Análises estatísticas

O teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) foi realizado com o auxílio do software FBAT (Family Based Association Test). Este teste tem o objetivo de

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verificar a associação genótipo-fenótipo a partir da transmissão diferencial dos alelos dos pais ao afetado. E para a análise dos haplótipos dos polimorfismos rs28372960, rs15251 e rs2569062 do gene TCOF1 foi realizada a função HBAT do software FBAT, onde determina a transmissão diferencial dos haplótipos. Ambas as análises tem o critério de utilizar no mínimo um dos pais normais heterozigotos e, pelo menos, um filho afetado.

A existência de equilíbrio de Hardy-Weinberg foi avaliada como descrito por Rodrigues et al. (2009). Para avaliação da ancestralidade genômica, cada indivíduo do grupo caso-controle foi genotipado com 40 polimorfismos curtos bialélicos de inserção/deleção (Indels), segundo os métodos de Bastos-Rodrigues et al., (2006). Para determinar o ancestralidade genômica de cada indivíduo, o software Structure 2.3.4 foi utilizado num modelo assumindo três populações parentais com base na origem tri-híbrida da população brasileira. Após a avaliação da ascendência, o programa STRAT foi usado para analisar a associação dos marcadores polimórficos rs1374326 (HOXD1), rs28372960 (TCOF1), rs7829058 (FGFR1) e rs11653738 (WNT3) condicionado nas proporções de ascendência individuais. O odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% associados (IC 95%) também foram calculados.

Em todas as comparações, p≤0,05 foi indicativo de diferença estatisticamente significante.

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5 RESULTADOS

A análise dos polimorfismos genéticos nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 foi inicialmente realizada em 189 trios com FL±PNS e 107 trios com FPNS (Tabela 3). Neste grupo, a prevalência do gênero masculino foi observada nos pacientes com FL±PNS (n=114, 60,3%, Tabela 3) e do gênero feminino nos pacientes com FPNS (n=57, 53,3%, Tabela 3).

Tabela 3. Distribuição dos pacientes com FL±PNS e FPNS analisados no TDT em relação ao gênero. FL±PNS n (%) FPNS n (%) Masculino 114 (60,3) 50 (46,7) Feminino 75 (39,7) 57 (53,3) Total 189 107

O equilíbrio de Hardy-Weinberg entre os genitores (indivíduos normais) não foi observado para o polimorfismo rs15251 no núcleo familiar com FL±PNS, assim como nos polimorfismos rs28372960 e rs242082 com FPNS (Tabela 4). Como por princípio o TDT corrige para possíveis erros na estratificação étnica da população estudada, visto que sua análise ocorre em núcleos familiares, manteve-se nesta análise os polimorfismos que não respeitaram os preceitos do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Contudo, é de conhecimento que nestas circunstâncias o poder de detecção do teste reduz (Sebro e Rogus, 2010).

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Tabela 4. Cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg para os 10 polimorfismos deste estudo baseado nos genitores (pais e mães normais) dos 189 núcleos familiares com FL±PNS e 107 com FPNS. Polimorfismo FL±PNS Valor de p FPNS Valor de p rs1374326 0,14 0,39 rs748044 0,19 0,78 rs1106514 0,80 0,37 rs28372960 0,92 0,02 rs15251 0,04 0,52 rs2569062 0,64 0,64 rs7829058 0,05 0,60 rs1793949 0,67 0,17 rs11653738 0,96 0,09 rs242082 0,06 0,03

Tabelas 5 e 6 demonstram os resultados do TDT nos 10 polimorfismos genéticos deste estudo em relação ao tipo de fissura. Com exceção do polimorfismo rs28372960, a frequência do alelo menor (MAF) foi superior a 14% no estudo em trios com FL±PNS (Tabela 5) e superior a 12% no estudo em trios com FPNS (Tabela 6). No estudo utilizando trios com FL±PNS observou-se que o alelo T do polimorfismo rs28372960 e o alelo C do polimorfismo rs7829058 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS (ambos p=0,04, Tabela 5), sendo que a transmissão ocorreu em 20 núcleos familiares no polimorfismo rs28372960 e em 42 famílias no polimorfismo rs7829058 (Tabela 5). No estudo utilizando trios com FPNS observou-se que o alelo T do polimorfismo rs1374326 e o alelo C do polimorfismo rs11653738 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FPNS (ambos p=0,04, Tabela 6), sendo que a transmissão ocorreu em 43 famílias no polimorfismo rs1374326 e em 34 núcleos familiares no polimorfismo rs11653738 (Tabela 6).

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Tabela 5. Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os polimorfismos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062, rs7829058, rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 189 trios de FL±PNS. rs1374326 rs748044 rs1106514 rs28372960 rs15251 rs2569062 rs7829058 rs1793949 rs11653738 rs242082 MAF 0,335 0,275 0,447 0,054 0,263 0,461 0,146 0,388 0,271 0,353 Genótipo CC/CT/TT CC/CT/TT GG/GC/CC CC/CT/TT CC/CT/TT CC/CG/GG GG/GC/CC CC/CT/TT TT/TC/CC GG/GA/AA Afetado (%) 43,1/45,7/11,2 50,8/44,4/4,8 38,0/38,5/23,5 87,7/11,8/0,5 52,4/41,2/6,4 33,0/43,1/23,9 75,0/23,4/1,6 37,2/45,8/17,0 56,9/34,6/8,5 44,1/41,5/14,4 Pai (%) 46,8/38,3/14,9 50,8/40,7/8,5 26,2/55,1/18,7 88,8/11,2/0,0 53,2/41,5/5,3 26,6/53,2/20,2 70,2/28,2/1,6 35,1/46,8/18,1 52,6/39,4/8,0 39,4/48,9/11,7 Mãe (%) 45,5/43,8/10,7 50,8/44,9/4,3 32,1/45,5/22,4 92,0/7,5/0,5 52,1/43,6/4,3 32,1/43,8/24,1 70,6/28,9/0,5 40,1/49,7/10,2 51,9/40,6/7,5 39,6/51,3/9,1 T/NT 77/44 77/39 90/43 20/10 72/52 83/46 42/41 111/23 64/47 79/56 Valor de p 0,74 1,00 0,13 0,04 0,87 0,25 0,04 0,59 0,08 0,41

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Tabela 6. Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os polimorfismos genéticos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062, rs7829058, rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 107 trios de FPNS. rs1374326 rs748044 rs1106514 rs28372960 rs15251 rs2569062 rs7829058 rs1793949 rs11653738 rs242082 MAF 0,308 0,254 0,469 0,045 0,250 0,445 0,123 0,385 0,232 0,349 Genótipo CC/CT/TT CC/CT/TT GG/GC/CC CC/CT/TT CC/CT/TT CC/CG/GG GG/GC/CC CC/CT/TT TT/TC/CC GG/GA/AA Afetado (%) 44,4/44,3/11,3 56,6/39,6/3,8 33,0/39,6/27,4 91,5/8,5/0,0 56,6/38,7/4,7 32,1/46,2/21,7 78,3/18,9/2,8 37,8/48,1/14,1 62,3/33,0/4,7 44,3/42,5/13,2 Pai (%) 49,0/40,6/10,4 52,8/40,6/6,6 29,2/51,9/18,9 90,6/8,5/0,9 57,6/39,6/2,8 34,9/45,3/19,8 72,6/25,5/1,9 38,7/50,9/10,4 61,3/34,0/4,7 37,7/55,7/6,6 Mãe (%) 52,8/37,7/9,5 54,7/38,7/6,6 24,5/53,8/21,7 92,5/6,6/0,9 51,9/39,6/8,5 25,5/56,6/17,9 82,1/16,0/1,9 32,1/52,8/15,1 49,1/48,1/2,8 39,6/49,1/11,3 T/NT 43/18 35/28 57/25 6/9 36/26 56/23 19/22 55/25 34/30 52/31 Valor de p 0,04 0,15 0,77 0,61 0,38 0,69 0,76 0,84 0,04 0,77

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Os haplótipos dos 3 polimorfismos no gene TCOF1 (rs28372960, rs15251 e rs2569062) foram determinados. O haplótipo formado pelos alelos T-C-C demonstrou associação significante com FL±PNS (p=0,01, Tabela 7). Nenhuma associação significante foi observada para os demais haplótipos nos pacientes com FL±PNS e nos pacientes com FPNS (Tabela 7).

Tabela 7. Distribuição dos haplótipos no gene TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062) por tipo de fissura analisados no TDT.

FL±PNS Frequência/ valor de p FPNS Frequência/ valor de p TCOF1 (rs28372960-rs15251-rs2569062) C-C-G 0,451/0,73 0,429/0,70 C-C-C 0,249/0,64 0,272/0,43 C-T-C 0,238/0,77 0,245/0,27 T-C-C 0,037/0,01 0,045/0,46 C-T-G 0,015/0,15 0,008/0,54

Baseado nestes resultados que revelaram uma possível participação dos polimorfismos rs28372960 (TCOF1) e rs7829058 (FGFR1) como fatores de risco de FL±PNS e dos polimorfismos rs1374326 (HOXD1) e rs11653738 (WNT3) como fatores de risco de FPNS, decidiu-se confirmar estes resultados em uma amostra maior baseada na estratégia caso-controle com correção para diferenças de ancestralidade. A distribuição ancestral dos grupos controle, FL±PNS e FPNS foram estimados, tendo predominância europeia, seguida de africana e ameríndia em todos os grupos (Tabela 8). A prevalência do gênero masculino foi observada nos pacientes com FL±PNS (n=177, 55,7%, Tabela 9) e do gênero feminino nos pacientes com FPNS (n=121, 64,0%, Tabela 9) e no grupo controle (n=370, 61,8%, Tabela 9). Contudo, estas diferenças não foram estatisticamente significantes. De modo similar, a análise desses polimorfismos com as FLNS, FLPNS e FPNS separadas foram realizadas no estudo caso- controle e também não apresentaram associação.

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O equilíbrio de Hardy-Weinberg no grupo controle foi observado para os 4 polimorfismos (rs1374326, rs28372960, rs7829058, e rs11653738) (Tabelas 10 e 11). Não houve diferenças nas distribuições de alelos e genótipos entre os pacientes com FL±PNS e FPNS e os controles analisados (Tabelas 10 e 11).

Tabela 8. Distribuição ancestral dos pacientes do grupo caso (FL±PNS e FPNS) e controle. Europeu (%) Africano (%) Ameríndio (%) Controle 85,6 12,4 1,9 FL±PNS 83,3 15,1 1,6 FPNS 78,9 18,7 2,4

Tabela 9. Distribuição dos pacientes analisados no grupo caso-controle em relação ao gênero. FL±PNS n (%) FPNS n (%) Controle n (%) Masculino 177 (55,7) 68 (36,0) 229 (38,2) Feminino 141 (44,3) 121 (64,0) 370 (61,8) Total 318 189 599

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Tabela 10. Frequência dos polimorfismos rs28372960 do gene TCOF1 e rs7829058 do gene FGFR1 em pacientes com FL±PNS e nos indivíduos do grupo controle.

HWE (valor de p) Grupo Controle (%) Grupo FL/PNS (%) OR alelo (95% IC) Valor de p OR Het (95% IC) Valor de p OR Hom (95% IC) Valor de p OR Dom (95% IC) Valor de p OR Rec (95% IC) Valor de p rs28372960 (TCOF1) Alelo (C/T) Genótipo (CC/CT/TT) 0,36 93,4/6,6 87,4/11,9/0,7 94,0/6,0 88,7/10,7/0,6 0,89 (0,60-1,33) 0,62 0,88 (0,57-1,36) 0,57 0,92 (0,17-5,07) 1,00 0,88 (0,58-1,35) 0,59 0,94 (0,17-5,14) 1,00 rs7829058 (FGFR1) Alelo (G/C) Genótipo (GG/GC/CC) 0,07 84,9/15,1 71,2/27,5/1,3 86,9/13,1 75,8/22,3/1,9 0,84 (0,63-1,2) 0,26 0,76 (0,55-1,05) 0,09 1,32 (0,45-3,86) 0,59 0,79 (0,57-1,08) 0,14 1,42 (0,48-4,11) 0,57

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Tabela 11. Distribuição dos polimorfismos rs1374326 do gene HOXD1 e rs11653738 do gene WNT3 nos grupos controle e FPNS.

HWE

(valor de p)

Grupo Controle

Grupo FPNS OR alelo (95% IC)

Valor de p OR Het (95% IC) Valor de p OR Hom (95% IC) Valor de p OR Dom (95% IC) Valor de p OR Rec (95% IC) Valor de p rs1374326 (HOXD1) Alelo (C/T) Genótipo (CC/CT/TT) 0,64 66,4/33,6 44,5/43,8/11,7 63,3/36,7 37,6/51,4/11 1,15 (0,89-1,46) 0,28 1,39 (0,97-1,98) 0,07 1,11 (0,63-1,96) 0,71 1,33 (0,94-1,87) 0,10 0,93 (0,55-1,58) 0,79 rs11653738 (WNT3) Alelo (T/C) Genótipo (TT/TC/CC) 0,49 72,4/27,6 52,9/38,9/8,2 71,4/28,6 52,2/38,5/9,3 1,05 (0,81-1,36) 0,73 1,00 (0,71-1,43) 0,98 1,15 (0,63-2,09) 0,64 1,03 (0,74-1,44) 0,86 1,15 (0,64 -2,05) 0,63

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6 DISCUSSÃO

A frequência elevada em associação à significante morbidade motivou nos últimos anos vários estudos genéticos na busca de um melhor conhecimento dos fatores de risco para o desenvolvimento das FL/PNS (Dixon et al., 2011; Stuppia et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Rahimov et al., 2012). Atualmente muitos genes e regiões cromossômicas são associados às FL/PNS, mas ainda estamos distantes de uma completa compreensão da etiologia das FL/PNS. A distribuição dos polimorfismos e haplótipos, assim como suas correlações com as FL/PNS, variam amplamente entre as diferentes populações, fazendo com que estudos de validação de suscetibilidade e associação de polimorfismos genéticos sejam essenciais para aumentar a compreensão da complexidade desta anomalia de origem multifatorial (Paranaiba et al., 2013a; Aquino et al., 2014b).

Em relação ao tipo de fissura, a prevalência de FL±PNS foi confirmada neste estudo em concordância com estudos internacionais (Clark et al., 2003; Forrester e Merz, 2004; Vallino-Napoli et al., 2006; Nopoulos et al., 2007; Butali et al., 2014) e nacionais (Freitas et al., 2004; Martelli et al., 2010; Martelli et al., 2012). No entanto, em alguns países como na Finlândia (Lithovius et al., 2014), Polônia (Antoszewski e Fijalkowska, 2013) e Israel (Silberstein et al., 2012), a prevalência de FPNS foi observada. Em relação a extensão da fissura e o gênero, a literatura mundial aponta para uma prevalência no gênero masculino de FL±PNS e de FPNS no gênero feminino (Mossey et al., 2009; Martelli et al., 2012). Nossos resultados confirmaram tal observação. No Brasil, estudos prévios também descreveram uma maior frequência de FL±PNS nos indivíduos do gênero masculino, assim como a prevalência de FPNS em mulheres (Freitas et al., 2004; Martelli-Junior et al., 2007; Mossey et al., 2009; Martelli et al., 2012). Segundo Lary et al. (2001) a explicação para isso reside no fato de que o palato do feto feminino demora em média 1 semana a mais para fusionar do que o palato do feto masculino, aumentando a predisposição à ação de fatores nocivos na formação da FP. A suscetibilidade do gênero masculino para a FL±PNS parece ser, ao menos em parte, uma consequência de variações no gene MSX1 que são mais comuns em homens com FL±PNS (Blanco et al., 2001). Embora não seja confirmado, também sugere a hipótese de que genes localizados no

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cromossomo X tenham um papel importante na etiologia das fissuras (Jugessur et al., 2012; Patel et al., 2013).

A morfogênese da região craniofacial requer uma coordenação precisa dos eventos celulares, incluindo proliferação, migração, transição epitélio- mesênquima e apoptose (Mossey et al., 2009). A diversidade dos mecanismos nos principais eventos para a formação das estruturas faciais reflete no grande número de genes conhecidos ou suspeitos de estarem envolvidos na formação do lábio e palato (Maestri et al., 1997; Gaspar et al., 2002; Orioli et al., 2002; Letra et al., 2007; Jagomagi et al., 2010; Letra et al., 2010b; Butali et al., 2011; Fontoura et al., 2012; Letra et al., 2012; Mostowska et al., 2012; Saleem et al., 2012; Wu D et al., 2012; Butali et al., 2014; Letra et al., 2014). Em função da importância genética na embriogênese, os polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento craniofacial, incluindo os genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3, são fortes candidatos para o desenvolvimento de FL/PNS (Fallin et al., 2003; Juriloff et al., 2004; Beaty et al., 2006; Chiquet et al., 2008; Sull et al., 2008; Jagomagi et al., 2010; Menezes et al., 2010; Nikopensius et al., 2010; Butali et al., 2011; Lace et al., 2011; Nikopensius et al., 2011; Yao et al., 2011; Letra et al., 2012; Mostowska et al., 2012; Smane et al., 2013; Souza et al., 2013; Letra et al., 2014). Desta forma, o objetivo deste estudo foi compreender a participação dos polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento craniofacial na etiopatogenia das FL/PNS. Com a finalidade de evitar possível estratificação populacional na amostra, este estudo foi realizado com amostras de quatro regiões diferentes do país e a variabilidade da ancestralidade de cada indivíduo foi levada em consideração no estudo caso-controle, visto que no estudo com trios (TDT) ocorre intrinsicamente o controle da estratificação populacional (Sebro e Rogus, 2010). A prevalência europeia seguida da africana e ameríndia foi obtida tanto no grupo caso quanto no grupo controle, confirmando outros estudos com a população Brasileira (Pena et al., 2011; Filezio et al., 2013; Aquino et al., 2014b). O presente estudo avaliou o polimorfismo rs1374326 do gene HOXD1. Como salientado anteriormente, esse gene é muito importante na formação craniofacial por meio do controle de sua expressão no primeiro arco faríngeo (Couly et al., 2002; Vieux-Rochas et al., 2013). Embora não existam estudos demonstrando a funcionalidade desse polimorfismo, a presença do nucleotídeo

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variante é preditiva de uma alteração proteica funcional. Baseado nesse contexto, Beaty et al. (2006) propuseram investigar uma possível associação de HOXD1 em 232 casos de FL/PNS provenientes de Maryland, Singapura e Taiwan. Para isso, avaliaram 47 polimorfismos escolhidos por se encontrarem em exons e/ou por uma possível alteração na função proteica. Apenas o polimorfismo rs1374326 mostrou associação significante com FPNS, revelando assim a participação do gene HOXD1 na etiologia das fissuras orais, porém nenhum outro estudo foi realizado com este polimorfismo. Na população brasileira avaliada neste estudo, observou-se que o alelo T do polimorfismo rs1374326 foi preferencialmente transmitido dos pais aos filhos afetados com FPNS, mas a associação deste polimorfismo não foi confirmada na abordagem caso-controle que continha uma amostra mais robusta. Os motivos desta divergência entre os resultados podem ser atribuídos às variações na etnicidade das populações investigadas e ao tamanho amostral.

O gene TCOF1 foi também avaliado neste estudo frente a sua importância no desenvolvimento craniofacial. No TDT, entre os 3 polimorfismos no gene TCOF1, apenas o polimorfismo rs28372960 foi transmitido de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS, entretanto não foi confirmado esta associação utilizando a amostra caso-controle. Em relação ao haplótipo T-C-C formado pelos três polimorfismos (rs28372960, rs15251 e rs2569062) no gene TCOF1, observamos uma significante associação com FL±PNS. O estudo de Masotti et al. (2005) revelou que o polimorfismo rs28372960 no gene TCOF1 altera o sítio de ligação do fator de transcrição YY1, diminuindo assim a atividade promotora do gene em 38%. Desta forma, este polimorfismo apresenta grande potencial como fator de risco para o desenvolvimento de FL/PNS, no entanto nenhum outro estudo havia sido realizado com este polimorfismo previamente. Outro estudo realizado com polimorfismos no gene TCOF1 relatou um risco aumentado dos polimorfismos rs15251 e rs2569062 (OR=2,88 e OR= 2,43, respectivamente) para o desenvolvimento de FPNS na população de Maryland, Singapura e Taiwan (Sull et al., 2008). Todavia, indícios definitivos do envolvimento do gene TCOF1 no desenvolvimento das fissuras em humanos permanecem inconclusivos, uma vez que, apesar dos relatos positivos, há falta de estudos do gene TCOF1 em diferentes populações de FL/PNS.

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Outro gene avaliado neste estudo foi o FGFR1, que emergiu como um forte candidato para FL/PNS a partir de estudos de associação realizados em populações de diferentes origens étnicas (Riley et al., 2007a; Menezes et al., 2008; Lace et al., 2011). Em um estudo de sequenciamento do gene FGFR1 diversas mutações foram identificadas e estima-se que cerca de 3% dos pacientes com FL±PNS apresentam mutações em FGFR1 (Riley et al., 2007a). No presente estudo foi avaliado o polimorfismo rs7829058, localizado na posição 38332095, onde resulta uma transição de um G para um C. Estudo prévio realizado por Lace et al. (2011) na população Letã revelou que o polimorfismo rs7829058 mostrou a significante associação com FL±PNS. De maneira similar, Nikopensius et al. (2010) avaliaram 14 polimorfismos no gene FGFR1 em 104 casos de FPNS nas populações Estoniana, Letoniana e Lituana e demonstraram que o polimorfismo rs7829058 aumenta significantemente o risco de ocorrência das FPs (OR=1,79; IC=1,19–2,72). No presente estudo, a transmissão do alelo polimórfico foi associada com a ocorrência de FL±PNS, contudo, ao validar em uma amostra ampla no estudo caso-controle, não confirmamos a associação. É importante destacar que a ausência de relação entre o polimorfismo rs7829058 em nosso estudo pode estar associada ao tamanho da amostra ou à diferença étnica encontrada na população brasileira.

O gene WNT3 foi também alvo de interesse neste estudo em virtude de sua função na indução da interação epitélio-mesênquima e, consequentemente, na diferenciação celular na embriogênese (Song et al., 2014). Além disto, alguns estudos indicam o gene WNT3 como um fator de risco para FL/PNS baseados em modelos animais (Carroll et al., 2005; Liu e Millar, 2010) e estudos de associação (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Lace et al., 2011; Yao et al., 2011; Mostowska et al., 2012). O polimorfismo rs11653738 foi apontado como um fator de risco para o desenvolvimento de FPNS na população da Letônia, Lituânia e Estônia (Nikopensius et al., 2010), porém nenhum outro estudo na literatura confirmou tal associação com outras populações. Neste estudo, embora o polimorfismo rs11653738 foi transmitido de maneira significante dos genitores aos pacientes com FPNS, a análise caso-controle não confirmou a associação.

Um dos grandes problemas em estudos genéticos de doenças complexas é avaliar a real significância dos resultados obtidos. Os resultados deste estudo

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foram avaliados estatisticamente pelo teste de desequilíbrio de transmissão utilizando-se o programa FBAT e o nível de significância foi estabelecido em 0,05. Uma desvantagem do TDT consiste na natureza restritiva da análise, uma vez que utiliza apenas uma parcela da amostra, considerada informativa. Sendo assim, é possível que algumas associações sejam falso-positivas. Desta forma, com o objetivo de validação de nossos resultados foi realizado um estudo caso- controle com uma amostra maior (318 FL±PNS, 189 FPNS e 599 controles), com correção ancestral de cada indivíduo. No estudo caso-controle com os polimorfismos que mostraram associação (rs1374326 do gene HOXD1, rs28372960 do gene TCOF1, rs7829058 do gene FGFR1, e rs11653738 do gene WNT3), nenhum apresentou diferenças nas distribuições de alelos e genótipos entre os pacientes analisados. A falta de associação entre os polimorfismos gênicos na ocorrência de FL/PNS observada neste estudo pode ser justificada pelo tamanho dos grupos e a intensa miscigenação étnica encontrada na população brasileira, mas é importante ressaltar que uma real interação entre estas variantes polimórficas analisadas e o risco para FL/PNS não está bem estabelecida e os resultados permanecem inconclusivos.

Os outros 6 polimorfismos avaliados não foram confirmados na população brasileira estudada. Estes resultados não são inesperados, visto que estes polimorfismos (rs748044 no gene TNP1, rs1106514 no gene MSX1, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1, rs1793949 no gene COL2A1 e rs242082 no gene TIMP3) nunca foram estudados na população brasileira, além de que os resultados obtidos nas investigações de polimorfismos genéticos são escassos e apresentam resultados bastante controversos. O tamanho amostral é também outro fator a ser ponderado na interpretação destes resultados negativos.

Em resumo, analisando conjuntamente os modestos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que os polimorfismos estudados nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 não são fatores de risco para a ocorrência de FL/PNS na população brasileira. Porém, a identificação de novas regiões polimórficas em genes candidatos às FL/PNS é de fundamental importância para o entendimento dessa anomalia. A complexidade e a diversidade dos aspectos clínicos e mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento craniofacial proporcionam inúmeras oportunidades para investigações futuras da etiologia da FL/PNS. Desta forma,

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nossos resultados devem incentivar outros estudos, principalmente com amostras maiores, para aumentar a nossa compreensão e conhecimento dos eventos genéticos que contribuem para esta complexa alteração de desenvolvimento.

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7 CONCLUSÃO

1. O alelo T do polimorfismo rs28372960 no gene TCOF1 e o alelo C do polimorfismo rs7829058 no gene FGFR1 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS, assim como o alelo T do polimorfismo rs1374326 no gene HOXD1 e alelo C do polimorfismo rs11653738 no gene WNT3 para os pacientes com FPNS.

2. Embora a significância no TDT com os polimorfismos rs1374326 (HOXD1), rs28372960 (TCOF1), rs7829058 (FGFR1), e rs11653738 (WNT3) tenha sido observada, não houve diferença nas distribuições de alelos e genótipos no estudo caso-controle.

3. O haplótipo T-C-C formado pelos polimorfismos rs28372960, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1 demonstrou associação significante com FL±PNS.

4. Os polimorfismos rs748044 no gene TNP1, rs1106514 no gene MSX1, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1, rs1793949 no gene COL2A1 e rs242082 no gene TIMP3 não demonstraram nenhuma associação significante com FL/PNS na população brasileira.

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