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RENATO ASSIS MACHADO
“ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS NOS GENES HOXD1, TNP1, MSX1,
TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 E TIMP3 COM FISSURAS DE LÁBIO E/OU
PALATO NÃO-SINDRÔMICA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA”
PIRACICABA 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
RENATO ASSIS MACHADO
“ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS NOS GENES HOXD1, TNP1, MSX1,
TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 E TIMP3 COM FISSURAS DE LÁBIO E/OU
PALATO NÃO-SINDRÔMICA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA”
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do título de Mestre em Estomatopatologia, na Área de Patologia.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Della Coletta Coorientador: Prof. Dr. Hercilio Martelli Junior
____________________________________ Assinatura do orientador
PIRACICABA 2015 Este exemplar corresponde a versão final da dissertação defendida por Renato Assis Machado e orientada pelo Prof. Dr. Ricardo Della Coletta.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Machado, Renato Assis,
M18a MacAssociação dos polimorfismos nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 com fissuras de lábio e/ou palato
não-sindrômica em uma população brasileira / Renato Assis Machado. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2015.
MacOrientador: Ricardo Della Coletta. MacCoorientador: Hercilio Martelli Junior.
MacDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Mac1. Fenda labial. 2. Polimorfismo genético. I. Della Coletta, Ricardo,1972-. II. Martelli Junior, Hercilio. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Association of polymorphisms in genes HOXD1, TNP1, MSX1,
TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 and TIMP3 with nonsyndromic cleft lip and/or palate in a Brazilian population
Palavras-chave em inglês:
Cleft lip
Polymorphism, genetic
Área de concentração: Patologia
Titulação: Mestre em Estomatopatologia Banca examinadora:
Ricardo Della Coletta [Orientador] Mário Sérgio Oliveira Swerts Edgard Graner
Data de defesa: 26-02-2015
Programa de Pós-Graduação: Estomatopatologia
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RESUMO
O desenvolvimento craniofacial envolve uma série de eventos altamente coordenados e variações polimórficas nos genes que controlam estes eventos podem afetar a morfogênese labial e palatina, resultando nas fissuras do lábio e/ou palato não-sindrômicas (FL/PNS). O objetivo do presente estudo foi verificar a associação dos polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento craniofacial, HOXD1 (rs1374326), TNP1 (rs748044), MSX1 (rs1106514), TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062), FGFR1 (rs7829058), COL2A1 (rs1793949), WNT3 (rs11653738) e TIMP3 (rs242082), na susceptibilidade das FL/PNS em uma população brasileira. Para verificar a associação destes polimorfismos, este estudo associou o teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) com a análise caso-controle com correção de variações genéticas de ancestralidade em uma amostra composta de 189 trios com fissura labial com ou sem fissura palatina não-sindrômica (FL±PNS), 107 trios com fissura palatina não-sindrômica (FPNS), 318 amostras isoladas de pacientes com FL±PNS, 189 amostras isoladas de pacientes com FPNS e 599 controles. Todos os polimorfismos foram inicialmente analisados por TDT e as associações significantes foram confirmadas na análise caso-controle. Os polimorfismos rs28372960 e rs7829058 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS (p=0,04), assim como os polimorfismos rs1374326 e rs11653738 nos trios com FPNS (p=0,04). Contudo, o estudo caso-controle não confirmou tais associações. O haplótipo T-C-C formado pelos polimorfismos rs28372960, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1 foi significantemente mais comum nos pacientes com FL±PNS em comparação com o grupo controle (p=0,01). Frente as modestas associações, nossos resultados não suportam a hipótese de que variantes estudadas nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 são fatores de risco para FL/PNS em uma população brasileira.
Palavras chaves: fissura de lábio e/ou palato não-sindrômica, genes do
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ABSTRACT
The craniofacial development involves a series of highly coordinated events, and polymorphic variations in genes that control these events can affect the morphogenesis of the lip and palate, resulting in the non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P). The aim of present study was to verify the association of polymorphisms in genes related to craniofacial development, HOXD1 (rs1374326), TNP1 (rs748044), MSX1 (rs1106514), TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062), FGFR1 (rs7829058), COL2A1 (rs1793949), WNT3 (rs11653738) and TIMP3 (rs242082), in the susceptibility of NSCL/P in a Brazilian population. To verify the association of those polymorphisms, the study associated the transmission disequilibrium test (TDT) and a structured case-control analysis based on the individual ancestry proportions in a sample composed of 189 case-parent trios of non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL±P), 107 case-parent trios of non-syndromic cleft palate (NSCP), 318 isolated samples of NSCL±P, 189 isolated samples of NSCP and 599 healthy controls. All polymorphisms were initially evaluated by TDT, and significant associations were valitaded in a case-control analysis. A significant overtransmission of rs28372960 and rs7829058 polymorphisms in NSCL±P trios was observed (p=0.04), as well as the rs1374326 and rs11653738 polymorphisms in NSCP trios (p=0.04). However, the structured case-control analysis did not confirm those associations. The haplotype T-C-C formed by rs28372960, rs15251 and rs2569062 polymorphisms in TCOF1 gene was significantly more frequent in patients with NSCL±P in comparison with the control group (p=0.01). With the modest associations, our results do not support the hypothesis that HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 and TIMP3 variants are risk factors for NSCL/P in a Brazilian population.
Keywords: nonsyndromic cleft lip and/or palate, craniofacial development genes,
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SUMÁRIO
DEDICATÓRIA xiii
AGRADECIMENTOS xv
LISTA DE FIGURAS xix
LISTA DE TABELAS xxi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS xxiii
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 5
2.1 Fissuras do lábio e/ou palato não-sindrômicas (FL/PNS) 5
2.2 Embriologia do lábio e palato e a associação com FL/PNS 6
2.3 Epidemiologia das FL/PNS 11 2.4 Etiologia das FL/PNS 12 2.4.1 Fatores ambientais 12 2.4.2 Fatores genéticos 17 2.4.2.1 HOXD1 19 2.4.2.2 TNP1 20 2.4.2.3 MSX1 21 2.4.2.4 TCOF1 23 2.4.2.5 FGFR1 24 2.4.2.6 COL2A1 25
xii 2.4.2.7 WNT3 26 2.4.2.8 TIMP3 27 2.5 Delineamento experimental 28 3 PROPOSIÇÃO 31 4 MATERIAL E MÉTODOS 32
4.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa 32
4.2 Desenho do estudo 32
4.3 Amostra 32
4.4 Coleta das amostras de células bucais 33
4.5 Isolamento do DNA 33
4.6 Seleção dos polimorfismos genéticos 34
4.7 Genotipagem pelo método de discriminação alélica com
sondas fluorescentes 34 4.8 Análises estatísticas 35 5 RESULTADOS 37 6 DISCUSSÃO 45 7 CONCLUSÃO 51 REFERÊNCIAS 52 ANEXO 76
xiii
DEDICATÓRIA
Aos pacientes com FL/PNS e suas famílias, razão de nosso estudo, que gentilmente colaboraram, confiaram e se prontificaram em participar desta pesquisa. Pacientes que nos ensinaram o valor do nosso trabalho e depositaram em nós suas esperanças em busca de uma melhor qualidade de vida. Que este estudo, em sua pequena contribuição e buscando reduzir o universo de desconhecimento sobre o assunto, possa ajudar-nos a oferecer-lhes uma melhor qualidade em suas jornadas diárias.
xv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me dar força para superar as dificuldades e mostrar os caminhos certos nas horas difíceis.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa de seu diretor, Professor Doutor Guilherme Elias Pessanha Henriques.
Ao Professor Doutor Alan Roger dos Santos Silva, coordenador do Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas.
Ao meu orientador Professor Doutor Ricardo Della Coletta, pela transmissão de ensinamentos diários, mostrou sempre importante na minha formação pessoal e profissional, pelo exemplo de seriedade, paciência, persistência e bondade em tudo que se envolve. Registro aqui minha profunda admiração pela sua capacidade de construir novos caminhos e por me ensinar principalmente pelo exemplo.
Ao meu coorientador Professor Doutor Hercílio Martelli Júnior, pelo incentivo aos trabalhos científicos desde a graduação e por compartilhar seus conhecimentos com tranquilidade e sabedoria.
Aos Professores Doutores do Departamento de Diagnóstico Oral, áreas de Patologia e Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Ricardo Della Coletta, Alan Roger dos Santos Silva, Jacks Jorge Júnior, Pablo Vargas, Márcio Ajudarte Lopes, Edgard Graner e Oslei Paes de Almeida. Obrigado pelos ensinamentos repassados durante a realização dos créditos.
xvi
À coordenadora do comitê de ética da FOP Lívia Maria Andaló Tenuta pelo auxílio prestado durante o processo de submissão do trabalho, pela sua disposição, solidariedade e auxílio mostrando em tudo dedicação e responsabilidade.
Aos funcionários da FOP-UNICAMP Geovania Almeida, Emílio Salles, João Carlos Gomes, Adriano Luis Martins e Fabiana Facco Cassarotti pela amabilidade e paciência, e ao Fábio Haach Téo pelo apoio, amizade e valiosa ajuda no laboratório de biologia molecular.
À amiga Sibele Nascimento de Aquino, pelo acolhimento e treinamento no laboratório no início do mestrado e por esclarecer as minhas frequentes dúvidas.
Aos centros de colaboração e parceria neste estudo: Centro Pró-Sorriso da Universidade José do Rosário Vellano – Unifenas, Alfenas, Minas Gerais, na pessoa do Prof. Dr. Mário Sérgio Oliveira Swerts; Centrinho do Hospital Santo Antônio das Obras Assistenciais Irmã Dulce, Salvador, Bahia, na pessoa da Profª. Drª. Sílvia Reis; Associação Portadores de Fissura Labial localizada na cidade de Cascavel, Paraná (APOFILAB), na pessoa da Profª. Drª. Ana Lúcia Carrinho Ayroza Rangel; e o Hospital Universitário Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba-UFPB, João Pessoa, Paraíba, na pessoa da Profª. Drª. Darlene Camati Persuhn, que foram de fundamental importância para a concretização deste trabalho.
À todos os amigos e colegas do programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia: Camila Concha, Carolina Carneiro, Celeste Romero, Débora Lima, Diego Tetzner, Leonardo Reis, Mariana Paglioni, Marisol Galvis, Raiza Vieira, Alicia Rumayor, Ana Camila Messetti, Ana Carolina Pellicioli, César Rivera, Elizabete Bagordakis, Felipe Paiva, Harim Tavares, José Laurentino Filho, Juscelino de Freitas, Marco Aurélio Andrade, Marcondes Sena, Maurício Dourado, Priscilla Diniz, Rodrigo Neves, Thaís Brandão, especialmente aos colegas do Laboratório de Biologia Celular e Molecular Estêvão Azevedo, Fernanda Moreira, Florence Cuadra e Luciana Yamamoto pela amizade, conselhos e ensinamentos transmitidos.
xvii
Aos amigos do Orocentro Camila Borges, Karina Morais, Renata Markman, Vinícius Rabelo, Wagner Gomes, Aparecida Campion, Daniele Morelli e Rogério Elias, pelos ensinamentos compartilhados.
Aos meus pais Carlos Roberto Machado e Lucimar Aparecida de Assis Machado por me apoiarem sempre em todas as minhas escolhas. Obrigado pelo amor, dedicação e exemplo de vida que sempre foram pra mim. Não tenho palavras para agradecer! Ao meu querido irmão Roberto Assis Machado pelo companheirismo de sempre e exemplo de pessoa a seguir. Obrigado a toda família, cada um de vocês é especial pra mim.
À todos que colaboraram direta ou indiretamente durante a realização deste trabalho.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Desenvolvimento do lábio e palato 7
xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Origem das amostras deste estudo 33
Tabela 2 - Características dos polimorfismos genéticos nos genes
incluídos neste estudo 35
Tabela 3 - Distribuição dos pacientes com FL±PNS e FPNS
analisados no TDT em relação ao gênero 37
Tabela 4 - Cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg para os 10 polimorfismos deste estudo baseado nos genitores (pais e mães normais) dos 189 núcleos familiares com
FL±PNS e 107 com FPNS 38
Tabela 5 - Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os polimorfismos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062, rs7829058, rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 189 trios de
FL±PNS 39
Tabela 6 - Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os polimorfismos genéticos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062, rs7829058, rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 107
trios de FPNS 40
Tabela 7 - Distribuição dos haplótipos no gene TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062) por tipo de fissura
analisados no TDT 41
Tabela 8 - Distribuição dos pacientes analisados no grupo
caso-controle em relação ao gênero 42
Tabela 9 - Distribuição ancestral dos pacientes do grupo caso
xxii
Tabela 10 - Frequência dos polimorfismos rs28372960 do gene TCOF1 e rs7829058 do gene FGFR1 em pacientes com
FL±PNS e nos indivíduos do grupo controle 43
Tabela 11 - Distribuição dos polimorfismos rs1374326 do gene HOXD1 e rs11653738 do gene WNT3 nos grupos
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABCA4 - ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 4 APOFILAB - Associação dos Portadores de Fissura Labial
BCL - B-cell CLL/lymphoma
BMP - Bone morphogenetic proteins
BMPR1A - Bone morphogenetic protein receptor, type IA CAD6B - Cadherin6b
CK2 - Casein kinase 2
COL10A1 - Collagen, type X, alpha 1 COL2A1 - Collagen, type II, alpha 1
DNA - Deoxyribonucleic acid / Ácido desoxirribonucléico
EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid / Ácido etilenodiamino tetra-acético EPH - Ephrin
FADD - Fas-Associated protein with Death Domain FBAT - Family Based Association Test
FGF - Fibroblast growth factors FGF10 - Fibroblast growth factor 10
FGFR1 - Fibroblast growth factor receptor 1 FGFR2 - Fibroblast growth factor receptor 2 FGFR3 - Fibroblast growth factor receptor 3 FL - Fissura labial
FL/P - Fissura de lábio e/ou palato
FL/PNS - Fissura lábio e/ou palato não-sindrômica FL±P - Fissura labial com ou sem fissura palatina FLP - Fissura lábio-palatina
FOXE1 - Forkhead box E1 FP - Fissura palatina
xxiv GSTM1 - Glutathione S-transferase mu 1 GSTT1 - Glutathione S-transferase theta 1
GWAS - Genome-wide association study /Estudos de associação de larga escala genômica
HCl - Ácido clorídrico HOXD1 - Homeobox D1
HULW - Hospital Universitário Lauro Wanderley
HWE - Hardy-Weinbergequilibrium / Equilíbrio de Hardy-Weinberg IC - Intervalo de confiança
IHH - Indian hedgehog
IRF6 - Interferon regulatory factor 6
M - Molar
MAF - Minor allele frequency / Frequência do alelo menor
MAFB - V-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B mL - Mililitros
mM - Milimolar
MMPs - Matrix metalloproteinases / Metaloproteinases de matriz MSX1 - Muscle segment homeobox 1
MTHFR - Methylenetetrahydrofolate reductase NaCl - Cloreto de sódio
nm - nanômetro
Nop56p - NOP56 ribonucleoprotein NRP - Neuropilin
OAID - Obras Assistenciais Irmã Dulce OR - Odds ratio
PAX7 - Paired box 7
xxv PTCH - Patched
RARA - Retinoic acid receptor, alpha rDNA - DNA ribossômico
RNA - Ribonucleic acid / Ácido ribonucleico Robo - Roundabout
rpm - rotação por minuto rRNA - RNA ribossômico
RUNX2 - Runt-related transcription factor 2
SDS - Sodium dodecil sulfate / dodecil sulfato de sódio SHH - Sonic hedgehog
SHOX2 - Short stature homeobox 2
SMAD - Mothers against decapentaplegic homolog SMO - Smoothened
SNAIL2 - Snail family zinc finger 2 STOM - Stomatin
TCOF1 - Treacher-Collins-Franceschetti syndrome 1
TDT - Transmission disequilibrium test / Teste de desequilíbrio de transmissão
TGF- β - Transforming growth factor beta TIMP - Tissue inhibitor of metallopeptidase TIMP3 - Tissue inhibitor of metallopeptidase 3 TNFR - Tumor necrosis factor receptor
TNP1 - Transition nuclear protein 1
TRADD - Tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein
Tris - Tris-(hidroximetil)-aminometano UBF - Upstream binding fator
xxvi VAX1 - Ventral anterior homeobox 1 WNT - Wingless
WNT3 - Wingless-type MMTV integration site family, member 3 µl - Microlitros
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1 INTRODUÇÃO
As fissuras do lábio e/ou palato (FL/P) representam o defeito craniofacial congênito mais comum em humanos, podendo apresentar-se de forma isolada, não-sindrômica (FL/PNS), ou estar acompanhada por outras alterações, caracterizando uma síndrome (Dixon et al., 2011; Leslie e Marazita, 2013). As FL/Ps são classificadas com base na região anatômica envolvida e se divide em fissuras pré-forame incisivo (fissuras labiais-FL), fissuras pós-pré-forame incisivo (fissuras palatinas-FP) e fissuras transforme incisivo (fissuras lábio-palatinas-FLP). Baseando-se em evidências embriológicas e epidemiológicas, a FL é considerada uma variante menos intensa da FLP e ambas são classificadas juntas no grupo das fissuras labiais com ou sem fissura palatina (FL±P) (Harville et al., 2005; Grosen et al., 2010). A prevalência das FL/PNS entre os nascidos vivos pode variar com a origem étnica, gênero do indivíduo e fatores ambientais (Dixon et al., 2011). Mundialmente a prevalência das FL/PNS é alta, variando de 1:500 a 1:2500 nascidos vivos (Marazita et al., 2002a; Dixon et al., 2011). No Brasil a prevalência é da ordem de 1:685 a 1:2800 nascidos vivos (Martelli-Junior et al., 2007; Rodrigues et al., 2009).
As FL/PNS podem apresentar um grande impacto na saúde, qualidade de vida e bem-estar socioeconômico dos indivíduos afetados e de seus familiares. Adicionalmente, problemas de ordenação e hierarquização do sistema público de saúde, bem como de equidade de acesso aos serviços disponíveis, torna a assistência fora do alcance de muitos pacientes e familiares (Marazita et al., 2002a). Por outro lado, o ônus do não tratamento ou tratamento ineficiente, em termos de morbidade, incidência de distúrbios emocionais, estigmatização, exclusão social quanto às oportunidades educacionais e profissionais e de não inserção no mercado de trabalho, recai sobre o afetado, uma vez que as FL/PNS podem afetar além da estética, a sucção, alimentação, fala, audição e apresentar maior suscetibilidade a infecções e a distúrbios psicológicos, requerendo assim assistência multiprofissional por períodos prolongados (Trindade et al., 2007). Desta forma, entender o impacto das fissuras orofaciais é importante para identificar as necessidades não atendidas e desenvolver políticas públicas para reduzir o impacto das fissuras orofaciais no indivíduo e em sua família. Somando a isso, estudos de
2
sua etiologia têm sido amplamente realizados na tentativa de compreender os fatores de risco e projetar estratégias de prevenção (Dixon et al., 2011; Mangold et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012).
Uma origem multifatorial, atribuída à ação de fatores genéticos e ambientais, recai na etiologia das FL/PNS, tendo sido sugerido uma íntima associação com exposição materna aos fatores de risco do meio ambiente, incluindo medicamentos, álcool, tabagismo e deficiência de ácido fólico e vitaminas durante o primeiro trimestre da gravidez (Jianyan et al., 2010; Wehby e Murray, 2010). Em relação à participação genética nas FL/PNS, muitos estudos com diferentes estratégias estão sendo realizados, incluindo estudos de ligação, sequenciamento direto do DNA e estudos de associação de larga escala genômica (GWAS), que são baseados na comparação de vários polimorfismos genéticos comuns entre casos e controles (Dixon et al., 2011; Stuppia et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Rahimov et al., 2012). Visto que o desenvolvimento embrionário do lábio e do palato envolve uma série de eventos altamente coordenados, dos quais incluem proliferação, apoptose, migração e transição epitélio-mesênquima (Mossey et al., 2009), sugere que alterações nestes eventos podem também afetar a morfogênese das estruturas faciais resultando nas fissuras (Butali et al., 2011). Desta forma, a busca por variantes genéticas em genes com participação nestes eventos durante a morfogênese normal do lábio e palato também tem sido objeto de intensa investigação (Dixon et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Rahimov et al., 2012; Butali et al., 2014). A estratégia de avaliar o papel de variantes polimórficas em genes associados à embriogênese labial e palatina revelou a possível participação dos genes HOXD1 (homeobox D1), TNP1 (transition nuclear protein 1), MSX1 (muscle segment homeobox 1), TCOF1 (Treacher-Collins-Franceschetti syndrome 1), FGFR1 (fibroblast growth factor receptor 1), COL2A1 (collagen, type II, alpha 1), WNT3 (wingless-type MMTV integration site family, member 3) e TIMP3 (tissue inhibitor of metallopeptidase 3) no desenvolvimento de FL/PNS (Fallin et al., 2003; Juriloff et al., 2004; Beaty et al., 2006; Chiquet et al., 2008; Sull et al., 2008; Jagomagi et al., 2010; Menezes et al., 2010; Nikopensius et al., 2010; Butali et al.,
3
2011; Lace et al., 2011; Nikopensius et al., 2011; Yao et al., 2011; Letra et al., 2012; Mostowska et al., 2012; Smane et al., 2013; Souza et al., 2013; Letra et al., 2014).
O gene HOXD1 codifica um fator de transcrição que se faz importante no desenvolvimento craniofacial e alterações são associadas à ocorrência de FL/PNS (Beaty et al., 2006). Estudo in vivo demonstrou que o desenvolvimento ósseo ocorre pela regulação de genes da família HOX expressos pelas células da crista neural (Couly et al., 2002), e que a ação sinérgica dos genes HOXs é fundamental para o desenvolvimento craniofacial (Minoux et al., 2009). TNP1 é associado à morfogênese tecidual durante o desenvolvimento craniofacial (Sarmah e Wente, 2010). A proteína TNP1 é essencial na adesão celular focal à matriz extracelular (Jankowski e Gumucio, 1995) e alterações na sua expressão podem alterar o processo de migração das células da crista neural, favorecendo a formação das FL/PNS (Beaty et al., 2006). MSX1, um membro da família de genes homeobox, codifica um fator de transcrição que é altamente expresso durante a embriogênese e o desenvolvimento ósseo (Nassif et al., 2014). Estudo realizado com camundongos “knockout” para MSX1 revelou que MSX1 controla uma hierarquia genética envolvendo a sinalização controlada por BMPs (bone morphogenetic proteins) e SHH (sonic hedgehog), que regulam o crescimento e proliferação das células mesenquimais localizadas anteriormente no palato, sendo uma causa de desenvolvimento de FP (Zhang et al., 2002). TCOF1 codifica a proteína chamada “treacle”, que se mostra fundamental para a biogênese ribossomal específica para os tecidos da crista neural e ectoderma neural (Sakai e Trainor, 2009). Alterações neste gene são associadas com a síndrome de Treacher-Collins (Masotti et al., 2005) e na ocorrência de FL/PNS (Sull et al., 2008). “Treacle” é essencial para o recrutamento do complexo de transcrição nucleolar e níveis alterados desta proteína resultam na estabilização de p53 e na parada do ciclo celular na fase G1 (Jones et al., 2008). O gene FGFR1 codifica um receptor de tirosino-quinase fundamental para o desenvolvimento craniofacial (Rice et al., 2004). Camundongos “knockout” para FGFR1 apresentaram redução na proliferação das células epiteliais e mesenquimais na área frontal da face, impedido a completa elevação dos processos palatinos e o processo de fusão (Wang et al., 2013). COL2A1 é
4
responsável pela produção da cadeia α1 do colágeno do tipo II. Barbieri et al. (2003) demonstraram que COL2A1 controla a expressão de vários marcadores de diferenciação celular, incluindo FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3), IHH (indian hedgehog), RUNX2 (runt-related transcription factor 2) e COL10A1 (collagen, type X, alpha 1). Estudos realizados com camundongos deficientes para COL2A1 relataram uma formação óssea incompleta durante o processo de desenvolvimento palatino (Savontaus et al., 2004; Aberg et al., 2005). Em humanos, polimorfismos no gene COL2A1 são descritos como fatores de risco para o desenvolvimento das FL±PNS (Nikopensius et al., 2010). A expressão de WNT3 é encontrada na maxila e região média do nariz durante o desenvolvimento craniofacial (Lan et al., 2006). Em adição, WNT3 demonstram um padrão de expressão muito similar a BMPs durante a fusão labial, sugerindo um controle mútuo entre estas proteínas (Liu et al., 2005). TIMP3 são inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz (MMPs), controlando, entre outros fatores, a degradação da matriz extracelular (Baranger et al., 2014). Estudo realizado por Morris-Wiman et al. (2000) revelaram que TIMPs e MMPs são reguladas durante o desenvolvimento do palato e que a suas distribuições correlacionam com a remodelação dos componentes da matriz extracelular. Se o equilíbrio é rompido, malformações, como as FL/PNS podem ocorrer (Blavier et al., 2001).
Como variantes polimórficas em genes associados ao desenvolvimento facial podem contribuir para etiologia das FL/PNS, o presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de caracterizar a participação dos polimorfismos nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 na suscetibilidade para o desenvolvimento das FL/PNS em uma população brasileira.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Fissuras do lábio e/ou palato não-sindrômicas (FL/PNS)
As FL/PNS representam mundialmente as malformações congênitas mais frequentes da região craniofacial (World Health Organization, 2014). Aproximadamente 70% das FL±Ps e 50% das FP isoladas se manifestam de forma não-sindrômica, ou seja, sem malformações ou alterações adicionais (Jones, 1988; Marazita et al., 2002b). Os demais casos representam a forma sindrômica, composto por mais de 500 síndromes relatadas (Dixon et al., 2011). A classificação das FL/Ps depende da região anatômica envolvida e se divide basicamente em 3 grupos: fissuras pré-forame incisivo ou FLs, fissuras pós-forame incisivo ou FP e fissuras transforme incisivo ou FLP. A FL é o resultado da não fusão das proeminências nasais e maxilares, a FP ocorre quando os processos palatinos deixam de se fundir e quando surge à falha nos dois processos ocorre a FLP (Shkoukani et al., 2013).
Além de ser uma causa importante de mortalidade, chegando até 30% em países subdesenvolvidos e em áreas pontuais em países desenvolvidos, as FL/PNS são associadas também à significativa morbidade (Wehby et al., 2011). Efeitos sobre a fala, audição e estética geram resultados adversos sobre a saúde e integração social (Nopoulos et al., 2007; Mossey et al., 2009). Entre as primeiras complicações está à dificuldade no aleitamento materno, resultando em dificuldades no ganho de peso e no desenvolvimento da criança (Montagnoli et al., 2005). Pesquisas com pacientes fissurados em fase escolar registram alterações cognitivas que em sua maioria foram associadas a micro-alterações na trajetória do crescimento e desenvolvimento das estruturas cerebrais (Broder et al., 1998; Weinberg et al., 2013). A literatura também tem sido categórica em reportar um maior risco na incidência de alguns tipos de câncer nos indivíduos afetados por FL/PNS, possivelmente devido a variações comuns nos genes que regulam o crescimento e o desenvolvimento tecidual (Bille et al., 2005; Frebourg et al., 2006; Taioli et al., 2010; Zhou et al., 2011; Kuchler et al., 2014). No que diz respeito às alterações no desenvolvimento da dentição, as anomalias dentais também têm sido cada vez mais investigadas e detectadas com maior frequência em indivíduos com
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FL/PNS (Paranaiba, et al., 2013b). Além da saúde física, já se tem apontado o alto impacto das FL/PNS na saúde mental dos afetados, uma vez que estes podem apresentar um maior risco em desenvolver distúrbios psiquiátricos que interferem na vida social (Trindade et al., 2007; Lima et al., 2015). Todas estas complicações, vastamente estudadas, reforçam o impacto negativo que as FL/PNS podem acarretar ao indivíduo, trazendo inúmeras consequências, diretas e indiretas na sua qualidade de vida, tanto nos aspectos individuais quanto familiares e sociais (Wehby e Cassell, 2010).
Devido à complexidade das manifestações clínicas, os indivíduos afetados por FL/PNS necessitam de acompanhamento especializado e assistência integral a longo prazo em centros de referência de alta complexidade (Wehby e Cassell, 2010). Embora a reabilitação seja possível com o atendimento de boa qualidade, as FL/PNS inevitavelmente constituem um ônus para o indivíduo, para a família e para a sociedade, com um custo substancial em termos de saúde e serviços relacionados (Dixon et al., 2011).
2.2 Embriologia do lábio e palato e a associação com FL/PNS
O desenvolvimento normal do lábio ocorre entre a 4a e 8a semana de gestação. Até o final da 4a semana, as células da crista neural, oriundas do tubo neural anterior, migram para formar o primórdio da face, surgindo dela o processo nasal medial e lateral, que se fundem ao processo maxilar, para formar a parte central do lábio superior, o palato primário e o nariz (Marazita e Mooney, 2004). O palato primário aloja os dentes incisivos da maxila, dando origem à parte anterior do forame incisivo e também contribuindo para a formação do lábio e a porção anterior da maxila (Rice, 2005). O palato secundário se desenvolve após o palato primário durante a 6a e a 12a semanas. Os processos palatinos se elevam acima da língua, fundindo medialmente na linha média, anteriormente com o palato primário e superiormente com o septo nasal. O forame incisivo marca a extensão anterior do palato secundário. A formação dos palatos primário e secundário completa a separação das cavidades nasal e oral, permitindo a respiração simultaneamente à mastigação (Dixon et al., 2011).
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Figura 1 - Desenvolvimento do lábio e palato. (A) Desenvolvimento da proeminência
frontonasal, processos maxilares e mandibulares delimitando a cavidade oral primitiva na quarta semana do desenvolvimento embrionário. (B) Na quinta semana, as fossetas nasais foram desenvolvidas com a formação dos processos nasais mediais e laterais. (C) Os processos nasais mediais se fundem com o processo maxilar para formar a parte central do lábio superior e palato primário até o final da sexta semana. O processo lateral forma a asa do nariz. Da mesma forma, os processos mandibulares se fundem para formar o mandíbula. (D) Durante a sexta semana de embriogênese, o palato secundário desenvolve com crescimento bilateral dos processos maxilares, que crescem verticalmente para baixo do lado da língua. (E) Posteriormente, os processos palatinos elevam a uma posição horizontal acima da língua unindo na linha média. (F) Fusão dos processos palatinos, separando o espaço oronasal em cavidade oral e nasal. Modificado a partir de Dixon et al., 2011.
Figura 2 - Fissura de lábio e/ou palato não-sindrômica. (A) Fissura labial. (B) Fissura
palatina. (C) Fissura lábio-palatina unilateral incompleta. (D) Fissura lábio-palatina unilateral completa. (E) Fissura lábio-palatina bilateral completa. Modificado a partir de Mossey et al., 2009. A C D E A B C E D F B
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O acometimento da FL pode ou não estar associado com a FP, assim como a FP pode surgir independentemente da FL, onde é explicado pela diferença na etiologia dentre as duas manifestações (Dixon et al., 2011). A gravidade da extensão da FL/P é associada ao tempo, gravidade e quantidade de interrupção do desenvolvimento (Economou et al., 2012). Um período crítico é imediatamente antes da formação do palato primário e do lábio, visto que ocorre uma explosão de crescimento mitótico. Durante este período, o desenvolvimento é altamente vulnerável a efeitos genéticos e teratogênicos (Seelan et al., 2012).
Neste contexto é relatado o envolvimento de uma série complexa de eventos que exigem uma estreita relação entre proliferação, apoptose, migração e transição epitélio-mesênquima (Stanier e Moore, 2004; Mossey et al., 2009). A proliferação celular é regulada por diversas proteínas, chamadas de fatores de crescimento. Após a ligação ao seu receptor de superfície celular, estas moléculas sinalizadoras iniciam uma cadeia de eventos moleculares que ativam fatores de transcrição. Estes fatores de transcrição ligam-se às regiões reguladoras do genoma e permitem que haja uma ligação entre a enzima RNA-polimerase e o DNA, ocorrendo assim à transcrição e a futura tradução. Estudos sobre o desenvolvimento orofacial têm identificado uma série de moléculas chaves, incluindo os membros das famílias dos fatores de crescimento fibroblástico (FGF), sonic hedgehog (SHH), wingless (WNT) e dos fatores de crescimento transformante beta (TGF-β), o qual incluem as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) e ativinas (Wurdak et al., 2005; Kouskoura et al., 2011). Defeitos nos fatores de crescimento ou nos seus receptores têm sido associados com o surgimento das fissuras orais (Lidral et al., 1998; Riley et al., 2007a). Durante a palatogênese, por exemplo, é descrito a expressão de SHH no epitélio oral que se liga ao seu receptor PTCH (patched) (Rice et al., 2005) no mesênquima subjacente para ativar o receptor SMO (smoothened) e permitir a proliferação celular, visto que a expressão de SMO regula ciclina D1 e D2 no ciclo celular (Lan e Jiang, 2009). Simultaneamente, FGF10 (fibroblast growth factor 10) é expresso no mesênquima e se liga ao seu receptor FGFR2 no epitélio palatino para também regular a proliferação celular (Rice et al., 2004). A sinalização da proteína BMP via o receptor de BMPR1A (bone morphogenetic protein receptor,
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type IA) no mesênquima regula o crescimento do palato e a expressão de MSX1, SHOX2 (short stature homeobox 2) e de SHH no epitélio do palato (Baek et al., 2011), que serão importantes no processo de proliferação celular e na transição epitélio mesênquima (Finnerty et al., 2009).
Apoptose é um processo que desempenha papel central no desenvolvimento embrionário e na morfogênese tecidual (Wei et al., 2008). A apoptose pode ser desencadeada por duas vias: extrínseca e intrínseca. A via extrínseca é ativada por ligantes que se acoplam em receptores da membrana celular. Esses receptores pertencem à família dos receptores do fator de necrose tumoral (TNFR - tumor necrosis factor receptor) que possuem domínios de morte celular onde ativam proteínas adaptadoras (FADD - Fas-associated protein with death domain e TRADD
- Tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein), que por sua vez ativam pró-caspases iniciadoras do processo apoptótico. A ativação da cascata das caspases que além de clivar substratos na célula, podem também ativar a via intrínseca mitocondrial por meio da interação com membros da família BCL2 (B-cell CLL/lymphoma 2) (Cory e Adams, 2002). Desta forma a apoptose é um processo complexo e o seu controle se faz essencial para a formação correta do lábio e palato (Dudas et al., 2007). A proteína “treacle”, codificada pelo gene TCOF1, é um precursor da morte celular das células da crista neural durante o desenvolvimento craniofacial devido a ativação e estabilização de p53 (Marszalek et al., 2002), visto que p53 se faz importante no processo de checagem do DNA no ciclo celular e um dando grave na sequência de DNA promove a morte celular (Polyak et al., 1997).
A migração celular é um evento importante no processo morfogênico, deste a gastrulação até o desenvolvimento dos múltiplos órgãos (Hu et al., 2014). O início do processo de migração das células da crista neural ainda não é totalmente conhecido. Sabe-se que uma série de fatores de transcrição são estimulados, como SNAIL2 (snail family zinc finger 2), responsável por promover alterações no citoesqueleto da célula durante o processo migratório (Khudyakov e Bronner-Fraser, 2009). As células alteraram as junções celulares, suas propriedades de adesão e a morfologia para adquirir motilidade, o que permite migrar para seus
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destinos finais (Strobl-Mazzulla e Bronner, 2012; Rogers et al., 2013). Durante a migração, as células da crista neural interagem uma com as outras e com o meio ambiente através de receptores de sinalização, tais como os receptores NRP (neuropilin), Robo (roundabout) e EPH (ephrin), que orientam para destinos específicos de cada célula (Sauka-Spengler e Bronner-Fraser, 2006; Betancur et al., 2010). Defeitos no processo de migração celular têm sido associados ao desenvolvimento das fissuras orais (Nikopensius et al., 2010). Durante o desenvolvimento craniano, é descrito que “knockdown” de SNAIL2 impede o desligamento da transcrição da molécula de adesão CAD6B (cadherin 6b), inibindo assim a migração das células da crista neural (Strobl-Mazzulla e Bronner, 2012). Outro fator importante durante a migração celular é a matriz extracelular. Estudos relacionando capacidade de proliferação celular e metabolismo de matriz extracelular é descrito como fator causal no desenvolvimento de FL/P, assim como de genes relacionados à inibição da degradação da matriz extracelular (Enomoto et al., 2010; Nikopensius et al., 2011; Baranger et al., 2014), visto que, este processo é necessário para o crescimento e posicionamento adequado das proeminências faciais e lâminas palatinas durante a morfogênese orofacial (Kerrigan et al., 2000; Dhulipala et al., 2006; Meng et al., 2009).
O processo de transição epitélio-mesênquima é caracterizado pela mudança no fenótipo epitelial para mesenquimal que leva a perda ou expressão reduzida dos marcadores de células epiteliais, como E-caderina, e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais, como N-caderina e vimentina, regulado pelo aumento da expressão dos fatores de transcrição, como TWIST e SNAIL2 (Strobl-Mazzulla e Bronner, 2012). Várias vias de sinalização são descritas na indução da transcrição epitélio-mesênquima, como BMP, FGF (fibroblast growth factors), endotelina e SHH, durante o desenvolvimento craniofacial (Chen et al., 1996; Kettunen e Thesleff, 1998). Na formação do palato, por exemplo, é relatado que a perda de expressão de TGFβ (transforming growth factor beta) nas células epiteliais compromete a ativação da via de sinalização WNT e a expressão dos receptores SMAD2 e SMAD3 (Iwata et al., 2014). Assim, o complexo SMAD combina com os fatores de transcrição em sequência de genes de regulação para ativar ou reprimir
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a transcrição (Massague, 2012). Defeito nesta via pode alterar o desenvolvimento craniofacial (Kang e Svoboda, 2005) e promover a ocorrência das FL/PNS (Iwata et al., 2014).
2.3 Epidemiologia das FL/PNS
As FL/PNS afetam aproximadamente 1 em cada 500 a 2.500 nascidos vivos, com ampla variabilidade de acordo com a etnicidade e exposição a fatores ambientais de risco. Em geral, as populações asiáticas e ameríndias possuem uma alta prevalência (1:500), as populações europeias possuem prevalência intermediária (1:1.000) e as menores taxas de prevalência são observadas em africanos e descendentes de africanos (1:2.500) (Mossey e Little, 2002; Mossey et al., 2009; Murthy e Bhaskar, 2009). Levantamentos epidemiológicos realizados no Brasil mostraram prevalência entre 0,36 a 1,46 casos de FL/PNS para cada 1.000 nascidos vivos, com uma maior frequência no gênero masculino (Martelli-Júnior et al., 2006; Rodrigues et al., 2009).
Os diferentes tipos de fissuras apresentaram distribuições distintas e a incidência varia entre os diferentes grupos populacionais (Moosey e Little, 2002; Vieira, 2008; Mossey et al., 2009). A frequência de FLP foi maior em algumas regiões da América Latina e Ásia (China e Japão) e menor em Israel, África do Sul e sul da Europa (Mossey e Little, 2002). A FP isolada apresentou frequência elevada no Canadá e em partes do norte europeu, porém menores em algumas regiões da América Latina e África do Sul (Mossey e Little, 2002; Matthews et al., 2015). No Brasil observa maior frequência de FLP (39,7%), seguida por FL (38,1%) e pela FP (22,2%) (Martelli-Junior et al., 2007).
Uma variabilidade interessante pode ser observada na incidência das FL/PNS em relação ao gênero. As FL±P tem uma prevalência maior em indivíduos do gênero masculino, enquanto as FPs são mais frequentes no gênero feminino (Mossey et al., 2009; Martelli et al., 2012). Aproximadamente 75% das fissuras que envolvem o lábio são unilaterais. Entre as fissuras unilaterais, o lado esquerdo é duas vezes mais afetado que o lado direito (Gundlach e Maus, 2006). O risco de FL em relação à FP foi 2,19 vezes maior em homens quando comparados às mulheres
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e o risco de FLP em relação à FP foi 2,78 vezes maior em homens quando comparado às mulheres (Martelli et al., 2012).
Mesmo alguns estudos apontando que o fator socioeconômico pode interferir no aparecimento das fissuras, a sua influência na prevalência não foi conclusivamente confirmada (Carmichael et al., 2003; Yang et al., 2008). Possíveis explicações para as diferenças na prevalência entre origens geográficas e status socioeconômico incluem a influência dos fatores ambientais, tais como os hábitos maternos na gravidez, nutrição e acesso à saúde (Leslie e Marazita, 2013).
2.4 Etiologia das FL/PNS
As FL/PNS são etiologicamente heterogêneas. Estudos genéticos e epidemiológicos indicam que há participação de fatores genéticos e ambientais na etiologia desta anomalia congênita, embora sua etiopatogenia permaneça incerta (Dixon et al., 2011; Mangold et al., 2011). Nos últimos anos tem ocorrido uma evolução no entendimento dos fatores causais, com a identificação de novas variantes genéticas, de fatores de risco ambientais e de como os fatores de risco ambientais interagem com os fatores genéticos. Este conhecimento deve, eventualmente, resultar em melhor prevenção, tratamento e prognóstico para os indivíduos afetados (Dixon et al., 2011; Mangold et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012).
2.4.1 Fatores ambientais
Há uma enorme variedade de agentes teratogênicos externos que podem influenciar o desenvolvimento do lábio e do palato, embora poucos deles estejam comprovados. Tem sido sugerido que a exposição materna a alguns fatores teratogênicos como medicamentos, álcool e tabaco e as deficiências vitamínicas, principalmente ácido fólico, durante o primeiro trimestre de gestação está intimamente associada com a ocorrência das FL/PNS (Jianyan et al., 2010; Wehby e Murray, 2010). As complexidades dos mecanismos envolvidos se diferem quanto ao tipo, frequência e gravidade, resultando na diversidade das manifestações clínicas das fissuras (Economou et al., 2012).
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Um dos fatores que podem influenciar na ocorrência de malformações congênitas é a desnutrição materna durante a gestação, pois pode reduzir a capacidade de produção de hormônios e nutrientes indispensáveis ao feto, sendo considerado um elemento agravante no aparecimento das FL/PNS (Krapels et al., 2006). A ingestão adequada de zinco, niacina, ácido ascórbico, ferro e magnésio supridos por meio dos alimentos ou da suplementação vitamínica pode reduzir o risco de malformações (Krapels et al., 2006; Johnson e Little, 2008). Além destes, a ingestão do ácido fólico também tem sido amplamente estudada na prevenção das FL/PNS (Loffredo et al., 2001; Johnson e Little, 2008; Boyles et al., 2011; Figueiredo et al., 2015). A suplementação com ácido fólico tem sido proposta na prevenção de defeitos no tubo neural e de FL/PNS, isto explicado devido sua ação na síntese de nucleotídeos, de aminoácidos e na metilação do DNA, onde se faz necessária na dinâmica da cromatina e na expressão gênica subsequente (Wilcox et al., 2007; Bufalino et al., 2010; Arruda et al., 2013). No entanto, estudos com suplementação de ácido fólico não encontraram uma diminuição na ocorrência de FL/PNS (Ray et al., 2003; Lopez-Camelo et al., 2010; Wehby e Murray, 2010), o que sugere o envolvimento de variantes polimórficas em genes como MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase), que codificam proteínas relacionadas ao metabolismo do ácido fólico, ao risco aumentado para o surgimento de FL/PNS (Bufalino et al., 2010; Bezerra et al., 2014; Aquino et al., 2014a).
O tabagismo materno é considerado um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento das FL/PNS (Wyszynski et al., 1997; Little et al., 2004; Honein et al., 2007). Contudo, existem divergências nos resultados sobre o papel do tabagismo no surgimento das FL/PNS. Entre as pesquisas que não constataram associação entre FL/PNS e tabagismo destacam-se um estudo caso-controle realizado por Loffredo et al. (1994) e outro por Coutinho (2009). A associação entre o hábito materno de fumar na gestação e o desenvolvimento das FL/PNS também foi considerado inconsistente de acordo com Chevrier et al. (2008). Entre os registros que confirmam a associação de tabaco com FL/PNS, destaca-se o estudo de Wyszynski et al. (1997), que no período de três décadas (de 1966 a 1996), em um total de 11 estudos analisados, registrou que o risco atribuível ao fumo é de 11%
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para FL/P e 12% para FP. Outro estudo de meta-analise, que incluiu 22 trabalhos publicados no período de 1966 a 2002, também evidenciou o risco de FL/PNS e o hábito de tabagismo (Little et al., 2004). O estudo de Zhang et al. (2011) com 304 pacientes com FL/PNS de origem Chinesa também evidenciou uma forte associação entre tabagismo e FL/PNS. A dificuldade destes estudos é que a suscetibilidade ao cigarro depende da biotransformação dos compostos tóxicos na mãe e no embrião que muitas vezes não são facilmente tangíveis ou mensuráveis. Interessante observar que o tabagismo durante a gravidez é também associado com malformações dos membros, espinha bífida, recém-nascido com peso e estatura menor, se comparados com os filhos de mães não fumantes e ainda com o aumento elevado no risco de prematuridade (Wang et al., 2014).
Alguns estudos demonstraram evidências de interações entre tabagismo e polimorfismos genéticos, bem como a influência de determinados genes que atuam nas vias de desintoxicação metabólicas no desenvolvimento das FL/PNS (Chevrier et al., 2008; Van Den Boogaard et al., 2008; Jianyan et al., 2010; Li et al., 2011; Wu T et al., 2012). Registros demonstram associações significantes entre variações polimórficas nos genes GSTM1 (glutathione S-transferase mu 1) e GSTT1 (glutathione S-transferase theta 1) e tabaco em FL/PNS (Lammer et al., 2005; Shi et al., 2007; Chevrier et al., 2008). Outro gene em associação com o tabagismo materno que apresentou risco aumento no desenvolvimento de FL/PNS foi o RUNX2 (Wu T et al., 2012). O estudo mais recente, visando correlacionar as variáveis genéticas e ambientais, revelou uma forte interação entre tabagismo na gravidez e os polimorfismos nos genes SLC2A9 (solute carrier family 2) e WDR1 (WD repeat domain 1), localizados no cromossomo 4p16.1 em pacientes com FL/PNS (Wu et al., 2014).
O álcool é considerado o teratógeno mais consumido mundialmente e o seu uso durante os períodos iniciais da gestação pode contribuir significantemente para o aparecimento de várias alterações congênitas (Leite et al., 2002). Alguns trabalhos consideram que a contribuição do álcool para o desenvolvimento de FL/PNS é significativa (Romitti et al., 1999; Lorente et al., 2000b; Chevrier et al., 2005; Deroo et al., 2008). No entanto, outros consideram os resultados da associação
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inconsistentes (Meyer et al., 2003; Romitti et al., 2007b). Estes resultados podem ser justificáveis pela dificuldade em mensurar a quantidade, a frequência e o tempo do consumo do álcool em gestantes. Também nem sempre a bebida alcóolica é consumida exclusivamente, havendo frequentemente a associação deste agente teratogênico com outros, como tabaco, drogas ilícitas e ainda aspectos nutricionais (Krapels et al., 2006). Já em pesquisas abordando a suscetibilidade genética e consumo de álcool, Romitti et al. (2007b) observaram que a presença do alelo variante no gene MSX1 (gene que é intensamente expresso durante a embriogênese facial) e o consumo de apenas 1 dose semanal de bebida alcóolica pela mãe pode ser responsável por um aumento no risco de desenvolvimento de FL/PNS. Um trabalho recente desenvolvido por Bezerra et al. (2014) relata um risco aumentado para o desenvolvimento de FL/PNS em mulheres que consumiram bebidas alcoólicas juntamente com a falta de suplementação com ácido fólico e polimorfismos do gene MTHFR.
Além do tabaco e do álcool, uma variedade de drogas ilícitas como a maconha, cocaína e o craque, entre outras, já foram descritas como teratogênicas (Lorente et al., 2000b; Lammer et al., 2004; Yang et al., 2014). O uso de alguns medicamentos também pode aumentar o risco de malformações congênitas, entre eles a talidomida, os hormônios androgênicos, os anticonvulsivantes, os anticoagulantes, os antibióticos e os anti-inflamatórios, os quais podem atuar nas diversas fases da morfogênese (Abdo e Machado, 2005).
Diferentes atividades de trabalho e diversos compostos químicos utilizados nos processos produtivos têm sido associados com o aumento de risco de defeitos ao nascimento, entretanto, muitas destas associações não são facilmente confirmadas (Garlantezec et al., 2009). Na gravidez ocorrem mudanças importantes no que tange os aspectos fisiológicos e a composição corporal da mulher, estas adaptações são necessárias para o sucesso da gestação, crescimento e desenvolvimento fetal (Desrosiers et al., 2012). A literatura reúne evidências da associação entre malformações congênitas e a exposição ocupacional a agentes químicos, comumente encontrados em áreas industriais, como solventes e metais pesados, e os pesticidas nas áreas agrícolas (Chevrier et al., 2007). Entre as
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substâncias químicas que produzem risco ao feto, além dos pesticidas de uso agrícola, listam também o sanitário e o doméstico. Segundo sua atividade, os defensivos agrícolas são classificados em inseticidas, acaricidas, fungicidas, raticidas, herbicidas, nematocidas e moluscocidas. Sua entrada no organismo pode ser por via inalatória ou por absorção através das mucosas e pele (Rojas-Martinez et al., 2010).
Diversos estudos têm apontado que a exposição ocupacional das mães a agrotóxicos pode favorecer e aumentar o risco no aparecimento das FL/PNS (Lorente et al., 2000a; Romitti et al., 2007a; Gonzalez et al., 2008; Jia et al., 2011). Tendo em vista os fatores apresentados, Garcia (2000) levantou a hipótese de que em áreas agrícolas em períodos de pico do uso de agrotóxicos, a gestante poderia demonstrar um aumento no risco de ter um filho com defeitos congênitos como a FL/PNS. Mesmo apresentando limitações neste estudo, principalmente pela dificuldade em quantificar a exposição ao agrotóxico durante a gestação nestas regiões, outros estudos também afirmam esta associação (Shaw e Gold, 1988; Chevrier et al., 2006; Yang et al., 2014). Adicionalmente, Vieira e Orioli (2002) destacaram que doenças infecciosas parecem ter uma ação danosa sobre o andamento da gravidez, uma vez que o embrião pode ser atingido por certas bactérias, protozoários, vírus, micoplasmas, espiroquetas, fungos ou pseudomonas, responsáveis por enfermidades na mãe.
Além dos fatores ambientais classicamente descritos, já foi observado em alguns estudos a possível influência de enfermidades crônicas, como obesidade e diabetes, no aparecimento das FL/PNS (Beaty et al., 2001; Vieira et al., 2002; Leite et al., 2005). Mães diabéticas com filhos fissurados demonstraram a presença de um fator anti-insulina, ligado a albumina, que altera a mobilização proteica e diminui a nutrição das células, alterando seu comportamento e determinando alterações na morfogênese (Abdo e Machado, 2005). O estresse materno tem cada vez mais sido objeto de investigação para intercorrências fetais e foi considerado fator de risco para a FL/PNS (Carmichael et al., 2007). Em estudo recente, Carmichael et al. (2014), avaliando um grupo de 1.100 pacientes com FL/PNS, confirmaram que o estresse nos períodos iniciais da gravidez pode aumentar o risco para o
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aparecimento de FL/PNS. Entretanto, em vista das interações complexas da sua ação na patogenia da maioria das malformações é difícil estabelecer o exato papel de cada um destes teratogênicos na etiologia das FL/PNS.
2.4.2 Fatores genéticos
Fogh-Andersen (1942) foi o primeiro a observar, em um estudo populacional, a existência de um componente hereditário associado ao desenvolvimento das FL/PNS. Nas últimas décadas alguns estudos tem indicado recorrência familial no desenvolvimento de FL/PNS (Sivertsen et al., 2008; Grosen et al., 2010), embora um padrão clássico de herança mendeliana não seja identificado (Natsume et al., 2000; Vieira, 2008).
Curtis et al. (1961) demonstraram que o risco de uma segunda ocorrência de FL/PNS em uma mesma família é de 4% se a criança for afetada, 4% se os pais forem afetados, 9% se existirem duas crianças afetadas e 17% se os pais e uma criança forem afetados. Interessantemente nota-se que famílias afetadas por um tipo de fissura não apresentam risco aumentado para outro tipo de fissura, refletindo assim as origens distintas de desenvolvimento de cada forma da anomalia (Jugessur e Murray, 2005). No entanto, ocasionalmente, as FL±P e FP isoladas podem ocorrer dentro de uma mesma família, sugerindo que existe, pelo menos, alguma sobreposição na etiologia destes 2 tipos de fissuras (Leslie e Marazita, 2013).
O estudo de Martelli et al. (2010) avaliou a incidência familial de FL/PNS em 185 pacientes e identificou que 35,13% dos indivíduos apresentaram histórico familial de FL/PNS, sendo os primos (54,37%) e os irmãos (21,05%) os mais afetados, independentemente do tipo de fissura. Em estudos com gêmeos, a taxa de concordância observada de 40 a 60% em gêmeos monozigóticos é muito maior do que a concordância de 3 a 5% identificada em gêmeos dizigóticos (Jugessur et al., 2009). A alta taxa de concordância entre gêmeos monozigóticos fornece evidências convincentes para um componente genético forte para as fissuras orofaciais.
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Estudos recentes com abordagens diferenciadas têm sido realizados com o objetivo de identificar os genes envolvidos com a etiologia das FL/PNS. As abordagens mais recentes são baseadas em estudos de associação de larga escala genômica (GWAS), no qual polimorfismos distribuídos pelo genoma são analisados simultaneamente em pacientes afetados ou não pelas FL/PNS. Estes estudos identificaram a maior parte dos genes e regiões cromossômicas associadas a etiologia das FL/PNS conhecidas até o momento (Dixon et al., 2011; Stuppia et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Ludwig et al., 2012; Rahimov et al., 2012; Bohmer et al., 2013). Dentre as diferentes regiões cromossômicas, destacam-se a 17p13.1 (Wyszynski et al., 2003), 2p13, 3q27-28, 14q21-24, 16q24 (Marazita e Mooney, 2004), 8p11-23 (Riley et al., 2007b), 19p13.12, 19q12, 2q22.3 (Vieira et al., 2002), 9q21, 1p32, 1q32 (Marazita et al., 2009), 8q24.21, 18q22 (Birnbaum et al., 2009; Grant et al., 2009), 9q22 (Moreno et al., 2009; Letra et al., 2010b) 10q25.3, 17q22, 2p21 (Mangold et al., 2010), 1p22, 20q12, 1p36 (Beaty et al., 2010), 6q14.2-14.3 (Letra et al., 2010a) e 3p11 (Ludwig et al., 2012). No entanto, apenas 2 marcadores foram reproduzidos em diferentes populações, os quais estão localizados no gene IRF6 (interferon regulatory factor 6) e em uma região intergênica na região 8q24 (Mostowska et al., 2010; Rojas-Martinez et al., 2010; Murray et al., 2012). Estudos confirmaram a associação do lócus 8q24 na população brasileira (Brito et al., 2012; Bagordakis et al., 2013), mas a participação do gene IRF6 é discutida (Paranaiba et al., 2010; Brito et al., 2012).
Outras abordagens que são frequentemente utilizadas para a descoberta de genes e regiões de suscetibilidade as FL/PNS incluem estudos com genes associados a síndromes mendelianas que apresentam a fissura no espectro fenotípico (Kondo et al., 2002), modelos animais (Juriloff e Harris, 2008), análises citogenéticas (Brewer et al., 1999; Higgins et al., 2008), análises de expressão gênica (Yu et al., 1999; Mukhopadhyay et al., 2004; Gong et al., 2005; Zhu, et al., 2009) e estudos de ligação do genoma (Birnbaum et al., 2009; Marazita et al., 2009). A análise de variantes polimórficas em genes envolvidos com a embriogênese normal do lábio e palato também tem sido frequentemente realizada e revelado a participação de inúmeros genes, incluindo WNT (Mostowska et al., 2012), TGFβ3
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(Saleem et al., 2012), SHH (Orioli et al., 2002), MSX (Jagomagi et al., 2010; Butali et al., 2011), PDGF (platelet-derived growth factor beta) (Wu D et al., 2012), RARA (retinoic acid receptor, alpha) (Maestri et al., 1997), BCL3 (B-cell CLL/lymphoma 3) (Gaspar et al., 2002), MMP, TIMP2 (Letra et al., 2007; Letra et al., 2012; Letra et al., 2014), FOXE1 (forkhead box E1), PTCH, STOM (stomatin)(Letra et al., 2010b), MAFB (v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B), PAX7 (paired box 7), VAX1(ventral anterior homeobox 1) e ABCA4 (ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 4) (Fontoura et al., 2012; Butali et al., 2014).
A diversidade de eventos embriológicos que contribuem para a formação das estruturas faciais reflete no grande número de genes conhecidos ou suspeitos de estarem envolvidos na formação das FL/PNS (Jugessur et al., 2009; Rojas-Martinez et al., 2010). Diante da complexidade destes processos descritos, pode-se perceber o significado biológico dos mecanismos de desenvolvimento embrionário e a sua importância, pelo fato da ocorrência de alguma falha neste processo, poder contribuir para possíveis alterações congênitas. A seguir serão descritos os polimorfismos genéticos nos genes de desenvolvimento embrionário analisados neste estudo, bem como a participação desses genes nos diferentes mecanismos de formação craniofacial.
2.4.2.1 HOXD1
O gene HOXD1 está localizado no cromossomo 2q31.1, possui 3 éxons e codifica uma proteína com 161 aminoácidos com a função de fator de transcrição envolvido na diferenciação e desenvolvimento tecidual. HOXD1 está relacionado no desenvolvimento craniofacial, especificamente no desenvolvimento a partir do primeiro arco faríngeo (Couly et al., 2002; Vieux-Rochas et al., 2013). Interessantemente, sua repressão é necessária para o desenvolvimento do osso nasal, maxila e mandíbula, enquanto que sua expressão é necessária para a formação do osso hióide (Couly et al., 2002). Além disto, HOXD1 está relacionado ao desenvolvimento vascular e nervoso (Guo et al., 2011; Park et al., 2011). O “knockdown” de HOXD1 em células endoteliais inibi a migração, adesão e a formação de estruturas vasculares. Estes eventos foram correlacionados com a
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redução da expressão de integrina β1, importante na sinalização da angiogênese (Park et al., 2011). Vários estudos têm relacionado HOXD1 com alguns tipos de câncer, como o de ovário (Goode et al., 2010), colorretal (Jacinto et al., 2007; Pussila et al., 2013) e mama (Jeschke et al., 2012). Além disso, também tem sido estudado em outras condições como no autismo (Bacchelli et al., 2003).
O gene HOXD1 emergiu como um forte candidato para FL/PNS a partir de estudos de associação realizados em populações de origens étnicas diferentes (Beaty et al., 2006). No entanto, há poucos estudos relacionados a variações genética no gene HOXD1 como fator de risco para FL/PNS. O presente estudo avaliou o polimorfismo rs1374326, localizado na posição 177058316 do gene HOXD1, onde resulta uma transição de um alelo C para um T. O estudo realizado por Beaty et al. (2006) avaliaram 47 polimorfismos identificados no gene HOXD1, em regiões funcionalmente importantes. Destes, apenas o polimorfismo rs1374326 localizado em região intrônica mostrou associação significante com FPNS, sugerindo assim a participação do gene HOXD1 na etiologia da fissura oral.
2.4.2.2 TNP1
A família TNP é representada por 2 genes (TNP1 e TNP2), que foram associados ao desenvolvimento craniofacial e morfogênese tecidual (Sarmah e Wente, 2010). TNP1 está localizado no cromossomo 2q35-q36, possui 2 éxons e codifica uma proteína chamada “spermatid nuclear transition protein 1” de 54 aminoácidos. Sugere a relação de polimorfismos no gene TNP1 com o desenvolvimento de FL/PNS, baseado em observações em estudos de associação (Beaty et al., 2006). TNP1, foi recentemente identificado como um parceiro de ligação da subunidade α da proteína kinase (CK2- casein kinase 2) (Mannowetz et al., 2010), que está envolvida no crescimento, proliferação e apoptose celular (Ortega et al., 2014). Defeito nesta via pode desenvolver alterações importantes na embriogênese (Dominguez et al., 2011), assim como na formação óssea pela inativação da via BMP (Bragdon et al., 2011).
Vários estudos têm relacionado TNP1 com o câncer de mama (Long et al., 2013; Han et al., 2014). Além disso, o gene TNP1 também tem sido recentemente
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estudado em outras condições como a infertilidade masculina e obesidade (Okada et al., 2010; Heidari et al., 2014). Este estudo analisou o polimorfismo rs748044, localizado na posição 218154042, onde resulta uma transição de um C para um T. Um estudo recente mostrou a participação do gene TNP1 na ocorrência FL/PNS através de mapeamento de 962 polimorfismos em 104 genes no cromossomo 2 em 172 trios de FL±P e 60 trios de FP provenientes de Maryland, Singapura e Taiwan. Por meio da análise do teste de desequilíbrio de transmissão e haplótipo, revelou uma associação do polimorfismo rs748044 com FPNS, sendo que o alelo T estaria associado a um risco maior (Beaty et al., 2006).
2.4.2.3 MSX1
MSX1 é um membro da família de genes homeobox com uma participação fundamental no desenvolvimento craniofacial (Zhang et al., 1999; Nassif et al., 2014). O gene MSX1 está localizado no cromossomo 4p16, é composto por 2 éxons, codifica uma proteína de 297 aminoácidos e possui regiões altamente conservadas entre as espécies, o que sugere um papel importante no desenvolvimento (Coudert et al., 2005). Múltiplas linhas de evidências sugerem que o gene MSX1 está envolvido na promoção do crescimento e inibição da diferenciação celular (Blin-Wakkach et al., 2001; Nassif et al., 2014). Este gene possui um papel importante na indução da interação epitélio-mesênquima e, consequentemente, na organogênese de vertebrados (Alappat et al., 2003; Finnerty et al., 2009). As proteínas codificadas pelos genes homeobox possuem em comum um homeodomínio altamente conservado entre as espécies, cuja função é reconhecer sequências específicas de DNA nos genes alvo, visando controlar a expressão destes por meio de ativação ou repressão gênica (Ivens et al., 1990). Mutações no gene MSX1 em humanos estão associados com FP e/ou agenesia dentária (Vastardis et al., 1996; Cobourne, 2007), assim como a síndrome de Wolf-Hirschhorn, que apresenta como característica comum a FL/P (Paradowska-Stolarz, 2014). Um fenótipo semelhante é observado em camundongos “knockout” para o gene MSX1 (Vastardis et al., 1996). No entanto, pouco se sabe sobre a função do MSX1 na diferenciação dos osteoblastos e na mineralização óssea in vivo. Nassif et al. (2014) relatam que camundongos
