação fetal e como veremos, a seguir, ao pronunciado comprometimento estrutural do nefro nos animais LP.
Estudos sugerem que a programação fetal e doenças renais crônicas na prole adulta, estejam associadas ao aumento de produção de ROS materno e ao elevado estresse oxidativo em tecidos fetais (3,109,110). Entretanto, o presente estudo não demonstrou alterações renais significativas de SOD e ROS. Contudo, observamos de forma inédita, a elevação de 32% no conteúdo de NOS1 no tecido renal da prole LP com 24 semanas de vida. Estudos prévios tem demonstrado que a elevação de NOS1 em tecidos está relacionada ao aumento do fluxo sanguíneo, do consumo de O2 e do transporte tubular de sódio (164). A elevação do transporte tubular de sódio, particularmente nos segmentos proximais do nefro, está associada a fator determinante, qual seja a expressão basolateral da bomba Na+/K+-ATPase. Nosso estudo, assim como observado no modelo LPG do laboratório (72), demonstrou elevação quantitativa de Na+/K+- ATPase na 24ª semana de vida de ratos da prole LP. Supomos que a elevação desta enzima no tecido renal poderia envolver o aumento da NOS1 associado aos aumentos do fluxo sanguíneo renal, consumo de O2 e elevação da reabsorção proximal de sódio e água.
Nossos resultados evidenciam expressivo aumento da imunomarcação de ZEB1 renal na prole LP sugerindo que, neste modelo, células glomerulares e tubulares estejam em processo de TEM. Ainda, observaomos em nossos resultados aumento significativo na marcação de colágeno, tanto glomerular quanto tubular (cortical e medular), paralelamente ao aumento no grau de marcação para TGFβ1 e ZEB1. Esses resultados indicam que as células glomerulares e tubulares renais sofrem conversão fenotípica, caracterizada por perda de marcadores específicos do epitélio e ganho de características transicionais (165). Assim como as evidencias da presente Dissertação, resultados prévios de estudos em diferentes tipos de sistemas celulares demonstraram o aumento da expressão de ZEB1, desencadeado pela superexpressão de TGF-β1 e, consequentemente, retroalimentação positiva de deposição continua de colágeno no tecido renal (166–169).
O dano podocitário tem papel chave em diferentes tipos de glomerulopatias, tais como as por diabetes mellitus e hipertensão arterial (170,171). Após aumento na expressão de TGF-β1, os podócitos passam a
perder suas características epiteliais, e paralelamente, ocorre aumento de marcadores mesenquimais (172) como a desmina, vimentina e nestina (132). O aumento de filamentos intermediários e provável simplificação podocitária torna estas células mais resistentes às pressões mecânicas (132,173). TGF-β1 induz hiperplasia e hipertrofia de células mesangiais e acúmulo de matriz extracelular que são características de doenças glomerulares progressivas (174). Adicionalmente, TGF-β1 induz a expressão de ZEB1 responsável pela iniciação da TEM (172). Nós observamos aumento significativo de ZEB1 no tufo glomerular e em segmentos tubulares, indicando indução de TEM e alterações fenotípicas que podem estar associadas à regeneração tecidual (175). Observamos, também, aumento da expressão de ZEB1 no epitélio parietal nos animais LP, indicativo de TEM, o que nos permite inferir que há participação das PECs,- Parietal epithelial cells, possivelmente na tentativa de aumentar o número de podócitos frente ao aumento de 62% na área do tufo glomerular.
Sabe-se que a lesão glomerular é indutora potente para a geração de IL- 6 pelas células epiteliais tubulares funcionando como cross talk entre o glomérulo e o tubulo (103).
A IL-6 pode induzir a produção de colágeno tipo I pelas células epiteliais tubulares e acelerar a fibrose tubulointersticial, que foi associada ao aumento da fosforilação da STAT3(163,176). Já foi observado em um estudo anterior que a supressão da expressão de IL-6 pelas células tubulares reduziu a fibrose intersticial e a atrofia tubular, enquanto a administração crônica de IL-6 aumentou o processo fibrótico (106). Observamos aumento significativo, em 23% de IL-6 e em 28% de fração fosforilada de STAT3 nos animais LP comparativamente ao NP. Como observamos que, embora JAK2 aumente 40%, a fração fosforilada reduz 23%, supomos que JAK1 possa estar fosforilando a STAT3
As céulas renais, incluindo podócitos, endoteliais, mesangiais e epiteliais tubulares podem secretar IL-6. Entretanto, o podócito é a única dentre elas que expressa IL-6R, enquanto as outras não expressam e não empregam a sinalização clássica de IL-6 (87, 88). Nos podócitos a quantidade IL-6R é aumentada por estimulação pró-inflamatória. Além disso, a IL-6 promove a proliferação de podócitos de maneira autócrina (177). A IL6 também está relacionada à disfunções mesangiais provocando aumento na sua proliferação, no acúmulo de matriz e na esclerose (176,178–180).
Portanto, a presente Dissertação demonstrou que a restrição proteica, durante gestação e amamentação, levou à redução significativa na massa da prole ao nascer, que perdurou até a 24ª semana de vida, paralelamente a redução significativa no índice de adiposidade. Adicionalmente, a prole LP apresentou redução de 38% no número de nefros e significativo aumento do volume glomerular, sugerindo hiperfiltração e hiperfluxo glomerular. Os animais LP desenvolveram hipertensão associada ao acréscimo do índice cardíaco e retenção significativa de sódio nos segmentos proximais do nefro. Esta retenção esteve associada à elevação da expressão de Na+/K+-ATPase, nos segmentos proximais do nefro, e de NOS1 no tecido renal. A marcação de colágeno nos animais LP apresentou-se significativamente maior paralelamente ao aumento em TGFβ1 e ZEB1. Os podócitos dos animais LP apresentaram marcadores de lesão e hipertrofia associada à atividade inflamatória sendo, pela primeira vez descrita neste modelo experimental, a ativação da via IL-6/STAT3. Entretanto, o presente estudo não conseguiu mostrar efeito protetor do ambiente enriquecido sobre os aspectos hemodinâmicos e as repercussões funcionais renais no grupo