Análises Multivariadas (MALDI-TOF/MS)

Para a análise SVM (Support Vector Machine), considerou-se 2 classes, “E” e “H”, referindo-se aos isolados de E. faecalis oriundos de alimentos (30) e de uroculturas (30), respectivamente. SVM é uma ferramenta de reconhecimento de variáveis (íons) utilizada a fim de se construir um modelo classificatório. É uma técnica menos suscetível a outliers e overfitting, além de se mostrar indiferente à ordem distributiva das diferentes classes amostrais. Tal modelo foi utilizado com o intuito de diferenciar enterococos relacionados à comunidade, como os encontrados em alimentos, de isolados relacionados ao ambiente nosocomial.

A curva ROC (Receiver Operating-Characteristic) é a razão entre a sensibilidade e a acurácia do método em um certo intervalo de confiabilidade. O valor de AUC (Area Under the Curve) de ROC mensura a viabilidade do modelo SVM em discriminar corretamente as amostras distribuídas entre as 2 classes. Obteve-se uma acurácia média de 99,90% e a divisão de culturas entre elas mostrou-se estatisticamente relevante (p < 0,05).

O modelo SVM resultante classificou corretamente 100% dos isolados de E.

faecalis oriundos de laticínios, mas somente 56,10% dos de urina foram classificados

como tal. Como são advindos de uma mesma indústria, os isolados de alimentos constituíram uma classe amostral mais uniforme mesmo sendo resultantes de até 3 diferentes coletas, facilitando o reconhecimento de íons associados à classe “E”. Concernente aos isolados de urina, estes foram obtidos de diferentes indivíduos em um intervalo de até 2 meses, mostrando, assim, maior diversidade entre si. Possivelmente, tal fato ocasionou o resultado observado.

Utilizando a mesma análise mas outro software (ClinProTools), Griffin et al. (2012) discriminaram corretamente isolados de E. faecium vanB+ _{de isolados vanB-} detectados através de PCR. Inicialmente, os últimos foram classificados como não- VRE, descartando a existência de outros mecanismos de resistência. Como os autores não isolaram E. faecium vanA+_{, eles utilizaram controles com tal característica}

e, através de um modelo SVM, diferenciaram também culturas vanB+ _{de vanA}+_{. Para} tal, os autores avaliaram a faixa entre 6460 e 6830 Da e observaram íons mais associados a um ou a outro VRE, como o detectado a 6603 m/z, intimamente relacionado a E. faecium vanA+_{. Em virtude dos resultados obtidos, os autores} excedem a utilidade do método a outros VREs, como E. faecalis VanA ou VanB. Entretanto, outros autores relataram não observar constrastes utilizando a técnica entre culturas de E. faecium vanA+ _{e vanB}+ _{(FREITAS et al., 2017), limitando os} achados de Griffin et al. (2012) ao seu cenário laboratorial.

Wang et al. (2018) construíram um modelo SVM (software LIBSVM 3.20) com o intuito de detectar clones de Staphylococcus areus Resistentes à Meticilina (MRSA). Como treinamento, foram utilizados 125 MRSA molecularmente caracterizados como ST5, ST59, ST239 e ST45. Os últimos, como não são comumente causa de surtos, costumam intrincar o desfecho dos mesmos em virtude de serem menos estudados. O modelo resultante mostrou-se satisfatório, evidenciando, assim, a utilidade de tal análise multivariada em ambiente nosocomial, onde o volume de amostras é maior e a velocidade analítica é crucial em se tratando de culturas multirresistentes. Os autores afirmam a necessidade de se estandardizar a técnica (MALDI-typing) a fim de aumentar a sua robustez. Portanto, os seus resultados, mesmo favoráveis, não devem ser universalizados.

Realizou-se outra análise multivariada, o PLS-DA (Partial Least Squares

Discriminant Analysis), com o mesmo intuito de SVM. Observou-se uma leve divisão

entre as 2 classes “E” e “H”, referentes ao isolados de laticínios e urina, respectivamente. Concernente à causa de tal divisão, observou-se 29,40% dela relacionada à 2 variáveis. Ademais, nota-se uma maior coesão entre os isolados clínicos relativamente aos isolados de alimentos, mais afastados entre si. Os íons de maior relevância ao modelo PLS-DA são classificados de acordo com o score VIP (Variable Importance in Projection). Íons com valores de VIP maiores a 1 indicam viabilidade em diferenciar amostras em classes em virtude de estarem mais associados à uma ou à outra. Neste âmbito e em ordem de relevância, os íons encontrados a 4444, 4546, 6677, 4454 e 4588 m/z foram detectados em maior abundância relativa entre E. faecalis de alimentos e os observados a 4430 e 6230 m/z associaram-se mais aos isolados clínicos. Tanto o PLS-DA como os íons e seus

Figura 5. Gráficos dos scores PLS-DA de isolados de E. faecalis encontrados em laticínios (E) e em amostras clínicas de urina (H).

Figura 6. Íons relevantes ao modelo PLS-DA relacionados à divisão dos isolados de E.

Figura 7. Picos detectados em 2 isolados de E. faecalis de alimentos (E15 e E176) e em 2 isolados urina (H10 e H25). Removeu-se a faixa acima de 11 kDa devido à ausência de sinais. O íon marcado com uma estrela (± 4412 m/z) foi detectado em todas as amostras

analisadas.

Utilizando-se a Hierarchical Cluster Analysis (HCA), observou-se a divisão dos 60 isolados de E. faecalis (30 oriundos de laticínios e 30 de uroculturas) em 8 diferentes clusters. Destes, 2 (numerados como 1 e 2) localizam-se isolados e incluem somente enterococos de alimentos. Portanto, E. faecalis incluídos nos clusters 1 e 2 são indicativamente menos correlatos aos restantes. Observando o ramo à direita, nota-se um maior afastamento entre o cluster 3 e os outros 5. Exceto os isolados E18 e E191, o cluster 3 incluiu somente isolados de urina. Concernente aos clusters 4 e 5, alocados em um mesmo clado, nota-se a ocorrência mista de E. faecalis oriundos de ambas as fontes. O mesmo ocorre com os clusters 6, 7 e 8, mas caso o cutoff fosse reduzido, seriam observáveis clusters menores constituídos exclusivamente de enterococos encontrados ou em alimentos ou em urina.

Com o intuito de visualizar as características dos membros dos 8 clusters, como local de isolamento, ocorrência de fatores de virulência e resistência a antimicrobianos, construiu-se a Tabela 8. O ordenamento numérico dos clusters deu- se em ordem crescente (i.e. o cluster 8 localiza-se na extrema direita).

O Heatmap ilustra a ocorrência de íons e suas intensidades através de uma escala de cores. Como é observável, certos íons se associaram mais à uma classe ou a outra, mas nenhum mostrou-se exclusivo a somente uma delas. O Heatmap e a

Hiercarchical Cluster Analysis (HCA) são ilustrados na Figura 8.

Figura 8. Heatmap e Hierarchical Cluster Analysis referentes a E. faecalis isolados de laticínios (E) e amostras clínicas de urina (H). Os clusters foram considerados conforme à

Tabela 8. Características dos isolados de E. faecalis alocados em clusters, como fonte de isolamento, ocorrência de fatores de virulência e resistência a antimicrobianos.

Cluster 1

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

E22 Queijo Minas Frescal efaA+, ace+, esp+ Tet, Eri*

E15 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet

E261 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+, esp+ N/D

Cluster 2

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

E23 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, esp+ Rif*

E312 Leite Cru gelE+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri

E151 Leite Cru gelE+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri

E161 Leite Cru gelE+, cylAM+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri

E19 Queijo Minas Frescal efaA+, ace+, esp+ Tet, Eri*

E61 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+ Tet, Eri

E17 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Eri

E291 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Eri*

E257 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+, esp+ N/D

E84 Leite Cru gelE+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri

Cluster 3

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

H18 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri, Strep, Clo

E18 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Tet, Eri

H22 Urina efaA+, ace+, cylB+ Tet, Rif*

H20 Urina efaA+, ace+, esp+, agg+, cylB+ Eri, Nor, Clo

H19 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet, Eri, Strep, Gent

H2 Urina gelE+, efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Tet, Eri, Gent, Clo, Nor

H1 Urina efaA+, ace+, esp+, agg+, cylAB+ Tet, Eri, Nor

H12 Urina gelE+, efaA+, ace+ Eri*, Rif*

H15 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+, cylB+ Tet, Eri, Gent

E191 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri

H14 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, cylABM+ Tet

H23 Urina gelE+, efaA+, ace+, agg+ Tet, Eri, Nor, Rif

Cluster 4

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

H4 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri, Clo

H5 Urina gelE+, efaA+, ace+ Tet, Eri, Strep, Clor, Nor

E267 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+, cylABM+ Tet, Eri

E24 Queijo Minas Frescal efaA+, ace+ N/D

H25 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri, Nor*

Genes de virulência – gelE: Gelatinase; efaA: Antígeno A Endocardite-Específico; ace: Proteína de Ligação ao Colágeno; esp: Proteína de Superfície Enterocócica; agg: Substância Agregativa; cylABM: Citolisina. Antibióticos – Tet: Tetraciclina; Eri: Eritromicina; Strep: Estreptomicina; Gent: Gentamicina; Clo: Cloranfenicol; Nor: Norfloxacina; Rif: Rifampicina; *: Intermediária; N/D: Não Detectado.

Tabela 8. Continuação.

Cluster 5

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

H3 Urina gelE+, efaA+, ace+ Tet, Eri, Rif*

H32 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet, Eri

H7 Urina gelE+, efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Tet, Eri, Gent, Clo, Nor

E207 Leite Cru gelE+, ace+, esp+, agg+ Tet

H24 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Rif*

H13 Urina gelE+, efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Tet, Eri, Gent, Clo, Nor

H26 Urina efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Tet, Eri, Strep, Gent, Nor

H6 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet, Rif

E89 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet

E21 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet

H11 Urina efaA+, ace+, esp+, agg+, cylABM+ Tet, Eri, Rif*

Cluster 6

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

E20 Queijo Minas Frescal efaA+, ace+, esp+ Tet, Eri*

H28 Urina gelE+, efaA+, ace+ Eri*

H34 Urina gelE+, efaA+, ace+, agg+ Tet

E127 Leite Cru gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri

E302 Leite Cru gelE+, ace+, agg+ Eri*

Cluster 7

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

E13 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet

E11 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri

E51 Leite Cru gelE+, ace+, esp+, agg+ Tet

H17 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+, cylABM+ Tet, Eri

H10 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, cylABM+ Tet

H30 Urina gelE+, efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Tet, Eri*

H31 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+, cylABM+ Tet, Eri

Cluster 8

Isolado Fonte de Isolamento Genes de Virulência Resistência

E14 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, agg+, cylABM+ Eri

E176 Leite Cru gelE+, ace+, esp+, agg+ Tet

H16 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri, Nor

H27 Urina efaA+, ace+, esp+, agg+ Tet, Eri, Clo*, Nor

H35 Urina gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet, Eri, Clo

E12 Queijo Minas Frescal gelE+, efaA+, ace+, esp+ Tet

E271 Leite Cru gelE+, ace+, agg+ Tet

Genes de virulência – gelE: Gelatinase; efaA: Antígeno A Endocardite-Específico; ace: Proteína de Ligação ao Colágeno; esp: Proteína de Superfície Enterocócica; agg: Substância Agregativa; cylABM: Citolisina. Antibióticos – Tet: Tetraciclina; Eri: Eritromicina; Strep: Estreptomicina; Gent: Gentamicina; Clo: Cloranfenicol; Nor: Norfloxacina; Rif: Rifampicina; *: Intermediária; N/D: Não Detectado.

Relativamente às culturas de laticínios, não se observou a subdivisão de acordo com a sua fonte de isolamento (leite cru ou queijos Minas frescal), mesmo em clusters constituídos somente de isolados de alimentos (1 e 2). Ademais, a ocorrência de fatores de virulência mostrou-se variável entre os clusters e, assim, não revelou influência em tal divisão. Previsivelmente, como a análise em MALDI-TOF/MS deu-se entre 2 a 20 kDa, a técnica certamente não os detectou, caso existissem, em decorrência de serem costumeiramente de massa maior à faixa utilizada. Não houve, também, vínculo entre a resistência a antimicrobianos e a divisão dos clados. Em MALDI-TOF/MS detecta-se a falta de sensibilidade antimicrobiana através de íons alterados referentes ao fármaco inativado ou a moléculas microbianas modificadas (e.g. rRNA metilado) (SAVIC et al., 2009). Para tal, faz-se necessário analisar o fármaco, utilizar faixas de leitura menores, usar outras matrizes e/ou realizar análises adicionais (MONTEIRO et al., 2012; HRABÁK, CHUDÁČKOVÁ & WALKOVÁ, 2013).

Os resultados obtidos mostraram-se favoráveis ao uso de MALDI-TOF/MS com o intuito de discriminar, atrelado à quimiometria, isolados de E. faecalis oriundos de fontes de isolamento diferentes, como mostrado através dos modelos PLS-DA e HCA. Contudo, a fim de validar os resultados encontrados, é necessário utilizar outras técnicas envolvendo DNA, como PFGE e/ou MLST. Além disto, tal técnica não subdividiu as culturas de laticínios de acordo com a sua fonte de isolamento, isto é, leite cru ou mercadoria final, mesmo individualizando-as levemente das uroculturas. Concernente ao modelo SVM, observou-se um ótimo funcionamento em se tratando dos E. faecalis de alimentos, mas o mesmo não classificou satisfatoriamente as uroculturas como tal.

O uso de MALDI-TOF/MS associado à quimiometria com a finalidade de discriminar isolados microbianos oriundos de diferentes localidades ou mesmo MALDI-typing está em discussão, mesmo com autores assemelhando a técnica com outras mais utilizadas com tal intento, como o PFGE (GRIFFIN et al., 2012). Portanto, são necessários mais trabalhos a fim de se verificar a sua viabilidade em outros usos além do reconhecimento de bactérias, bolores e leveduras.

Freitas et al. (2017) discriminaram isolados de E. faecium oriundos de ambiente nosocomial de isolados relacionados à comunidade (indivíduos saudáveis e suínos). Foram utilizados 77 E. faecium caracterizados molecularmente através de MLST (Multilocus Sequence Typing) associado ao software BAPS (Bayesian Analysis of

realizaram PCA (Principal Component Analysis) e, com os mesmos scores, efetuaram a divisão em clusters através de HCA, resultando em 2 clusters maiores. Um, relacionado somente aos isolados nosocomiais, subdividiu-se em 2 clados; o outro mostrou-se mais associado aos isolados referentes à comunidade, mas observou-se nele a coincidência de 10 clones de E. faecium infectantes. Tal técnica mostrou uma clara divisão entre as 2 fontes de isolamento estudadas (ambiente nosocomial e comunidade), mas não evidenciou subdivisões relacionadas aos diferentes STs avaliados e nem discriminou entre os enterococos encontrados em indivíduos sadios de suínos. Os achados indicam a existência de biomarcadores microbianos detectáveis através de MALDI-TOF/MS relacionados à vida em diferentes ecossistemas.

Em outro estudo, Lasch et al. (2014) utilizaram tal técnica a fim de diferenciar 112 culturas de E. faecium oriundas de nosocômios (CC17) de outras relacionadas à comunidade, como as encontradas em animais de abate ou em sua carne. Todos os isolados foram caracterizados anteriormente através de MLST, resultando em 52 STs e em 8 diferentes CCs (Clonal Complexes). Com o uso de HCA, os autores observaram 3 clusters: Um, menor, constituído exclusivamente de E. faecium AK- AM32, outro (cluster 1) mais associado a isolados comensais de E. faecium e o restante (cluster 2), formado mormente de clones CC17. Tanto o cluster 1 como o 2 são mistos (e.g. o último é constituído de 105 isolados, sendo 17,10% deles referentes a E. faecium não-CC17) e não se observou subdivisões relacionados a outros CCs. O mesmo foi realizado com 59 isolados de Staphylococcus aureus e o resultado mostrou-se similar, com clusters mistos e não-subdivididos conforme seu CC. Portanto, os autores não aconselharam o uso de MALDI-typing em E. faecium/VRE e nem em S. aureus/MRSA.