ANÁLISES DE QUALIDADE E ROTULAGEM NUTRICIONAL

4.1.1. Material

O estudo consistiu de análises das características físico-químicas, microscópicas e microbiológicas, para se avaliar a qualidade higiênico-sanitária de dez diferentes marcas (um lote por marca) do complemento alimentar “Ração Humana”, adquiridas no mercado regional na cidade de Niterói-RJ.

As análises físico-químicas foram realizadas no Laboratório de Nutrição Experimental (LABNE) da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro, da Universidade Federal Fluminense (UFF), em Niterói.

As análises microscópicas e microbiológicas, foram realizadas nos Laboratórios de Bromatologia e de Microbiologia de Alimentos, respectivamente, ambos da Faculdade de Farmácia da UFF.

Os ingredientes contidos em cada uma das marcar são apresentados a seguir (Quadro 1).

Marca 1

Farelo de aveia, fibra de trigo, gérmen de trigo, extrato de soja, guaraná em pó, gelatina natural, linhaça dourada, levedo de cerveja, açúcar mascavo, cacau em pó e quinoa em flocos.

Marca 2

Fibra de trigo, leite de soja, farinha de soja, linhaça moída, açúcar mascavo, aveia em flocos, gergelim, gérmen de trigo, gelatina, colágeno, quinoa em pó, guaraná em pó, levedo de cerveja e cacau em pó.

Marca 3 Linhaça dourada, farelo de arroz, extrato de soja, fibra de trigo, semente de girassol, gérmen de trigo, gergelim, aveia e quinoa.

Marca 4

Fibra de trigo, farinha de soja, farelo de aveia, gérmen de trigo, semente de gergelim, açúcar mascavo, semente de linhaça, levedo de cerveja, gelatina em pó e guaraná em pó.

Marca 5

Fibra de trigo, linhaça, extrato de soja, aveia em flocos, gérmen de trigo, açúcar mascavo, quinoa, goma guar, farelo de aveia, gergelim, levedo e guaraná.

Marca 6

Farelo de trigo, açúcar mascavo, linhaça, aveia, gergelim, gérmen de trigo, quinoq, colágeno, guaraná em pó, cacau em pó, levedo de cerveja e aroma natural de baunilha.

Marca 7

Fibra de rigo, extrato de soja, semente de linhaça, fubá de milho branco enriquecido com ferro e ácido fólico, farinha de arroz integral, açúcar mascavo, guaraná em pó, farelo de aveia, gérmen de trigo, gergelim com casca, levedo de cerveja, cacau em pó, aveia em flocos, quinoa real em flocos e espessante ágar-ágar.

Marca 8

Fibra de trigo, quinoa real, aveia em flocos, fibra de arroz integral, gergelim, gérmen de trigo, guaraná em pó, levdo de cerveja, farinha de feijão branco, farinha de linhaça dourada, extrato de soja, fibra de berinjela, fibra de maracujá, chá verde, açúcar mascavo e colágeno hidrolisado.

Marca 9

Fibra de trigo, leite de soja, semente de linhaça dourada, aveia em flocos finos, gergelim, gérmen de trigo, farinha de quinoa, gelatina sem sabor, levedo de cerveja, cacau em pó, guaraná em pó e açúcar mascavo.

Marca 10

Semente de linhaça, aveia, cacau em pó, açúcar mascavo, levedo de cerveja, gérmen de trigo, gelatina em pó, farelo de trigo, leite de soja, gergelim e guaraná em pó.

Quadro 1: Ingredientes das 10 (dez) marcas de Ração Humana, conforme descrito nas embalagens

4.1.2. Métodos

4.1.2.1. Análise Físico-química e da Rotulagem nutricional

Foram realizadas análises físico-químicas com o objetivo de avaliar a qualidade nutricional e fidedignidade das informações nutricionais contidas nos rótulos destes produtos. Essas análises foram realizadas em duplicata.

Para determinação da composição físico-química da Ração Humana foram realizadas as seguintes análises:

a) Acidez álcool-solúvel

A acidez álcool-solúvel foi medida por titulação do filtrado com NaOH 0,1N padronizado segundo técnica estabelecida pelas normas do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2008).

Foram pesados 5 gramas de amostra em pesa-filtro de 25ml, transferido para um balão volumétrico de 100 ml com auxílio de 80ml de álcool 95%. O balão foi agitado algumas vezes e deixado em repouso por 24horas. Passado o tempo de repouso, foi completado o volume dos balões com álcool e filtrado, com papel de filtro, para um frasco seco. Em seguida, com o auxílio de uma pipeta, 20 ml do filtrado foi transferido para um erlenmeyer de 250 ml. Foram adicionadas 2 gotas do indicador de fenolftaleína e titulado com solução de hidróxido de sódio 0,1N até a mudança de coloração. Foi feita uma prova em branco usando 20 ml do mesmo álcool a 95%, adicionado 2 gotas do indicador e titulado com a solução de hidróxido de sódio. Após estes procedimentos, foi realizado o seguinte cálculo para obtenção dos resultados:

(V-V’) x f x 100 = acidez em ml de solução normal % (v/p), onde: P x c

V = ml da solução de NaOH gasto 0,1 N V’ = ml da solução NaOH gasto no branco c = 10 fator de correção para a solução a 0,1 N f = fator da solução NaOH 0,1 N – 1,0007

P = grama da amostra

b) Pesquisa de ranço

A pesquisa de ranço foi feita pela reação de Kreiss (IAL, 2008). Para isto, foi transferido com o auxílio de uma pipeta, 1,5 gramas da amostra macerada para uma proveta com rolha esmerilhada. Adicionado 5 ml de ácido clorídrico e agitado por 30 segundos. Em seguida, adicionado 5 ml de solução de floroglucina a 0,1% em éter etílico. Foi agitado novamente por 30 segundos e deixado em repouso por 10 minutos.

Na presença de substância rançosa o sobrenadante apresentará coloração rósea ou vermelha.

c) Determinação do pH

O pH foi determinado eletrometricamente (IAL, 2008), em pHmetro WTW modelo 330i/SET, previamente calibrado com soluções tampão de pH 4,0 e 7,0. Antes e após qualquer medição o eletrodo foi lavado com água destilada e secado, para que não houvesse erro na leitura.

Para medição do pH, foram pesados 10 gramas da amostra em vidro de relógio e transferido para o erlenmeyer seco, com 100 ml de água a 25°C, recentemente fervida. Em seguida o conteúdo do frasco foi agitado até que as partículas ficassem uniformemente suspensas. Ocasionalmente foi agitado por mais 30 minutos. A seguir deixado em repouso por 10 minutos. O líquido sobrenadante foi decantado para um frasco seco e, imediatamente, determinado o pH eletrometricamente.

d) Determinação da umidade

A umidade foi determinada pelo do método gravimétrico, com emprego de calor, baseando-se na perda de peso do material submetido ao aquecimento em estufa a 105°C até peso constante (IAL, 2008).

Para a realização desta análise as cápsulas foram lavadas, colocadas por 1 hora na estufa a 105ºC e colocadas para resfriar em dessecador por 30 minutos. Após este procedimento, as cápsulas de porcelana foram pesadas em balança analítica (marca Sartorius, modelo TE214S) e logo após foram pesadas, na mesma balança, cerca de 10g da amostra na cápsula de porcelana. As amostras foram aquecidas na estufa à 105ºC por 3 horas, resfriadas

em dessecador até a temperatura ambiente (30 minutos) e pesadas. Esta operação foi realizada até obter um peso constante.

e) Determinação de cinzas

As cinzas foram determinadas por incineração do material em mufla regulada a 550°C, até peso constante (IAL, 2008).

Para esta análise os cadinhos foram lavados e aquecidos em mufla a 550ºC por 1 hora e resfriados no dessecador, por aproximadamente 30 minutos, até temperatura ambiente. Após isto, os cadinhos foram pesados, em balança analítica, sendo pesado também 5 g de cada amostra dentro dos cadinhos. As amostras foram incineradas em mufla a 550ºC por 3 horas, resfriadas em dessecador até a temperatura ambiente e pesadas. Sendo esta operação repetida até obter peso constante.

f) Determinação da fração protéica

A fração protéica foi obtida pela determinação da porcentagem de nitrogênio total da amostra segundo o método de Kjeldahl, segundo a Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2005), usando o fator de conversão de 5,75, já que são amostras de origem vegetal, para obtenção da concentração deproteína.

O método Kjeldahl determina nitrogênio (N) orgânico total, isto é, o N protéico e não protéico orgânico. O procedimento do método baseia-se no aquecimento da amostra com ácido sulfúrico para digestão até que o carbono e hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia. Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando o borato de amônia. O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCl) padronizada (CECCHI, 2003).

Para a análise da proteína foi pesado o papel de seda em balança analítica da marca Sartorius, modelo TE214S, e pesado neste papel entre 0,0600 a 0,0610g das amostras. Os papeis foram dobrados cuidadosamente, colocados nos tubos de digestão e adicionado 3 mL de ácido sulfúrico concentrado. Os tubos foram levados para o bloco digestor e iniciado a digestão à temperatura de 130°C, aumentando 100°C de hora em hora, até chegar a temperatura de 430°C. Após atingir esta temperatura, foi deixado os tubos esfriarem e adicionado 5 mL de água destilada. Os tubos de digestão foram acoplados, um por vez, no

aparelho de destilação de nitrogênio previamente aquecido. No funil do aparelho foi adicionado 20 mL de NaOH 40%. Em erlenmeyer, foi adicionado 10 mL de ácido bórico a 4% e 2 gotas de indicador e destilado por aproximadamente 5 minutos. O tubo, com o material digerido, foi retirado do aparelho, e substituído por um tubo com 2 mL de água destilada, sendo novamente destilado por aproximadamente 5 minutos. Após isto, o erlenmeyer foi retirado do destilador e titulado com ácido clorídrico (HCl 0,01N) utilizando a ajuda de um agitador automático. As amostras foram tituladas até a viragem do indicador, passando de verde para rosa claro. O volume gasto de HCl 0,01N foi anotado, assim como o fator de correção (fc) do ácido para a realização do cálculo.

Cálculo:

1 ml HCl 0,01N 0,00014 g Nitrogênio Vol. HCl 0,01N x fc x g Nitrogênio

Peso da Amostra Dessecada (g) x g Nitrogênio (100 - % Umidade) de amostra dessecada y

Y = g de N / 100 g de amostra integral

Y x 5,75 = g de proteína / 100g de amostra.

g) Determinação de lipídeos/extrato etéreo

O extrato etéreo das amostras foi determinado segundo o método de Soxhlet (IAL, 2008), utilizando éter de petróleo como solvente orgânico.

Para esta análise foi pesado, em balança analítica da marca Bosh, modelo S2000, os cartuchos e, posteriormente, cerca de 2g das amostras dessecadas dentro destes, sendo logo após, protegidos com algodão hidrofóbico (para a manipulação do algodão utilizou-se pinça para evitar contato com a gordura das mãos). Os cartuchos foram colocados no suporte (haste) do determinador de lipídio da marca Quimis, modelo Q-308G22.

Logo após, foram pesados os copos já devidamente limpos, secos e desengordurados sem tocá-lo com as mãos. Os copos foram lavados, colocados na estufa a 105ºC por 1 hora e em seguida no dessecador para resfriar, por 30 minutos. Foi adicionado ao copo 70 mL do solvente orgânico (éter de petróleo) e transferido para a placa de aquecimento. O extrator foi

posicionado sobre o copo, tomando o devido cuidado para que as juntas de teflon estivessem bem posicionadas. A água e o equipamento foram ligados. A base dos cartuchos ficou imergida no solvente em ebulição por 5 minutos. Após retornar a posição, permaneceu por 40 minutos com a válvula do equipamento ligada. Após este tempo, a válvula foi fechada e esperou-se o copo esvaziar e ficar apenas manchado (15-20 minutos). Os copos foram levados à estufa por 5 a 10 minutos para secar a gordura e depois foram resfriados em dessecador para pesagem.

h) Determinação da fração glicídica

O método utilizado foi o cálculo por diferença, na qual foi considerada a matéria integral e o resultado foi expresso em g.100g-1 na base úmida, conforme o método da AOAC (2005). FG = 100 – (U + EE + PB + C) Onde: FG = fração glicídica (g.100g-1 ) U = umidade (g.100g-1 ) EE = extrato etéreo (g.100g-1 ) PB = proteína bruta (g.100g-1 ) C = cinzas (g.100g-1 )

i) Valor Energético Total (VET)

Foi efetuado com base na composição das amostras, utilizando os fatores de conversão de Atwater: 4 kcal.g-1 (proteínas), 4 kcal.g-1 (carboidratos) e 9 kcal.g-1 (lipídeo).

j) Análise da rotulagem nutricional

Os resultados da análise da rotulagem nutricional foram comparados com os parâmetros estabelecidos pelo Regulamento Técnico sobre Rotulagem Nutricional de Alimentos Embalados, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) - Resolução RDC Nº 360, de 23 de dezembro de 2003 (ANVISA, 2008).

4.1.2.2. Análise Microscópica

Foram realizadas análises de sujidade através de microscopia, utilizando técnica de flutuação para sujidade leve, segundo metodologia da Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2005), com observação direta em lupa estereoscópica (Bel photonics®) com aumento de 7 a 45 vezes. O preparo das amostras foi realizado com a seguinte composição: 100 gramas de amostra de ração humana, 1.200 ml de água destilada, 30 ml de solvente (varsol). Inicialmente toda a amostra foi homogeneizada e a seguir foram pesados 100 gramas da mesma em um béquer. A seguir foi transferido para um erlenmeyer e adicionado 1.200 ml de água destilada e 30 ml de solvente, sendo agitado com bastão de vidro, e deixado em contato durante 15 minutos. A agitação foi repetida por mais 2 vezes. Em seguida, foi decantado o sobrenadante sobre papel filtro em funil de Buchner e filtrado a vácuo seu conteúdo. Após, o papel filtro foi transferido para a placa de Petri e realizada a identificação dos elementos histológicos característicos do produto e pesquisa e identificação dos elementos estranhos. Estes foram registrados através de imagens obtidas por meio de máquina digital, marca Sony®, modelo DSC-W350, acoplada a lupa estereoscópica.

4.1.2.3. Análise Microbiológica

A análise microbiológica da Ração Humana foi realizada de acordo com o previsto pela Resolução - RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001 – Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológico para Alimentos: Coliformes a 45ºC/g, Bacillus cereus e Salmonella sp.

Além destas análises, também foi realizada a determinação de bolores e leveduras, com o objetivo de identificar possível deterioração do alimento por este tipo de microorganismo.

Para a determinação de coliformes termotolerantes (45ºC), a contagem foi realizada utilizando-se a técnica do Número Mais Provável (NMP) de três tubos, segundo recomendação da American Public Health Association (APHA) (KORNACKI, JOHNSON, 2001), inoculando-se as diluições da amostra em caldo Lauryl Sulfate Tryptose (LST) (Himedia). As culturas dos tubos com resultados presuntivo positivo (produção de gás) após 24 e 48h de incubação a 35ºC foram transferidas para o caldo Escherichia Coli (EC) (Himedia) e incubados a 45ºC para a confirmação da presença de coliformes termotolerantes.

A determinação presuntiva de Bacillus cereus foi realizada utilizando-se o método recomendado pela APHA (BENNETT, BELAY, 2001). As diluições decimais foram inoculadas na superfície do Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP) (Merck) e incubadas a 30ºC por 24h. Foi realizada contagens de placas com colônias típicas de Bacillus cereus, esféricas com a coloração rósea leitosa, com bordas perfeitas, planas, secas, rodeadas por um grande halo de precipitação devido à reação da lecitinase sobre a gema de ovo e realizada adicionalmente a coloração de gram, com a observação de bactérias gram positivas.

A determinação de Salmonella sp foi realizada segundo recomendação da APHA (ANDREWS et al., 2001). Cada unidade de 25g de amostra foi homogeneizada com 225ml de Caldo Lactosado (CL) (Himedia) durante 2 minutos, permanecendo à temperatura ambiente por 60 minutos com controle e ajuste do pH (6,8 ±0,2), quando necessário. Após incubação por 24h a 35ºC, 0,1 e 1,0 ml do caldo lactosado foi transferido para 10ml de caldo Rappaport- Vassiliardis (RV) (Himedia), incubado a 42ºC e 10 ml de Caldo Tetrationato (TT) (Himedia), incubado a 43ºC, respectivamente, ambos em banho-maria. Uma alçada destes caldos foram estriados em Ágar Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) (Himedia), Ágar Bismuto Sulfito (BS) (Himedia) e Ágar Hektoen Enteric (HE) (Himedia) e incubados a 35ºC por 24h. De duas a cinco colônias típicas foram isoladas de cada placa de ágar HE (colônias verde azuladas, com ou sem centro negro), de BS (colônias pretas, cinzas e marrons) e de XLD (colônias róseo escuro, com ou sem centro preto), sendo transferidas para o Ágar Tríplice Açúcar Ferro (Triple Suggar Iron - TSI) (Himedia) e Ágar Lisina Ferro (Lisine Iron Agar – LIA) (Himedia), os quais foram incubados a 35ºC/24h. Quando identificados os isolados com reações características de Salmonella no TSI ou LIA, estes foram submetidos ao teste de aglutinação com antisoro Salmonella polivalente somático.

A determinação de bolores e leveduras foi realizada conforme metodologia recomendada pela APHA (BEUCHAT, COUSIN, 2001), em que 0,1 ml das diluições seriadas foram semeadas na superfície do Ágar Batata Dextrose (BDA) (Himedia), e incubadas a 25ºC por 5 dias. Posteriormente, realizou-se a contagem das Unidades Formadoras de Colônias - UFC/g.

4.1.2.4. Análise Estatística

Os resultados são apresentados através da estatística descritiva como média aritmética e desvio padrão sendo utilizado o programa GraphPad InStat,versão 3.10 (2009).

4.2. ENSAIO BIOLÓGICO

4.2.1. Material

A segunda parte do estudo consistiu de um estudo experimental para avaliar o efeito do consumo do complemento alimentar “Ração Humana” sobre o peso corporal, perfil lipídico e glicemia de Rattus novergicus Wistar albinus machos.

O experimento foi realizado no Laboratório de Nutrição Experimental (LABNE) da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro, da Universidade Federal Fluminense (UFF), em Niterói.

4.2.2. Métodos

4.2.2.1. Delineamento da pesquisa

O desenvolvimento do ensaio biológico foi seguindo os critérios estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) / Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF - CEUA 81/2011 (Anexo 1).

O ensaio biológico foi desenvolvido com Rattus novergicus, variedade albinus, linhagem Wistar, machos, com 45 dias de vida, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental (LABNE) – UFF. Durante todo o experimento, os animais foram mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno, com 4 animais cada, em ambiente com temperatura constante (24ºC  2ºC) e iluminação adequada (ciclo claro e escuro de 12 em 12 horas).

Foram utilizados 42 animais, dos quais 5 foram sacrificados para conhecer o estado de saúde dos animais com os quais trabalhamos de modo a constatar que todos os parâmetros em estudo estavam dentro dos padrões de normalidade estabelecidos pela literatura. Isto é, os animais apresentavam-se saudáveis no início do estudo.

Os demais animais (37) foram alimentados com dieta hiperlipídica por um período de 20 dias, com o objetivo de induzir a obesidade para que, posteriormente, fossem tratados com a Ração Humana (Figura 1).

Após a indução da obesidade os animais, agora com 65 dias de vida, foram divididos em 4 grupos (n=8/grupo) e acompanhados por 60 dias:

1) Grupo Controle (C), recebendo ração balanceada (segundo a AIN93M) à base de