UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
GABRIELA LEME LAMANA
EFEITOS RENAIS DA RESTRIÇÃO PROTEICA MATERNA DURANTE A GESTAÇÃO E LACTAÇÃO NA PROLE DE RATOS MACHOS
CAMPINAS 2019
EFEITOS RENAIS DA RESTRIÇÃO PROTEICA MATERNA DURANTE A GESTAÇÃO E LACTAÇÃO NA PROLE DE RATOS MACHOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADOR: PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER
COORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ ANTÔNIO ROCHA GONTIJO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA GABRIELA LEME LAMANA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER.
CAMPINAS 2019
GABRIELA LEME LAMANA
ORIENTADOR: PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER
COORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ ANTÔNIO ROCHA GONTIJO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER
2. PROFA. DRA. CAROLINA PRADO DE FRANÇA CARVALHO
3. PROFA. DRA. CARLA BEATRIZ COLLARES BUZATO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Os insatisfeitos são os maiores benfeitores do mundo
Walter S. Landor
Como disse um grande amigo em seus agradecimentos, talvez essa seção seja tão difícil quanto qualquer outra apresentada neste trabalho, pois são inúmeras as pessoas as quais somos gratos por conseguir realizar um estudo que faz parte de um projeto de vida. Antes de mais nada, caso eu me esqueça de algum nome já me desculpo.
Inicialmente agradeço a Deus e Seu amor incondicional, por me guiar e me sustentar durante todo o tempo.
A Profª Patricia e ao Prof. Gontijo, serei eternamente grata. Ela foi muito mais que uma orientadora, em muitos momentos foi uma família, um exemplo de sabedoria, de bondade e de ideais sólidos (os quais eu sempre me identifiquei). Obrigada à Patty, que por tantas vezes foi pra bancada comigo, me ensinando muito mais do que técnicas e teorias, mas sobre tudo o que envolve ser um bom “Orientador”. Obrigada José Antônio por sua paciência inabalável (mesmo frente à minha inaptidão em matemática quando eu te perguntei umas mil vezes como era pra eu fazer o cálculo), sua tranquilidade nos momentos mais cruciais e sua sabedoria colocada na hora exata em cada momento dentro da minha trajetória. Vocês foram bem mais do que professores e orientadores, pois certos valores que eu aprendi e vejo em vocês, não se limitam ao meio acadêmico. Obrigada por acreditarem que esse projeto teria bons frutos, e principalmente por dar credibilidade e confiar em meu trabalho me deixando com liberdade e autonomia suficientes para que eu pudesse executar e aprender e, principalmente obrigada pela oportunidade integrar a equipe do Laboratório de Metabolismo Hidrossalino (minha segunda casa).
Aos colegas e amigos que pude conhecer ao longo do tempo e de forma direta ou indireta fizeram com que esse trabalho tivesse êxito. Aos funcionários do NCME – Nucleo de Medicina e Cirurgia Experimental, Miguel, Dito, Willian, “tias” da limpeza, bioteristas, técnicos e alunos. Aos Laboratórios Adjacentes que sempre me socorriam frente a alguma adversidade ou colaborando com alguma técnica específica (Rosana, Cris e Antônio). Aos meus colegas de laboratório e amigos para a vida, nem sei o que seria de mim sem vocês nessa jornada: Marina, Marcela, Vini, Marcelo, Julia, Gu, Ana Rita, Helo, Gabriel, Augusto,
direta ou indireta de vocês. Gratidão é a única palavra que chega próximo ao meu sentimento, vocês que foram meu auxílio na bancada, nas duvidas, nas risadas, nas refeições e principalmente meus ouvidos para um desabafo quando algo me afligia. À Ize e sua forma maravilhosa de ver a vida e a bondade em cada ser humano, meu porto seguro nas técnicas, minha inspiração de alegria e principalmente tolerância e fé no ser humano, meu muito obrigada também. Vocês fizeram com que tudo fosse mais leve e tranquilo de encarar.
Agradeço à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (FCM - UNICAMP) pela impecável estrutura, excelência no ensino e pesquisa e funcionários altamente qualificados. Tudo isso são ferramentas indispensáveis na produção do bom conhecimento científico e na formação de bons profissionais. Tenho orgulho em fazer parte da família UNICAMP e colaborar para a importância e relevância acadêmico-científica que a UNICAMP possui. Ao programa Fisiopatologia Médica (em especial a paciência da Regina), meu muito obrigado pelo suporte e ajuda.
Aos profissionais da Graduação em Medicina, o pessoal do apoio da Lego (Luís, Silvana, Elizangela) bem como os docentes aos quais tive a honra e oportunidade de conhecer e trabalhar junto ao programa de estágio docente em Fisiopatologia Médica e Plantão em Emergência Médica (Profª Ingrid, Prof. Fabio e Profª Simone) meu muito obrigada pela contribuição em minha formação como futura docente e como um ser humano melhor. À equipe do Prof. Dr. Mario Saad pela disponibilização do laboratório pela paciência e carinho ao me receber.
Minha gratidão eterna à minha mãe que sempre acreditou em mim e me deu todo o suporte e amor. À minha família por serem o porto seguro na volta. Aos meus amigos pessoais (Marília, Carla, Carol, Helô, Gustavinho, Marina) por me lembrarem sempre o quanto eu poderia chegar longe e o quanto isso era possível. Ao Rick, meu irmão de outras vidas, agradeço pelo suporte, amizade, amor e paciência. A minha médica Drª Silvia Merlin, obrigada por segurar as pontas e principalmente minha mão, por acreditar que daria certo mesmo quando nem eu mesma acreditei mais. Obrigada a cada um que de uma forma especial me estimulou sempre a busca incessante pelo melhor.
Durante o desenvolvimento embrionário, fetal e neonatal, o organismo é dotado de plasticidade fenotípica frente às variações ambientais. Deficiências nutricionais maternas durante a gestação e amamentação provocam alterações epigenéticas na prole que podem resultar em modificações estruturais e funcionais renais e cardíacas relacionadas a doenças na idade adulta. O objetivo desta Dissertação de Mestrado foi avaliar, na prole adulta de machos, os efeitos da restrição proteica materna durante a gestação e lactação, com ou sem exposição ao ambiente enriquecido, na função renal e na pressão arterial sistêmica. Adicionalmente, objetivamos avaliar os efeitos da restrição proteica materna no número de nefros e na expressão de proteínas envolvidas em alterações morfológicas e funcionais renais. A restrição proteica, durante gestação e amamentação, levou à redução significativa na massa da prole ao nascer, que perdurou até a 24ª semana de vida, paralelamente à redução significativa no índice de adiposidade. Adicionalmente, a prole LP apresentou redução de 38% no número de nefros e significativo aumento do volume glomerular, sugerindo hiperfiltração e hiperfluxo glomerular. Os animais LP desenvolveram hipertensão associada ao acréscimo do índice cardíaco e retenção significativa de sódio nos segmentos proximais do nefro. Esta retenção esteve associada à elevação da imunomarcação de Na+/K+-ATPase, nos segmentos proximais do nefro, e de NOS1 no tecido renal. A marcação de colágeno pelo método histoquímico de Picrossirius Red, nos animais LP apresentou-se significativamente maior associado ao aumento na imunomarcação renal de TGFβ1 e ZEB1. Os podócitos dos animais LP apresentaram marcadores de lesão e hipertrofia associada à atividade inflamatória via IL-6/STAT3. Como conclusão, os animais submetidos à restrição proteica durante a gestação e lactação apresentaram o desenvolvimento da hipertensão arterial mais tardio quando comparado ao modelo de restrição proteica gestacional. Além disso, os animais submetidos à restrição proteica durante a gestação e lactação apresentaram redução no número de nefros com a função glomerular preservada e ativação da via IL-6/STAT3, sendo a descrição da ativação dessa via inédita nesse modelo, sugere o efeito protetor ou mesmo atenuante da programação fetal quando é promovida a compatibilidade de ambientes intra-uterino e extrauterino. Quanto ao ambiente enriquecido, este deve ser motivo de maiores estudos, pois há um suposto comprometimento hemodinâmico e funcional renal no grupo submetido à restrição proteica na gestação e lactação, no entanto nosso estudo não permite afirmar esses efeitos do enriquecimento de ambiente.
During embryonic, fetal and neonatal development, the organism shows phenotypic plasticity in the face of environmental variations. Maternal nutritional deficiencies during pregnancy and breastfeeding could cause epigenetic changes in offspring resulting in structural and functional renal and cardiac changes related to disease origin in adulthood. The present Master´s dissertation aimed at evaluating effects of gestational and lactation protein restriction on renal function and systemic arterial pressure in adult male offspring exposed or not to the enriched environment. Additionally, we also evaluated the effects of gestational and breastfeeding protein restriction on the glomerular volume and number of nephrons as well on the expression of proteins involved in kidney epidermal epithelial transition and renal collagen content. Protein restriction, during pregnancy and breastfeeding, led to a significant reduction in the offspring birthweight, which lasted until the 24th week of life, in parallel with a substantial decrease in the adiposity index. Furthermore, LP offspring presented a 38% lower nephron number and a significant increase in this glomerular volume, suggesting a glomerular hyperfiltration and hyperflow. The results also exhibit an increased cardiac index, elevated blood pressure and considerable sodium retention in the proximal nephron segments of LP offspring compared to the NP group. The elevated Na+/K+-ATPase immunoreaction in the proximal nephron segments and NOS1 immunoreaction in renal tissue were associated with the sodium retention. LP animals presented collagen content significantly higher associated with an increased TGFβ1 and ZEB1 renal immunodetection in comparison with the NP group. The podocytes of LP animals presented lesions, displayed hypertrophy markers that may be associated with renal inflammatory activity, as well as activation of the IL-6/STAT3 pathway. In conclusion, the LP offspring presented arterial hypertension later in comparison with the NP group, added to the fact that the LP group presented lower nephron number with the preserved glomerular function and activation of the IL-6 / STAT3 pathway, the description of the activation of this pathway unprecedented in this model, suggests the protective or even attenuating effect of fetal programming when environments intra and extrauterin is matching. Additional studies were required to evaluate the real repercussion of enriched environmental changes on physiological e morphological disorder’s observed in programmed rats by gestational adverse situations, assumed hemodynamic and functional renal impairment was observed in the group submitted to protein restriction during gestation and lactation.
Keywords: gestational protein restriction; fetal programming; epidermal epithelial transition, renal function, arterial hypertension.
placentária na programação fetal ... 26 Figura 2 – Representação esquemática da estrutura renal ... 30 Figura 3 – Representação esquemática dos componentes do néfro ... 33 Figura 4 - Pressão arterial sistólica em machos de prole cujas mães receberam dieta normal (17% caseína) ou hipoproteica (6% caseína) somente durante a gestação e durante a gestação e a amamentação (dados não publicados) .... 36 Figura 5 - Representação esquemático dos efeitos renais da restrição proteica gestacional ... 37 Figura 6 - Representação esquemática do corpúsculo renal mostrando sua estrutura em indivíduos saudáveis e as possíveis alterações provocadas pela redução no número de néfrons (2) ... 38 Figura 7 - Representação esquemática das diferentes transições epitélio-mesenquimais ... 40 Figura 8 - Representação esquemática de alterações provocadas por disfunção mitocondrial gerada por fatores estressantes durante a gestação ... 44 Figura 9 – Modelo experimental ... 51 Figura 10- Ambientes enriquecidos utilizados ... 52 Figura 11 - Imagem capturada do software de análise BP-2000 Blood Pressure Analysis 2015 ... 53 Figura 12 - Fluxograma Clearance ... 55 Figura 13 – Representação esquemática da medida da massa e do volume da amostra coletada através de submersão. ... 59 Figura 14 – Representação esquemática da técnica de estereologia ... 60 Figura 15 - Imagem do tufo glomerular capturada do software de análise Olympus CellSens Dimension 1.15 ... 64 Figura 16 – Imagem da marcação de colágeno glomerular e peritubular capturada do software de análise Olympus CellSens Dimension 1.15 ... 65 Figura 17 - Massa corporal no dia da constatação da prenhes de ratas dos grupos NP (278,5 ± 6,239, n=24) e LP (266,5 ± 3,794, n=39) (A) e Ganho ponderal das ratas prenhes dos grupos NP e LP (B). Valores representam a média±desvio padrão ... 69
representam a média±DP. p>0,05... 69 Figura 19 - Massa corporal da prole de ratos machos dos diferentes grupos experimentais (A) e a massa corporal da prole de ratas fêmeas dos diferentes grupos experimentais (B). Machos aos nascer: p= 0,0298** e Fêmeas ao nascer: p=0,0001***. Valores expressos como média±DP ... 70 Figura 20 - Massa corporal dos filhotes machos ao desmame. Grupos NP (49,59 ± 1,371, n=44) e LP (23,45 ± 0,4421, n=31) **** p<0.0001. Valores expressos como média±DP ... 71 Figura 21 - Massa corporal dos filhotes machos 24 semanas. Grupos NPP (531,33 ± 48,49, n=27); NPE (523,80± 48,52, n=26); LPP (471,94± 34,90, n=18) e LPE (467,05 ± 46,87, n=19). NPP/LPP *** p= 0.0003; NPP/LPE **** p<0.0001; NPE/LPP ** p = 0.0022; NPE/LPE *** p = 0.0005 (ANOVA). Valores expressos como média±DP ... 71 Figura 22 – Índice de adiposidade dos filhotes machos com 24 semanas. Valores expressos como média±DP ... 72 Figura 23 - Estereologia Renal da prole de machos com 16 semanas. (A) Massa do Rim; (B) Número de Glomérulos; (C) Volume Glomerular; (D) Volume Cortical. Valores expressos como média±DP ... 73 Figura 24 - Micrografias representativas dos grupos controle – NP (A) e tratado - LP (B) coradas com hematoxilina/eosina. Observe que o volume do tufo glomerular é maior em B. Mácula densa representada nas setas pretas ... 74 Figura 25 - (A) Massa do coração/comprimento da tíbia; (B) Ventrículo Esquerdo/comprimento da tíbia; (C) Massa do Ventrículo Direito/comprimento da tíbia; (D) Massa do Rim Esquerdo/comprimento da tíbia. Valores expressos como média±desvio padrão ... 74 Figura 26 - Evolução da pressão sanguínea sistólica (em mmHg) para os diferentes grupos experimentais, ao longo das semanas de acompanhamento. Valores expressos como média±DP ... 75 Figura 27 - Evolução da pressão sanguínea diastólica (em mmHg) para os diferentes grupos experimentais, ao longo das semanas de acompanhamento. Valores expressos como média±DP ... 76 Figura 28 – (A) Evolução dos batimentos cardíacos (bpm) nos diferentes grupos experimentais, ao longo das semanas de acompanhamento; (B) Evolução do
Figura 29 – (A) Clearance de Creatinina (Ccr) e (B) Relação Proteína/Creatinina nos diferentes grupos experimentais. Grupos: NPP=9; NPE=10; LPP=7 e LPE=8. Valores expressos como mediana e intervalo interquartil (p>0,05) ... 78 Figura 30 - Clearance de Lítio (CLi) nos diferentes grupos experimentais na 24ª semana. Valores expressos como mediana e intervalo interquartil ... 79 Figura 31 - Manipulação tubular de Na e K. (A) Fração de Excreção de Sódio (FENa); (B) Fração de Excreção de Sódio Proximal (FEPNa); (C) Fração de Excreção de Sódio Pós Proximal (FEPPNa); (D) Fração de Excreção de Potassio (FEK). Valores expressos como mediana e intervalo interquartil ... 80 Figura 32 - (A) Porcentagem de área marcada nos túbulos e nos tufos glomerulares da prole de machos com 24 semanas de vida. Valores expressos como média±DP. ... 81 Figura 33 – Quantificação da área de marcação de TGF-β1 tubular (A) e glomerular em rins da prole de machos com 24 semanas de vida. Valores expressos como média±DP. ... 82 Figura 34 – Quantificação da área de marcação de ZEB1 no tufo glomerular (A) em rins da prole de machos com 24 semanas de vida. Valores expressos como média±DP. ... 83 Figura 35 – Micrografias mostrando a marcação de ZEB1 na cortical (A, B) e na medular (C,D) de rins da prole de machos com 24 semanas de vida. ... 84 Figura 36 – Quantificação da área de marcação de Na+/K+-ATPase nos túbulos de rins da prole de machos com 24 semanas de vida (A). Valores expressos como média±DP. ... 85 Figura 37 – Micrografia representativa da marcação de Na+/K+-ATPase nos túbulos de rins da prole de machos com 24 semanas de vida. Grupo Controle - NP (A); Grupo Tratado – LP (B) ... 86 Figura 38 – Representação esquemática da localização de filamentos intermediários no podócito ... 86 Figura 39 - Quantificação da área de marcação de nestina no tufo glomerular em rins da prole de machos com 24 semanas de vida (A). Valores expressos como média±DP. ... 87
em rins da prole de machos com 24 semanas de vida (A). Valores expressos como média±DP. ... 88 Figura 41 - Western Blot das proteínas AT1R (A) e AT2R (B). Valores representam a média±DP... 89 Figura 42 - Western Blot das proteínas JAK2 (A) e fração JAK2/pJAK2(B). Valores representam a média±DP ... 90 Figura 43 - Western Blot da proteína STAT3 (A) e fração STAT3/p STAT3 (B). Valores representam a média±DP ... 90 Figura 44 - Western Blot das proteínas ERK1 (A) e ERK2 (B). Valores representam a média±DP... 91 Figura 45 - Western Blot das proteínas NOS1 (A) e NOS2 (B). Valores representam a média±DP... 92 Figura 46 - Western Blot da proteína SOD2. Valores representam a média±DP. ... 92 Figura 47- Western Blot da proteína GH receptor. Valores representam a média±DP. ... 93 Figura 48 - Western Blot da proteína IL-6. Valores representam a média±DP. ... 93
Tabela 1. Composição Nutricional Ração ... 50 Tabela 2. Distribuição grupos para eutanásia ... 58 Tabela 3. Valores individuais do processamento histológico do piloto de cada grupo ... 62 Tabela 4. Valores individuais do processamento histológico de cada grupo . 62 Tabela 5. Anticorpos primários e diluições utilizadas. ... 64 Tabela 6. Anticorpos primários e diluições utilizadas ... 66 Tabela 7. Dados Estereologia Renal ... 73 Tabela 8. Valores individuais de probabilidade de significância apontados no gráfico da figura 25 ... 76 Tabela 9. Valores individuais de probabilidade de significância apontados no gráfico da figura 28 ... 78 Tabela 10. Valores individuais de probabilidade de significância apontados no gráfico da figura 30 ... 79
AE Ambiente Enriquecido
ANOVA Analysis Of Variance (Análise de Variância) ATP Adenosine Triphosphate (Adenosina Trifosfato) AT1R Receptores de Angiotensina tipo 1
AT2R Receptores de Angiotensina tipo 2 AVC Acidente Vascular Cerebral
BPN Baixo Peso ao Nascer Ca/Mg Cálcio/Magnésio CCr Clearance de Creatinina DAG Distância anogenital
DATASUS Departamento de Informática do SUS DCNT Doenças Crônicas Não Transmissíveis
DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico) DPM Desvio Padrão da Média
DRC Doença Renal Crônica Fe ++ Íon Ferro
FE K+ Fração de excreção de Potássio FE Na+ Fração de excreção de Sódio
FEP Na+ Fração de excreção Proximal de Sódio FEPP Na+ Fração de excreção Pós Proximal de Sódio FI Filamento Intermediário
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IL Insegurança Alimentar Leve
IL-6 Interleucina 6
IM Insegurança Alimentar Moderada IG Insegurança Alimentar Grave
IUGR Intrauterine growth restriction (Restrição do crescimento intrauterino) JAK Janus Kinase
LiCl Cloreto de Lítio Li+ Lítio
LPG Restrição proteica gestacional
LPGA Restrição proteica na gestação e amamentação
NADPH Nicotinamida Adenine Dinucletídeo Fosfato (forma reduzida) Na+ Sódio
Na/K Sódio/Potássio
NPG Dieta normoproteica gestacional
NPGA Dieta normoproteica gestação e lactação NO Nitric oxide (Óxido nítrico)
NOS Oxido Nitrico Sintase
NPP Grupo Normoproteico Ambiente Padrão LPP Grupo Restrição Proteica Ambiente Padrão NPE Grupo Normoproteico Ambiente Enriquecido LPE Grupo Restrição Proteica Ambiente Enriquecido NTS Nucleo do Trato Solitário
O2 Oxigênio
OMS Organização Mundial de Saúde PECs Parietal Epithelial Cells
ROS Espécie Reativa de Oxigênio SNC Sistema Nervoso Central
SRA Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona SOD Superoxido Dismutase
STAT Signal transducers and activators of transcription ZEB1 Zinc finger E-box-binding homeobox 1
TFG Taxa de Filtração Glomerular TFG β Transforming Growth Factor Beta
1.1 A FOME NO MUNDO... 21
1.1.1 MÁ NUTRIÇÃO MATERNA - INDICADORES ATUAIS ... 22
1.2 HISTÓRICO DA PROGRAMAÇÃO FETAL ... 23
1.2.1 MODELOS DA PLASTICIDADE DO DESENVOLVIMENTO E RESPOSTA PREDITIVO-ADAPTATIVA ... 24
1.2.2 MECANISMOS ENVOLVIDOS NA PROGRAMAÇÃO FETAL 25 1.2.3 PROGRAMAÇÃO FETAL E CRESCIMENTO CATCH-UP... 27
1.3 ENRIQUECIMENTO DO AMBIENTE ... 28
1.4 ESTRUTURA RENAL ... 29
1.5 RESTRIÇÃO PROTEICA COMO MODELO EXPERIMENTAL DE PROGRAMAÇÃO ... 35
1.6 PROGRAMAÇÃO FETAL E ALTERAÇÕES RENAIS ... 36
1.7 MECANISMOS DAS ALTERAÇÕES RENAIS PROVOCADAS PELA PROGRAMAÇAO FETAL ... 44
1.8 PROGRAMAÇÃO FETAL DA HIPERTENSÃO ARTERIAL ... 45
1.8.1 SISTEMA RENINA – ANGIOTENSINA- ALDOSTERONA ... 46
1.9 HIPÓTESE ... 47 2. OBJETIVOS GERAIS ... 48 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 48 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 49 3.1 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 49 3.1.1 PROTOCOLO DE ACASALAMENTO ... 49
3.2 COMPOSIÇÃO DOS GRUPOS ... 50
3.2.1 AMBIENTE ENRIQUECIDO ... 52
3.3 PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS DA PROGENITORA E DA PROLE .... ... 53
3.4 AFERIÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA (PAS) ... 53
3.5 ESTUDO DA FUNÇÃO RENAL ... 54
3.6 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 56
3.6.1 CÁCULOS UTILIZADOS ... 57
3.6.1.1 CLEARANCE DE CREATININA (CCR) ... 57
3.6.1.2 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO DE SÓDIO (FENA) ... 57
3.6.1.3 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO DE POTÁSSIO (FEK) ... 57
3.6.1.4 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO PROXIMAL DE SÓDIO (FEPNA) ... 57
3.6.1.5 FRAÇÕES DE EXCREÇÃO PÓS-PROXIMAL DE SÓDIO (FEPPNA) ... 57
3.8 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO ... 59
3.9 ESTEREOLOGIA RENAL ... 60
3.10 IMUNOHISTOQUÍMICA ... 63
3.11 WESTERN BLOTTING ... 65
3.12 QUANTIFICAÇÃO DO CONTEÚDO DE COLÁGENO - TÉCNICA DE PICROSSÍRIUS/FAST GREEN ... 67
3.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 68
4. RESULTADOS ... 69
4.1 MASSA DAS GENITORAS E NÚMERO DE FILHOTES ... 69
4.2 MASSA CORPORAL AO NASCER ... 70
4.3 MASSA CORPORAL NO DESMAME ... 70
4.4 MASSA CORPORAL E ÍNDICE DE ADIPOSIDADE NA IDADE ADULTA71 4.5 ESTEREOLOGIA RENAL E MASSA DOS ÓRGÃOS ... 72
4.6 PRESSÃO ARTERIAL, BATIMENTOS E ÍNDICE CARDÍACO ... 75
4.7 FUNÇÃO RENAL ... 78
4.8 CONTEÚDO DE MARCAÇÃO DO COLÁGENO RENAL ... 80
4.9 IMUNOHISTOQUÍMICA ... 81
4.9.1 ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA DA IMUNOMARCAÇÃO DE TGF β1 GLOMERULAR E TUBULAR ... 81
4.9.2 ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA DA IMUNOMARCAÇÃO DE ZEB 1 ... 83
4.9.3 ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA DA IMUNOMARCAÇÃO DE Na+K+ATPase ... 84
4.9.4 ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA DA IMUNOMARCAÇÃO DE DESMINA E NESTINA GLOMERULAR ... 86
4.10 QUANTIFICAÇÃO PROTEICA POR WESTERN BLOTTING ... 89
5. DISCUSSÃO ... 94
6. CONCLUSÕES ... 104
7. REFERÊNCIAS ... 105
8. ANEXOS ... 116
Anexo I – CERTIFICADO DE APROVAÇÃO 4242-1 ... 116
Anexo II – FUNÇÃO RENAL - DADOS INDIVIDUAIS CLEARANCE DE CREATININA E LITIO - LPE ... 117
Anexo II – FUNÇÃO RENAL - DADOS INDIVIDUAIS CLEARANCE DE CREATININA E LITIO - NPE ... 118
Anexo II – FUNÇÃO RENAL - DADOS INDIVIDUAIS CLEARANCE DE CREATININA E LITIO - LPP ... 119
1.INTRODUÇÃO
1.1 A FOME NO MUNDO
Embora o número de pessoas acometidas pela insegurança alimentar grave no mundo tenha caído estima-se que atualmente 795 milhões de pessoas são submetidas à restrição alimentar severa. A prevalência da desnutrição em regiões em desenvolvimento embora em declínio, ainda acomete 12,9% da população. No Brasil, são 3,4 milhões de pessoas subalimentadas apesar da queda de 82% entre 2002 e 2014 (5,6).
Tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento, a desnutrição materno-infantil tem repercussões evidentes sobre a saúde da população. A desnutrição não é causada apenas pela falta de alimentos, mas também por dietas que priorizam gordura e carboidratos em detrimento de proteínas e vitaminas. De acordo com dados de 2018 da Organização Mundial da Saúde (OMS), a desnutrição materna continua sendo um problema de saúde pública mundial e está relacionada ao baixo peso ao nascer (BPN). Anualmente nascem cerca de 20 milhões de crianças com BPN em todo mundo, representando cerca de 15,5% de todos nascimentos. No último relatório da OMS, tem-se a redução em 30% do baixo peso ao nascer como uma das metas globais a serem alcançadas até 2025 (6,7).
Dados do Suplemento da Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios (PNAD), relatório obtidos pelo IBGE epelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) divulgado em 2014 mostraram que mais de 7 milhões de brasileiros estavam em situação de insegurança alimentar grave no ano de 2013. Segundo o documento, a insegurança alimentar grave atingia 3,2% (2,1 milhões) dos domicílios, com 7,2 milhões de habitantes, 3,6% do total. Ou seja, um em cada quatro lares brasileiros ainda vivia, em 2013, algum grau de insegurança alimentar. A pesquisa usou a Escala Brasileira de Insegurança Alimentar (EBIA) onde considerou em segurança alimentar (SA) um domicílio cujos moradores, nos 90 dias anteriores à entrevista, tiveram acesso a alimentos em qualidade e quantidade adequadas e não se sentiram na iminência de sofrer restrição de alimentação. Em Insegurança Alimentar Leve (IL), estão os lares nos quais, no período de referência, foi detectada preocupação com a quantidade e qualidade dos alimentos. A Insegurança Alimentar Moderada (IM) ocorre em residências
com restrição na quantidade de comida. E a Insegurança Alimentar Grave (IG) aconteceu em domicílios nos quais faltam alimentos, atingindo não só adultos, mas também crianças, podendo chegar à fome. Apesar dos dados representarem uma parcela pequena da população, a situação brasileira é considerada uma das mais críticas e paradoxais, uma vez que nosso país é um dos maiores produtores de alimentos do mundo. O esforço mundial para o combate à fome tem alicerce na realidade brasileira. Recentemente, o governo brasileiro chegou a criar um programa interno de combate à desnutrição, o Fome Zero (8).
É válido ressaltar que um programa alimentar como o brasileiro, não pode vislumbrar apenas “erradicar a fome”. Trata-se de uma reflexão bem mais ampla, envolvendo aspectos econômicos da distribuição de renda, cultura e educação alimentar das famílias. O Programa Fome Zero propõe uma integração das políticas de melhoria de renda com as ações de combate à fome (5,9). Isso demonstra que a questão da segurança alimentar não deve ter um caráter de resolução imediatista. É necessário garantir quantidade, qualidade e continuidade no acesso à boa alimentação, além de condições básicas de vida adequadas às pessoas, para assegurar que a fome de hoje não se torne desnutrição amanhã.
O período pré-natal constitui uma convergência crítica dos fatores de curto e longo prazo que afetam a saúde ao longo da vida (10,11). A quantidade inadequada de nutrientes essenciais durante os períodos cruciais do desenvolvimento fetal pode levar a reprogramação dos tecidos, predispondo o indivíduo a doenças crônicas na vida adulta, fundamentando o conceito da programação fetal(12).
1.1.1 MÁ NUTRIÇÃO MATERNA - INDICADORES ATUAIS
De acordo com dados publicados em 2012 pela OMS, a desnutrição materna continua sendo um problema de saúde pública mundial e está relacionada ao baixo peso ao nascimento. Por ano, cerca de 20 milhões de crianças em todo o mundo nascem com baixo peso, o que representa aproximadamente 15,5% dos nascimentos. No Brasil, dados mais recentes mostram que o baixo peso ao nascer acomete aproximadamente 8% dos nascidos vivos, sendo os maiores índices de baixo peso encontrados em regiões
de maior desenvolvimento socio econômico como o Sul e Sudeste (8,13). A nutrição materna tem recebido atenção das políticas de saúde pública, com o desenvolvimento de campanhas de conscientização popular sobre a importância da nutrição adequada tanto no período intrauterino quanto nos primeiros anos da infância. Em 2015, a OMS propôs como uma das metas globais a serem cumpridas até o ano de 2025, a redução em 30% do baixo peso ao nascimento. Paralelamente, a Pastoral da Criança lançou uma campanha de conscientização intitulada “Toda gestação dura 1000 dias”, a fim de levar ao conhecimento popular a importância dos cuidados com as condições de saúde e nutrição desde o período gestacional até o segundo ano de vida. No Brasil, atualmente a assistência pré-natal inclui o acompanhamento e o monitoramento do ganho de peso gestacional e prevê orientações nutricionais voltadas às mulheres no período que vai da gravidez à amamentação (14,15).
1.2 HISTÓRICO DA PROGRAMAÇÃO FETAL
O pesquisador inglês David Barker, em 1989 (16), foi pioneiro ao relacionar a nutrição durante o período intrauterino e a infância ao risco aumentado para o aparecimento de doença cardíaca no adulto. Desta forma, Barker interpretou o ambiente fetal como um novo componente na etiologia das doenças cardiovasculares e fundamentou aquela que ficou conhecida como hipótese de Barker. Posteriormente, Barker (16–18) obteve novas evidências da associação entre o baixo peso ao nascer e o desenvolvimento de doenças cardiovasculares no adulto, fortalecendo a hipótese de que o retardo do crescimento intrauterino (RCIU) aumenta o risco de desenvolver doenças cardiovasculares na fase adulta, independente da exposição a outros fatores de risco clássicos como obesidade, sedentarismo e tabagismo.
Entretanto, os primeiros estudos datam da década de 60, quando Rose (19) mostrou que na família de pacientes com doença isquêmica cardíaca, havia o dobro de registros de irmãos natimortos e de mortes prematuras na infância em relação aos demais pacientes. Forsdahl, em 1967(20), demonstrou que os índices de mortalidade infantil em anos anteriores correlacionavam-se à prevalência de doença cardíaca aterosclerótica daquele ano na Noruega.
Porém, apenas no ano de 1991 (21), o conceito de programação fetal foi definido por Alan Lucas , como sendo a “resposta permanente do organismo a
um estímulo ou insulto durante um período crítico do desenvolvimento embrionário e fetal”. Portanto, o ambiente materno atua como uma previsão das condições que o feto irá encontrar após o nascimento. O feto responde e adapta-se a esta previsão, usando estratégias a fim de maximizar sua chance de sobrevivência (22).
Posteriormente, Roseboom e colaboradores, em 2006(23), realizaram um levantamento importante de indivíduos que foram gestados durante o período da “Fome Holandesa”. Este foi um período (1944 - 1945) de escassez intensa de alimentos imposta pelo exército alemão durante a II Guerra Mundial. O suprimento foi cortado inclusive para crianças, lactantes e mulheres grávidas, que normalmente tinham direito a uma quantidade extra. Eles observaram que estes indivíduos apresentaram baixo peso ao nascer e redução da circunferência do crânio e, quando adultos, os mesmos apresentaram desequilíbrio metabólico. Mais tarde foram estabelecidas associações entre o surgimento de doenças em adultos e o período de exposição à fome durante a gestação e ficou evidente que aqueles expostos à fome logo no início da gestação apresentavam complicações mais graves quando adultos (23,24).
Desde então, vários modelos experimentais de subnutrição gestacional foram desenvolvidos, nos quais o baixo peso da prole ao nascer foi associado à elevação pressórica na idade adulta(16,25).
1.2.1 MODELOS DA PLASTICIDADE DO DESENVOLVIMENTO E RESPOSTA PREDITIVO-ADAPTATIVA
As adaptações que o embrião e o feto realizam em resposta a estímulos ambientais precoces e os caminhos delineados a partir dessas variáveis são agrupados sob a expressão de “plasticidade do desenvolvimento”, e são responsáveis pela grande variedade de fenótipos que podem resultar de um único genótipo (26). Essas mudanças não são dependentes da sequência de bases do ácido desoxirribonucleico (DNA), mas podem ser repassadas às futuras gerações. Nesse caso, por meio de “sinais” do ambiente intrauterino, o indivíduo se prepara para o que acontecerá após o seu nascimento. A biologia experimental evidencia vários exemplos do fenômeno descrito. Na salamandra mexicana (Ambystoma mexicanum ou Axolotl), as condições ambientais
precoces determinam se o animal maduro será puramente aquático ou terá qualidades de anfíbio também (27). Já os ratos silvestres das pradarias norte-americanas, no outono nascem com o pelo mais longo quando comparado aos animais nascidos na primavera, mesmo os que nasceram em dias com duração de luz e temperaturas idênticas. Neste caso, o ambiente intrauterino seria capaz de “informar” ao feto de que a duração e a temperatura dos dias estão reduzidos no primeiro grupo e aumentados no segundo(28). Estes são exemplos de como ainda na vida intrauterina, o feto realiza adaptações a partir da interação entre o seu genótipo e as influências ambientais, as quais levarão a um fenótipo específico, mais adaptado à sobrevida e à reprodução no ambiente extrauterino previsto ainda intrauterinamente.
1.2.2 MECANISMOS ENVOLVIDOS NA PROGRAMAÇÃO FETAL
Entre os estudos que sugerem as causas relacionadas à origem da programação fetal, temos: 1) fatores ambientais aos quais a genitora está submetida, como a exposição a toxinas e baixas concentrações de oxigênio, o consumo abusivo de substâncias tidas como de abuso, entre elas o álcool e a nicotina; 2) situações onde a saúde da gestante encontra-se acometida, como a pré-eclâmpsia, o diabetes gestacional e infecções virais e bacterianas; 3) situações de estresse gestacional e fatores relacionados à condição nutricional materna, como a disponibilidade proteica e/ou calórica e de macro e micronutrientes provindos da dieta durante o período gestacional. Estes fatores podem estar relacionados a mecanismos como alterações morfológicas e funcionais na placenta, redução na disponibilidade de substrato energético para o feto, alterações no fluxo de oxigênio placentário bem como modulações na secreção hormonal materna podendo resultar em alterações no crescimento e no desenvolvimento fetal. Além disso, no individuo adulto podem determinar maior propensão ao desenvolvimento de determinadas doenças, tais como as doenças metabólicas e cardiovasculares (29,30).
Em ratos, a restrição proteica gestacional está associada ao aumento no tamanho da placenta (31) e de sua superfície de troca, bem como a redução no fluxo sanguíneo uterino e, portanto, poderíamos associar a diminuição da eficiência do transporte placentário de aminoácidos e glicose (32). Tem-se descrito que a prole de mamíferos são capazes de se adaptar a menor
disponibilidade proteica durante o período gestacional às custas de alterações metabólicas, redistribuindo o fluxo sanguíneo fetal e alterando a síntese de hormônios fetais e placentários que regulam o crescimento fetal (33). A resposta imediata do feto submetido à desnutrição no período intrauterino estaria associada ao catabolismo, à redução da taxa metabólica e à consequente redução na taxa de crescimento fetal. Além disso, há também redistribuição do fluxo sanguíneo nos tecidos fetais, onde se prioriza a perfusão de órgãos importantes para a sobrevivência fetal, como o cérebro, com o intuito de proteção destes tecidos contra a hipóxia e a escassez de nutrientes disponíveis (11,18,34).
Os glicocorticoides são moléculas com propriedades lipofílicas capazes de atravessar livremente a barreira placentária, no entanto, em condições fisiológicas, sua concentração no feto é menor em relação à mãe/genitora. Esse gradiente de concentração se mantém devido a atividade da enzima 11-β hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 placentária (11-βHSD-2), que atua como uma barreira bioquímica, inativando os esteroides em sua forma bioativa (cortisol em humanos ou corticosterona em ratos) e convertendo em metabólitos inativos/ou menos ativos (cortisona em humanos ou 11 deidrocorticosterona em ratos), evitando assim que os corticoides maternos acessem livremente a circulação fetal (31,35–37). A restrição proteica materna tem como consequência redução tanto da atividade quanto da expressão da enzima 11-βHSD-2 placentária. O feto precocemente exposto à alta concentração de glicocorticoides apresenta alterações que promovem desenvolvimento e maturação precoce de diversos tecidos fetais (Figura 1). Estudos demonstram que essa superexposição fetal aos glicocorticoides maternos ocasiona a hiperatividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) da prole, estando associada diretamente ao desenvolvimento de alterações renais e de hipertensão arterial no adulto (25,36,37). Além disso, também encontramos dados onde a exposição precoce aos glicocorticoides estaria associada a diversas alterações como a redução no peso ao nascer e ao maior risco de eventos cardiovasculares no indivíduo adulto(31,38,39).
Figura 1 - Representação esquemática da participação da 11β-HSD2 placentária na
programação fetal.
Dessa forma, torna-se evidente o envolvimento neuroendócrino na programação da hipertensão arterial, sendo o eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal envolvido, ao mesmo tempo, como o alvo das influências ambientais ou como o mediador das relações entre eventos precoces e hipertensão na vida adulta (40).
1.2.3 PROGRAMAÇÃO FETAL E CRESCIMENTO CATCH-UP
Catch-up growth pode ser definido como ganho de peso e/ou de crescimento maior que os limites estatísticos de normalidade para idade e maturidade, durante um período de tempo definido, o qual segue um período de inibição transitória do crescimento. O catch-up growth é um processo fisiológico relativo à recuperação do tamanho de um organismo submetido à restrição nutricional, para que ele alcance o tamanho próprio para idade, sexo e grau de maturação, dependendo da ação do eixo somatotrófico pelo aumento dos receptores hormonais. Essa recuperação, vinda de condições desfavoráveis ao crescimento durante o período pré-natal e pós-natal precoce, pode influenciar o risco de
STRESS SUBNUTRIÇÃO DROGAS DOENÇA MATERNA RESTRIÇÃO DO CRESCIMENTO INTRAUTERINO – IURC / MATURAÇÃO PRECOCE DOS TECIDOS
PROGRAMAÇÃO DE DOENÇAS NA IDADE ADULTA
Cortisona
Cortisol
Cortisol
11 β HSD 2 11 β HSD 2desenvolvimento de doenças cardiometabólicas ao longo da vida. No entanto, a recuperação do crescimento em curto prazo oferece vantagens para o neurodesenvolvimento, particularmente para crianças nascidas com peso muito baixo, e também contribui para o aumento da resistência às infecções (33,41,42). Alguns estudos de coorte realizados em Helsinki mostraram que em homens e mulheres com restrição de crescimento intrauterino (RCIU), o crescimento acelerado ou catch-up durante a infância aumentou o risco de doença cardíaca coronária (43). A programação de doenças metabólicas devida ao crescimento mais rápido na infância é um achado obtido nas populações e, quando há suplementação com fórmula enriquecida com nutrientes para recém-nascidos pequenos para a idade gestacional, é observado aumento no ganho de peso e aumento da pressão arterial diastólica quando o indivíduo chega na idade de 6-8 anos. Outros estudos também sugerem que existe associação "dose-resposta" entre o crescimento aumentado pós-natal e, posteriormente, o risco de doença cardiovascular (21,44).
No nosso laboratório, tem sido observado que quando a restrição de proteína ocorre apenas durante a prenhez a pressão arterial sistólica é aumentada da 8ª a 16ª semana de idade e quando a restrição à proteína é mantida no período de lactação o aumento pressórico aparece na 16ª semana. Desta forma, sugere-se que a função cardiovascular pode ser prejudicada antecipadamente quando há incompatibilidade entre o ambiente pré e pós-natal. Alguns mecanismos têm sido propostos e uma possibilidade é que o crescimento catch-up se dá em uma massa celular limitada devido à restrição do crescimento fetal, que poderia interromper a função das células. Além disso, o tamanho corporal grande impõe demanda metabólica excessiva desta massa celular reduzida. Outra relação possível entre catch-up e doença cardíaca coronariana está relacionada com as mudanças hormonais durante o desenvolvimento que poderiam persistir após o nascimento influenciando no desenvolvimento de doenças do coração (32,36,41,45).
1.3 ENRIQUECIMENTO DO AMBIENTE
O enriquecimento do ambiente ou ambiente enriquecido (AE) é composto por uma combinação de estímulos (inanimados e sociais). Animais em
ambientes enriquecidos são criados em grupos maiores do que o habitual e mantidos em espaços maiores do que a gaiola padrão e com uma variedade de objetos ofertados para recreação (brinquedos, túneis, tocos de madeira e escadas) e que podem ser modificados na sua disposição. Uma importante característica do ambiente enriquecido é a oportunidade de alcançar altos níveis de atividade física voluntária em rampas ou rodas giratórias (46).
Alguns estudos já demonstraram que o AE pode provocar mudanças neurocognitivas em nível molecular, anatômico e funcional, tendo efeito benéfico sobre uma variedade de processos neurocognitivos, como a melhora da aprendizagem e da memória, assim como a redução do declínio cognitivo, tipicamente associado com o envelhecimento (47) . A exposição ao AE também apresentou efeitos benéficos em modelos animais com desordens do sistema nervoso, incluindo doenças neurodegenerativas, lesão cerebral e algumas mutações que comprometiam a plasticidade sináptica e aprendizagem (46,48,49). Observou-se, que o AE contribui para o aumento da sinaptogênese no hipocampo, tendo sido encontrado aumento do número de espinhas dendríticas e de sinapses em algumas populações neuronais após exposição ao AE (50,51). No entanto, não temos estudos evidenciando as consequências metabólicas dessa exposição.
1.4 ESTRUTURA RENAL
Os rins são embriologicamente originados a partir do mesênquima metanéfrico e têm em sua composição unidades funcionais chamadas de nefro. Os nefros podem ser de dois tipos:
✓ Nefros Corticais: Seus corpúsculos estão localizados na parte externa do córtex, tem alças de Henle mais curtas e se estendem até a parte superficial da medula.
✓ Nefros Justamedulares: Seus corpúsculos ocorrem em proximidade à base de uma pirâmide medular, ou seja, próxima a interface córtico-medular, tem alças de Henle mais longas e
segmentos ascendentes delgados longos que se estendem para dentro da região interna da pirâmide.
O nefro é a unidade funcional do rim e constituído pelo corpúsculo renal. Este por sua vez é constituído pelo glomérulo (conjunto de capilares) + cápsula glomerular (Figura 2 A). Os capilares que formam o glomérulo são do tipo fenestrados, têm aberturas na sua parede que facilitam a filtração, o folheto visceral é formado por células chamadas de podócitos (possuem corpo e prolongamentos que abraçam os capilares e formam espaços onde ocorre também a filtração - Figura 2 B). Os podócitos são células responsáveis por aproximadamente 40% da resistência hidráulica e elétrica do fluxo transglomerular de solutos e água. A regulação e a manutenção do citoesqueleto dos podócitos surgem como processo fundamental para regular o tamanho, a permeabilidade e a seletividade das fendas de filtração (52,53). Entre os podócitos existe a fenda de filtração, local de facilidade para substâncias atravessarem, mas que são recobertas pelo diafragma da fenda de filtração, que é uma importante proteína transmembrana estrutural controlando seletivamente a permeabilidade capilar. Envolvendo o glomérulo temos uma cápsula com tecido epitelial de revestimento plano simples, com duas porções: um folheto associado intimamente à parede dos capilares (folheto visceral) e um parietal. O espaço entre os folhetos é chamado espaço capsular (54). O sangue chega nos glomérulos através de uma artéria que se ramifica em capilares que filtram o sangue. A substância filtrada se encontra no espaço capsular e, na sequência passa para o túbulo contorcido proximal. Entre a parede dos capilares glomerulares e o folheto visceral temos um conjunto de lâminas basais (lâmina interna, lâmina externa e lâmina densa), chamada membrana basal glomerular. Nos espaços entre os capilares glomerulares são encontradas as células mesangiais e sua matriz extracelular. Essa célula auxilia dando suporte estático e dinâmico para a região, produzindo/ fagocitando matriz extracelular, atuando na fagocitose de resíduos da filtração e ainda possui receptores para o hormônio natriurético, que atua nessa célula e auxilia na regulação da quantidade de sódio
liberada na urina e auxiliando na regulação da pressão arterial. As células mesangiais são contráteis e tem receptores para angiotensina II (52,55,56).
Figura 2 – Representação esquemática da estrutura renal - Capsula Glomerular (A); Arranjo
Podocitário (B); Eletromicrografia de varredura tufo glomerular (C) – Adaptado de Junqueira´s Basic Histology - Text and Atlas - 14 ed. Mc Graw Hill Education, 2016. p. 400 (1).
Os podócitos se contrapõem as forças de distensão que agem sobre os capilares. A lâmina basal do capilar fenestrado e a lâmina basal da célula podocitária formam a membrana basal glomerular. E entre os podócitos existe a fenda de filtração, local de facilidade para substâncias atravessarem, mas que
Pólo Tubular VascularPólo
←Fluxo Sanguíneo ←Fluxo do Filtrado Glomérulo Arteríola aferente Aparelho justaglomerular: Mácula Densa Túbulo distal Célula justaglomerular Pedicelo Endotélio do glomérulo Camada parietal da cápsula glomerular Túbulo contorcido proximal Espaço capsular
Podócito da camada visceral da cápsula glomerular
Lumem capilar
Corpo celular podocitário
Capilar Glomerular
Pedicelos Fendas de filtração
Membrana de Filtração Endotélio do capilar fenestrado
Membrana basal do capilar Fendas de filtração da camada visceral Membrana de Filtração Pedicelos Podócito
Capilar glomerular coberto por podócitos
B) C)
são recobertas pelo diafragma da fenda de filtração, que é composto por uma proteína transmembrana estrutural controlando seletivamente a permeabilidade capilar. A regulação e a manutenção do citoesqueleto dos podócitos surgem como processo fundamental para regular o tamanho, a permeabilidade e a seletividade das fendas de filtração (52,53).
A rede capilar glomerular é formada a partir da capilarização da arteríola aferente, a qual penetra o corpúsculo renal através do seu polo vascular. As células glomerulares endoteliais são fenestradas, e apresentam poros de 50 a 80 nm, e, na superfície luminal, essas células são revestidas por um glicocálice constituído por proteoglicanos e glicosaminoglicanos, que mantém a carga negativa nesta superfície. Tais capilares são envoltos por células epiteliais altamente modificadas do folheto visceral, podócitos, cujo citoplasma emite prolongamentos primários e secundários que se apoiam sobre a lâmina basal situada entre estes e a superfície externa dos capilares. Os prolongamentos de podócitos adjacentes são conectados por junções intercelulares modificadas (1,56,57). No polo vascular chega uma arteríola aferente e sai uma eferente. A arteríola aferente sofre modificações e perde limitante elástica interna e células musculares lisas e aparecem células justaglomerulares (chamadas de mácula densa) que detectam a quantidade de Na+ no fluído tubular, e quando a quantidade deste íon está diminuída, ordena as justaglomerulares a produzirem renina. Nesta região existem também as células extraglomerulares. O conjunto formado pelas células da macula densa, as extraglomerulares e as justaglomerulares formam aparelho justaglomerular. (52,54).
Ainda como constituinte da estrutura renal, temos os túbulos contorcidos proximais, distais e coletores, além da alça de Henle (Figura 3 A). O túbulo contorcido proximal é o local inicial e principal de reabsorção de íons. Suas células são mais largas e acidófilas devido à presença de mitocrôndias em grandes quantidades, que servem para fornecer à célula energia (ATP) para realizar o transporte ativo das substâncias. Suas células epiteliais se apresentam cubóides unidas por junções de oclusão ricas em claudinas formadoras de poro permitindo a reabsorção isosmótica de 70% da água, do bicarbonato, e do cloreto de sódio, e também de íons cálcio e fosfato. Glicose, aminoácidos e íons são absorvidos por transporte ativo, enquanto a água se difunde passivamente pela via paracelular (1,56). Uma proteína de suma importância na reabsorção
de íons e água nos túbulos contorcidos proximais é a Bomba de Na+/K+- ATPase, localizada nas pregas basolaterais da membrana plasmática e responsável pela reabsorção de Na+, que é a principal força impulsionadora para a reabsorção de água no túbulo contorcido proximal. O transporte ativo de Na+ é seguido pela difusão passiva de Cl- para manter a neutralidade eletroquímica. O túbulo proximal também reabsorve aminoácidos, monossacarídeos e polipeptídeos. A reabsorção de aminoácidos e glicose depende do transporte ativo de Na+. No túbulo reto distal a membrana apical possui simportes que permitem a entrada de Na+, Cl-, K+ entrem na célula provenientes da luz, enquanto que na sua membrana basolateral também existem diversas bombas de Na+/K+-ATPase. Suas células são cúbicas cilíndricas com poucos microvilos e poucas interdigitações (Figura 3 B). O túbulo contorcido distal é composto por células menores, sem borda em escova, com invaginações da membrana basolateral nesse segmento a reabsorção de sódio é influenciada pela aldosterona, bem como a reabsorção de íons bicarbonato com secreção de H+ e secreção de amônia. Por último, temos os túbulos coletores compostos de epitélio simples com células cúbicas cilíndricas constituídas por dois tipos celulares, sendo elas, as células principais com núcleo central, prolongamentos verdadeiros, um único cílio, quantidade pequena de microvilosidades e poucas mitocôndrias com abundância de canais de água regulados pelo hormônio ADH, e as células intercalares de citoplasma mais denso e com muitas mitocôndrias envolvidas na secreção de H+ e bicarbonato (Figura 3 B) (52,54,56).
Figura 3 – Representação esquemática dos componentes do nefro (A); Diagrama de
representação das principais diferenças estruturais entre as células cubóides dos túbulos proximal e distal. (B) – Adaptado de Junqueira´s Basic Histology - Text and Atlas - 14 ed. Mc Graw Hill Education, 2016. p. 403 (1).
A alça de Henle tem várias subdivisões tais como: 1) ramo descendente espesso da alça que não é especializado em absorção, possui borda em escova menos desenvolvida e prolongamentos laterais e basolaterais menos complexos e em menor número; 2) o ramo descendente delgado da alça que é altamente permeável a água e menos permeável a substâncias como NaCl e ureia; e 3) o segmento ascendente delgado da alça que não realiza transporte ativo de íons, mas é altamente permeável ao NaCl, permitindo sua difusão passiva pra dentro do interstício (56).
As mínimas alterações com relação ao número de nefros ou ao seu volume podem ser responsáveis por uma gama vasta de problemas renais e no metabolismo corpóreo de modo geral. A nefrogênese em humanos se inicia na nona semana de gestação, continuando até a 36ª semana, sendo o último trimestre, um período descrito como de rápida proliferação dos nefros. Em ratos, a nefrogênese começa por volta do 12º dia embrionário e termina entre o 10º e
Alça do néfro Corpúsculo renal Túbulo contorcido proximal Microvilos altos Microvilos escassos e curtos Núcleo Mitocondria Membrana Basal
B)
A)
Arteríola Eferente Arteríola Aferente Túbulo contorcido distal Ducto Coletor15º dias após o nascimento (58–61). Até o momento, já foram observadas várias alterações na estrutura e/ou função renal provenientes da programação fetal, incluindo aumento no estresse oxidativo, alterações no sistema renina-angiotensina (SRA) e em transportadores de sódio e aumento na atividade simpática renal (44,60,62,63).
1.5 RESTRIÇÃO PROTEICA COMO MODELO EXPERIMENTAL DE PROGRAMAÇÃO
Dentre os modelos experimentais de programação fetal, têm sido bastante utilizadas variações no conteúdo de proteína da dieta gestacional para produzir restrição que pode ser classificada como: leve (12% de caseína), moderada (9%) e grave (6%) (31). Esses experimentos resultaram em alterações variáveis no peso dos recém-natos bem como no tamanho das placentas. Um estudo com ratos machos submetidos à restrição proteica durante a gestação (18% de proteína grupo controle / 9% de proteína grupo restrição) desenvolveram hipertensão arterial a partir da quarta semana de vida a qual se manteve até a idade adulta (42). Estudos realizados em nosso laboratório demonstraram que animais submetidos à restrição proteica gestacional nascem com peso cerca de 8% menor além da redução de cerca de 28% no número de nefros e, ao longo da vida, apresentam elevação dos níveis pressóricos (60). Em resposta a sobrecarga pressórica, uma das principais alterações cardíacas em decorrência da programação fetal é a hipertrofia do ventrículo esquerdo, um processo de remodelação primária que ocorre no miocárdio (64).
A exposição materna à dieta isocalórica, mas hipoproteíca, causou elevação na resistência das arteríolas aferente e eferente glomerulares sendo esta elevação responsável pela redução da taxa de filtração glomerular e do fluxo sanguineo renal na prole adulta (65). Em seres humanos, dados epidemiológicos apontaram uma elevação da pressão arterial em condições de desnutrição crônica (66). O mecanismo comum, que pode estar envolvido nos achados fisiopatológicos cardiovasculares e renais, inclui modificações na reatividade vascular e participação do sistema renina-angiotensina aldosterona (SRA). Entretanto, até o presente momento, poucos estudos investigaram a implicação da programação fetal, induzida pela exposição materna à dieta hipoproteica,
durante a gestação e aleitamento, nas alterações morfológicas e funcionais renais e cardíacas, na pressão arterial e na expressão de componentes do sistema renina-angiotensina aldosterona.
Tanto o sistema cardiovascular quanto os rins são frequentemente alterados pela exposição materna à restrição proteica gestacional e alterações nestes sistemas e/ou órgãos estão envolvidas na gênese de doenças importantes em termos de saúde pública. As doenças cardiovasculares (DCV) são a primeira causa de morte no mundo e mais de três quartos das mortes por DCV ocorrem em países de renda média e baixa. Em 2012, estima-se que 17,5 milhões de pessoas morreram de doenças cardiovasculares, o que representa 31% de todas as mortes globais(67). Sabe-se que a etiologia das doenças cardiovasculares está relacionada a fatores genéticos, bem como a fatores de risco ambientais e comportamentais pós-natais, como dieta pouco saudável, sedentarismo, tabagismo e uso nocivo do álcool. No entanto, tem sido dada atenção ao ambiente intrauterino como fator preditivo de hipertensão e CVD na vida adulta (38,39,68).
A Doença Renal Crônica (DRC) é um problema de saúde pública importante no mundo, afetando mais de 50 milhões de indivíduos (69). A DRC tem sido considerada epidemia mundial cujo diagnóstico ocorre tardiamente e o prognóstico é imprevisível (39,69). Por esta razão, existe a necessidade de identificar os fatores envolvidos na gênese e no risco de progressão da DRC para permitir intervenções de terapia inovadora e precoce (69,70). Como citado anteriormente, tem sido demonstrado em estudos recentes que a restrição proteica gestacional leva à redução do número se nefros e consequente sobrecarga aos nefros remanescentes predispondo às doenças renais nos adultos (58).
1.6 PROGRAMAÇÃO FETAL E ALTERAÇÕES RENAIS
Estudos realizados em nosso laboratório demonstraram que animais submetidos à restrição proteica gestacional (grupo low protein – LP, 6% de teor proteico na ração), nascem com peso corpóreo menor, com cerca de 28% menos de nefros (Figura 6) e, a partir da oitava até a 16ª semana de vida, apresentam maiores níveis pressóricos (Figura 4).
Figura 4 - Pressão arterial sistólica em machos de prole cujas mães receberam dieta normal
(17% caseína) ou hipoproteica (6% caseína) somente durante a gestação e durante a gestação e a amamentação (dados não publicados).
Nosso grupo também demonstrou em animais LP, a reduzida expressão dos receptores tipo 1 e 2 (AT1R e AT2R, respectivamente) de angiotensina II e das proteínas envolvidas na sua via de sinalização (Figura 5) (71). Adicionalmente, a hipertensão nos animais LP com 16 semanas de vida esteve associada ao aumento na reabsorção de sódio pelo nefro proximal resultando em retenção de sódio (60,72).
Figura 5 - Representação esquemática dos efeitos renais da restrição proteica gestacional -
Adaptado de Boer, 2017 (2).
No ano de 1988, Brenner e colaboradores (73)sugeriram que a deficiência congênita no número de nefros, predispõe à redução na excreção renal de sódio aumentando a susceptibilidade à hipertensão arterial. Atualmente, temos vários modelos de desenvolvimento programado associando a redução no número de nefros à hipertensão arterial e demonstrando que a perda de nefros gera hipertrofia compensatória dos glomérulos remanescentes (aumentando seu volume) e hiperfiltração (aumento da taxa de filtração glomerular para cada nefro) a fim de sustentar a função renal, o que causa sobrecarga funcional e perda precoce de podócitos (Figura 6) (58,60,74,75).
↑ 50 % reabsorção proximal
↓ 47 % reabsorção pós proximal
↓ 50 % uirnário
↓ AT2R ↓ AT1 e AT2R
14.5 dias
gestacionais
16 semanas
12 dias pós
-natal
Figura 6 - Representação esquemática do corpúsculo renal mostrando sua estrutura em
indivíduos saudáveis e as possíveis alterações provocadas pela redução no número de néfrons (2).
A hipertensão arterial está diretamente associada ao bom funcionamento da bomba de Na+K+ATPase que é uma proteína transmembrana que garante o transporte Na+ - K+ mesmo contra o gradiente de concentração (13,72). Este mecanismo é importante para vários processos fisiológicos, dentre eles a manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico e a regulação da pressão arterial. No néfro, esta proteína se localiza principalmente no início do túbulo proximal onde cerca de 70% de Na+ e K+ são reabsorvidos junto com a glicose, Cl- dentre outros
Podócito parietal
Indivíduos
programados com
números de nefros
reduzidos
Célula epitelial parietal parietal Matrix mesangial A redução na área de filtração glomerular e hiperfluxo promovem aumento do diâmetro capilar (1) e descolamento e perda de podócitos (2) As células epiteliais parietais podem aumentar a migração e a diferenciação em novos podócitos (3) ou proliferar produzindo crescentes (4), caracterizada por fibrose
pericapilar (5), esclerose do tufo capilar (6), proliferação de células Podócito visceral
solutos. Essa bomba também é encontrada na porção espessa ascendente da alça de Henle onde aproximadamente 25% de NaCl, K+, Ca2+ são reabsorvidos e no início dos túbulos distais onde pouco mais de 5% de NaCl são reabsorvidos. Logo, alterações na expressão desta proteína poderiam ocasionar um prejuízo nos processos de reabsorção, interferindo no equilíbrio hidroeletrolítico (72).
Outro componente chave envolvido nos mecanismos de controle da pressão arterial é o Sistema Renina – Angiotensina – Aldosterona (SRA). A Angiotensina do tipo II atua preferencialmente via 2 tipos de receptores, o tipo 1 (Angiotensin II receptor type 1 - AT1R) e o tipo 2 (Angiotensin II receptor type 2 - AT2R), a maior parte dos efeitos fisiológicos da Angiotensina II ocorre via receptor do tipo AT1R, que são distribuídos amplamente em todos os órgãos (76). Já a expressão de AT2R diminui após o nascimento, no entanto pode ser induzida por uma situação patológica. Em adultos, este receptor também é expresso no pâncreas, coração, rim, adrenal, miométrio, ovário, cérebro e vasculatura (71,72). Uma vez que a Angiotensina II se liga ao receptor AT1R/AT2R, é ativada uma série de cascatas de sinalização. Uma das vias de sinalização da Angio II é a via JAK (Janus kinases) / STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription proteins). Nesta via, a Angio II, ao ligar-se ao AT1R/AT2R ativa a JAK-2 levando a fosforilação de STAT. Ou seja, JAK fosforila STAT que são translocadas para o núcleo, onde ativam a transcrição destes genes. No entanto, temos outras vias paralelas de ativação de JAK e de STAT que independem da ação de angiotensina II.
Temos também as sintases de óxido nítrico (NOSs) que são uma família de enzimas responsáveis por catalisar a produção de óxido nítrico (NO). O NO é uma importante molécula de sinalização celular envolvida diretamente na manutenção do tônus vascular e na regulação da pressão sanguínea(77,78). Também atua na secreção de insulina, no tônus das vias aéreas e no peristaltismo, e ainda está envolvido na angiogênese e no desenvolvimento neural (79–83).
Três genes distintos codificam as diferentes isoenzimas NOS: neuronal (nNOS ou NOS-1), indutora de citocina (iNOS ou NOS-2) e endotelial (eNOS ou NOS-3). iNOS e nNOS são solúveis e encontram-se predominantemente distribuídas no citoplasma, enquanto a eNOS está associada à membrana (80).
Em contrapartida a Superóxido Dismutase (SOD) corresponde a uma família de enzimas que faz parte do sistema enzimático de defesa contra a formação de espécies reativas de oxigênio. Em humanos, existem descritas três isoformas de superóxido dismutase. A SOD1 encontra-se no citoplasma celular, a SOD2 predominante nas mitocôndrias e SOD3 no líquido extracelular (84).
Um evento importante presente no desenvolvimento de diversas doenças renais é a transição epitélio mesenquimal (TEM) onde TGF β (fator de crescimento transformante-β) é tido como principal fator indutor. A TEM é um processo biológico que permite que uma célula epitelial polarizada, sofra inúmeras modificações bioquímicas e morfológicas, assumindo fenótipo de célula mesenquimal, passando a ter maior capacidade migratória, invasiva, resistência à apoptose e produção de componentes da MEC (Matriz Epitélio Mesenquimal)(85). A TEM pode ser classificada em três diferentes subtipos, baseando-se no contexto biológico em que estaria ocorrendo. A TEM tipo I estaria associada com a implantação, embriogênese e desenvolvimento do órgão – as células mesenquimais possuem duas características chave importantes no desenvolvimento embrionário: são capazes de migrar através de uma matriz extracelular e subsequentemente se diferenciar em muitos tipos celulares diferentes da linhagem mesenquimal, incluindo fibroblasto. A TEM tipo II estaria relacionada com a regeneração tecidual e fibrose e a do tipo III ocorreria em células neoplásicas (Figura 7) (86,87).
Figura 7 - Representação esquemática das diferentes transições epitélio-mesenquimais. A) Tipo
I, está associado com a embriogênese e implantação. B) Tipo II, relaciona-se com a regeneração tecidual e fibrose. C) Tipo III, ocorre em células neoplásicas - Adaptado de Scanlon et al, 2013 (88).
