MURILO MARIZ QUEIROZ
Enterococcus spp. EM LATICÍNIOS: OCORRÊNCIA DE GENES DE
VIRULÊNCIA E ESTUDO COMPARATIVO COM Enterococcus
faecalis ISOLADOS DE AMOSTRAS DE URINA
CAMPINAS 2019
Enterococcus spp. EM LATICÍNIOS: OCORRÊNCIA DE GENES DE
VIRULÊNCIA E ESTUDO COMPARATIVO COM Enterococcus
faecalis ISOLADOS DE AMOSTRAS DE URINA
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profª. Drª. Dirce Yorika Kabuki.
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno Murilo Mariz Queiroz e orientada pela Profª. Drª. Dirce Yorika Kabuki.
CAMPINAS 2019
Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Queiroz, Murilo Mariz,
1994-Q32e QueEnterococcus spp. em laticínios : ocorrência de genes de virulência e
estudo comparativo com Enterococcus faecalis isolados de amostras de urina / Murilo Mariz Queiroz. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
QueOrientador: Dirce Yorika Kabuki.
QueDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Que1. Queijo minas frescal. 2. Virulência. 3. Segurança de Alimentos. 4. Resistência a antimicrobianos. 5. Espectrometria de massas. I. Kabuki, Dirce Yorika. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Enterococcus spp. in dairy : occurrence of virulence genes and
comparative study with Enterococcus faecalis isolated from urine samples
Palavras-chave em inglês:
Minas fresh cheese Virulence
Food Safety
Antimicrobial resistance Mass spectrometry
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Mestre em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Dirce Yorika Kabuki [Orientador] Liliana de Oliveira Rocha
Vera Lúcia Mores Rall
Data de defesa: 10-07-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-7977-7266 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/1918951422146647
____________________________________________________________ Profª. Drª. Dirce Yorika Kabuki
Faculdade de Engenharia de Alimentos – FEA/UNICAMP Orientadora.
____________________________________________________________ Profª. Drª. Liliana de Oliveira Rocha
Faculdade de Engenharia de Alimentos – FEA/UNICAMP Membro Titular
____________________________________________________________ Profª. Drª. Vera Lúcia Mores Rall
Instituto de Biociências – IBB/UNESP Membro Titular
A Ata da Defesa, assinada pelos membros da comissão examinadora, encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação e Tese e também na Secretaria de Pós-Graduação da Faculdade de Engenharia de Alimentos/FEA.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro (Processo Nº 134607/2016-3);
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) por viabilizar a execução deste mestrado;
À minha orientadora, Profª. Drª. Dirce Yorika Kabuki, pela instrução e confiança depositada em mim;
Ao Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin e aos seus orientados, Fernanda Negrão e Fábio Neves, por colaborarem com a realização deste projeto e me iniciarem na Espectrometria de Massas;
Ao Prof. Dr. Carlos Emílio Levy e à Profª. Drª. Sueli Fumie Yamada Ogatta pela doação de culturas enterocócicas;
À Profª. Drª. Liliana de Oliveira Rocha, pelos ensinamentos e auxílio com a interpretação de dados;
À técnica Juliana Carusi, pela paciência e todo o suporte prestado ao decorrer destes anos;
Aos membros da banca examinadora pela disponibilidade em dividir seus conhecimentos a fim de melhorar esta dissertação;
Aos meus colegas de laboratório pelos momentos de descontração, carinho e amizade;
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho e tornaram estes anos melhores e mais leves, os meus sinceros agradecimentos.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
ocorrência em alimentos tornou-se controversa. Estes enterococos, mormente E. faecalis e
E. faecium, detêm fatores de virulência e resistência a antimicrobianos eventualmente
transmissíveis entre si ou a outras bactérias através de Elementos Genéticos Móveis (EGM). Portanto, objetivou-se descrever a ocorrência de fatores de virulência em E. faecalis, E.
faecium e em Enterococcus spp. de amostras de ambiente e alimentos oriundas de uma
indústria de laticínios. Ademais, buscou-se correlacionar isolados selecionados de E. faecalis encontrados em alimentos com isolados de amostras clínicas de urina, utilizando como critérios, além dos fatores de virulência, a resistência a antimicrobianos e análises multivariadas (SVM, PLS-DA, Heatmap e HCA) com dados obtidos em MALDI-TOF/MS. Genes de virulência e resistência à vancomicina foram detectados através de PCR e, a fim de determinar a sensibilidade antimicrobiana, utilizou-se o método de Disco-Difusão. Entre os 155 isolados de enterococos oriundos de indústria (ambiente e alimentos), somente em 22 (14,19%) verificou-se a ausência dos 10 fatores de virulência avaliados. Genes de virulência foram abundantemente detectados entre os isolados, mormente em E. faecalis. Concernente ao estudo correlativo, constatou-se a mesma incidência a nível estatístico dos fatores de virulência em ambas as fontes de isolamento de E. faecalis (laticínios e urina), com ressalvas a efaA e cylB, mais associados aos últimos. Portanto, como os isolados de alimentos mostraram ocorrência de fatores de virulência similar, evidencia-se a iminência de se tornarem infectantes em cenário favorável. E. faecalis oriundos de laticínios revelaram maior sensibilidade aos antimicrobianos avaliados; contudo, 70% foram resistentes à tetraciclina e 40%, à eritromicina. Ademais, observou-se multirresistência somente entre os isolados de urina. Concernente às análises multivariadas realizadas com dados obtidos em MALDI-TOF/MS, o modelo PLS-DA mostrou uma leve divisão entre isolados de E. faecalis de acordo com a sua fonte de isolamento, mas não mostrou subdivisões, isto é, os isolados de leite cru não foram individualizados dos obtidos de queijos Minas frescal. O mesmo foi observado em HCA, onde entre os 8 clusters formados, 2 constituíram-se exclusivamente de isolados de alimentos. Relativamente ao Heatmap, não se constatou a ocorrência de íons associados exclusivamente a uma das classes “E” (laticínios) ou “H” (urina). O modelo SVM classificou corretamente 100% dos isolados de E. faecalis de laticínios, mas somente 56,10% das uroculturas foram identificadas como tal.
Palavras-chave: Queijo Minas Frescal, Segurança de Alimentos, Potencial Patogênico, Perfilamento Molecular, Resistência Antimicrobiana, MALDI-TOF/MS.
occurrence in food has become controversial. These enterococci, especially E. faecalis and E.
faecium, may exhibit virulence factors and antimicrobial resistance that may be exchanged
between them or to other bacteria through Mobile Genetic Elements (EGM). Therefore, the aim of this study was to describe the occurrence of virulence genes in E. faecalis, E. faecium and Enterococcus spp. isolated from environmental and food samples of a dairy plant. In addition, we correlated selected E. faecalis isolates from food and urine using as criteria the occurrence of virulence, antimicrobial resistance and chemometric analysis using MALDI-TOF/MS data (SVM, PLS-DA, Heatmap e HCA). The virulence genes and resistance to vancomycin were detected by PCR and the Disk-Diffusion assay was carried out to determine the antimicrobial susceptibility. Among the 155 enterococci isolated from industry (environment and food), only 22 (14.19%) isolates were free from all of the 10 virulence genes searched. There was a high occurence of virulence genes among the isolates, mainly in E. faecalis. As for the comparative study, there was no statistical difference between the occurence of virulence genes and the source of isolation of E. faecalis (dairy or urine), with exceptions to
efaA and cylB, more associated to the latter. Therefore, the food isolates showed a similar
occurrence of virulence genes, evidencing their pathogenic potential. E. faecalis isolated from dairy were more susceptible to the antimicrobials evaluated than the clinical ones; however, 70% showed resistance to tetracycline and 40% to erythromycin. In addition, antibiotic multiresistance was only observed among the urine isolates. Concerning the multivariate analysis performed with data obtained in MALDI-TOF/MS, the PLS-DA model showed a slight discrimination between E. faecalis isolates according to their source of isolation, but it did not show any subdivisions, i.e. raw milk isolates were not individualized from those found in Minas fresh cheese. The same was observed in HCA, where among the 8 clusters generated, 2 were formed exclusively by food isolates. Regarding the Heatmap, the occurrence of ions associated exclusively to one of the "E" (dairy) or "H" (urine) classes was not observed. The SVM model correctly classified 100% of dairy E. faecalis, but only 56.10% of the urocultures were identified as such.
Keywords: Minas Fresh Cheese, Food Safety, Pathogenic Potential, Molecular Profiling, Antimicrobial Resistance, MALDI-TOF/MS.
Figura 1. Foto de eletroforese em gel de agarose 1,5% mostrando os amplicons gerados em cada PCR. M: Marcador de massa molecular 1 kb plus (TianGen Biotech, China); 1 e 2: Enterococcus faecalis ATCC 29212; 3: E. faecalis 54USP; 4: E. faecalis 37UEL; 5 e 6: E. faecalis ATCC 29212; 7: E. faecalis 5UEL; 8: E. faecalis ATCC 51299 ... 35 Figura 2. Ocorrência (%) de fatores de virulência em E. faecalis, E. faecium e outros
Enterococcus spp. encontrados em indústria de Queijo Minas Frescal. ... 38
Figura 3. Ocorrência (%) de genes de virulência e resistência à vancomicina em isolados de E. faecalis encontrados em alimentos e material clínico de urina. ... 44 Figura 4. Percentual de resistência antimicrobiana em E. faecalis isolados de alimentos e urina. I: Resistência intermediária; R: Resistência; Gent: Gentamicina; Strep: Estreptomicina; Rif: Rifampicina; Clo: Cloranfenicol; Eri: Eritromicina; Nor: Norfloxacina; Tet: Tetraciclina. ... 46 Figura 5. Gráficos dos scores PLS-DA de isolados de E. faecalis encontrados em laticínios (E) e em amostras clínicas de urina (H). ... 53 Figura 6. Íons relevantes ao modelo PLS-DA relacionados à divisão dos isolados de
E. faecalis em 2 classes: “E” (laticínios) e “H” (urina). ... 53
Figura 7. Picos detectados em 2 isolados de E. faecalis de alimentos (E15 e E176) e em 2 isolados urina (H10 e H25). Removeu-se a faixa acima de 11 kDa devido à ausência de sinais. O íon marcado com uma estrela (± 4412 m/z) foi detectado em todas as amostras analisadas. ... 54 Figura 8. Heatmap e Hierarchical Cluster Analysis referentes a E. faecalis isolados de laticínios (E) e amostras clínicas de urina (H). Os clusters foram considerados conforme à estrutura localizada à esquerda... 55
Tabela 1. Características dos primers utilizados para a identificação de espécies, detecção de fatores virulência e resistência à vancomicina em Enterococcus spp. .. 30 Tabela 2. Antimicrobianos testados em E. faecalis isolados de laticínios e uroculturas e os devidos valores dos diâmetros dos halos de inibição. ... 32 Tabela 3. Culturas de E. faecalis utilizadas como treinamento e teste de SVM. ... 34 Tabela 4. Perfis de fatores de virulência e fonte de isolamento de E. faecalis, E.
faecium e Enterococcus spp. encontrados em indústria de Queijos Minas Frescal. . 36
Tabela 5. Genes associados a fatores de virulência encontrados em E. faecalis isolados de amostras clínicas de urina e de alimentos. ... 43 Tabela 6. Teste χ² de Homogeneidade a fim de associar a fonte de isolamento (laticínios ou urina) com a ocorrência de fatores de virulência em Enterococcus
faecalis (α = 0,05). ... 44
Tabela 7. Perfis de resistência a antimicrobianos e fonte de isolamento de E. faecalis oriundos de urina e laticínios. Para tal, desconsiderou-se a resistência intermediária. ... 47 Tabela 8. Características dos isolados de E. faecalis alocados em clusters, como fonte de isolamento, ocorrência de fatores de virulência e resistência a antimicrobianos. 56
4-HCCA: Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico. Ace: Proteína de Ligação ao Colágeno. ACN: Acetonitrila.
Agg: Substância agregativa.
AMEs: Aminoglycoside Modifying Enzymes. BAPS: Bayesian Analysis of Population Structure. BHI: Brain Heart Infusion.
CC: Complexo Clonal. Cyl: Citolisina.
Da: Dalton.
DNA: Ácido desoxirribonucleico.
dNTPs: Desoxirribonucleotídeos fosfatados. ECM: Matriz extracelular.
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético. EfaA: Antígeno A Endocardite-Específico. EGM: Elementos genéticos móveis.
Esp: Proteína de Superfície Enterocócica. FA: Ácido fórmico.
fsr: E. faecalis System Regulator.
GBAP: Gelatinase Biosynthesis Activating Pheromone. GelE: Gelatinase.
HCA: Hierarchical Cluster Analysis. HCl: Ácido clorídrico.
Hyl: Hialuronidase. KCl: Cloreto de potássio. LAB: Bactérias ácido-láticas.
LPSN: List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature. LPxTG: Leucina-Prolina-x-Treolina-Glicina.
m/z: Razão massa/carga.
MALDI-TOF/MS: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight Mass
Spectrometry.
MRSA: Staphylococcus resistentes à meticilina.
MSCRAMMs: Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules. NaCl: Cloreto de sódio.
NSLAB: Bactérias ácido-láticas não-starters. PCA: Principal Component Analysis.
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase. pH: Potencial hidrogeniônico.
PLS-DA: Partial Least Squares Discriminant Analysis. rDNA: DNA ribossômico.
rRNA: RNA ribossômico. STs: Sequence Types.
SVM: Support Vector Machine. TBE: Tris/Borato/EDTA.
TE: Tris-EDTA.
TGI: Trato gastrointestinal.
TTC: Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio. UFC: Unidade Formadora de Colônia. VIP: Variable Importance in Projection.
VMRSA: Staphylococcus resistentes à vancomicina e à meticilina. VRE: Enterococos resistentes à vancomicina.
1. Introdução ... 13 2. Objetivos ... 15 2.1 Objetivo Geral ... 15 2.2 Objetivos Específicos ... 15 3. Revisão Bibliográfica ... 16 3.1 Histórico ... 16
3.2 Características e Habitat Primário ... 16
3.3 Enterococcus spp. em Produtos Lácteos ... 17
3.4 Virulência e Patogênese de E. faecalis e E. faecium ... 19
3.5 Resistência a Antimicrobianos ... 23
3.6 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight MS ... 24
4. Material e Métodos ... 28
4.1 Culturas Bacterianas ... 28
4.2 Ativação de Culturas Congeladas ... 28
4.3 Pesquisa de Genes de Virulência ... 29
4.3.1 Extração de DNA ... 29
4.3.2 PCR Convencional ... 29
4.3.3 PCR Duplex ... 29
4.4 Teste de Sensibilidade a Antimicrobiano ... 31
4.5 Teste χ² de Homogeneidade ... 32
4.6 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight MS ... 32
4.6.1 Extração de Proteínas ... 33
4.6.2 Obtenção de Espectros ... 33
4.6.4 Processamento de Dados ... 33
5. Resultados & Discussão... 35
5.1 Perfil de Genes de Virulência em Enterococcus spp. Isolados de Laticínios ... 35
5.2 Estudo Comparativo entre Isolados de Laticínios e Urocultura ... 42
5.2.1 Genes de Virulência ... 43
5.2.2 Perfil de Sensibilidade a Antimicrobianos ... 46
5.2.3 Análises Multivariadas (MALDI-TOF/MS) ... 51
6. Conclusões ... 60
Referências ... 61
1. Introdução
Enterococcus spp. sobrevivem e/ou crescem em circunstâncias adversas,
como alta salinidade, sais biliares e pH entre 4,0 e 9,6. São mesófilos, mas crescem entre 10 a 45ºC e sobrevivem até 30 minutos a 62,8ºC, mostrando-se resistentes à pasteurização (GIRAFFA, 2003). São comumente encontrados em alimentos oriundos de animais, como o leite cru ou leite termicamente tratado, mantendo-se ocasionalmente em indústrias de laticínios em virtude de formarem biofilmes (GIRAFFA, 2002; GELSOMINO et al., 2002).
Em alimentos fermentados, mormente os lácteos, Enterococcus spp. atuam como bactérias ácido-láticas não-starters (NSLAB), isto é, não são adicionadas intencionalmente. Neles, exercem atividade acidificante, lisam macromoléculas e metabolizam citrato, acelerando a maturação (GIRAFFA, 2003). Ademais, podem sintetizar bacteriocinas com atividade inibitória contra outras bactérias, como Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus e Salmonella spp. (GIRAFFA, 2003; FRANZ
et al., 2007; DAL BELLO et al., 2010; PERUMAL & VENKATESAN, 2017). Certas culturas enterocócicas são também administradas como probióticos com diferentes finalidades em indivíduos e animais de abate (FRANZ et al., 2007).
Entretanto, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium ascenderam como causadores de moléstias nosocomiais, incitando a discussão acerca de sua inocuidade em alimentos. O isolamento de enterococos em diferentes matrizes alimentares está comumente associado à ocorrência de fatores de virulência e resistência a antimicrobianos (GOMES et al., 2008; PESAVENTO et al., 2014; CASTRO et al., 2017; ISPIRLI, DEMIRBAS & DERTLI, 2017). Tanto um como o outro são suscetíveis de serem transmitidos através de Elementos Genéticos Móveis (EGM) (SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012; HUDDLESTON, 2014).
Como são veiculados através de alimentos, Enterococcus spp. com mecanismos de adesão (Ace, AS, EfaA e Esp), como E. faecalis e E. faecium, ao sobreviverem ao trato gastrointestinal (TGI), eventualmente se aderirão às mucosas intestinais e as colonizarão. Genes associados a EGM codificando virulência ou resistência antimicrobiana eventualmente serão trocados lateralmente entre as células enterocócicas em tal ambiente (HUDDLESTON, 2014). Somado à resistência assimilada, Enterococcus spp. são intrinsicamente resistentes a diversas classes de antimicrobianos (e.g. penicilinas semissintéticas, monobactâmicos, polimixinas,
baixas doses de gentamicina, etc) (WERNER et al., 2012; HOLLENBECK & RICE, 2012). Um indivíduo, ao entrar em contato com um fármaco antimicrobiano, seleciona indiretamente Enterocococcus spp. resistentes ao mesmo, concedendo a eles um cenário favorável ao seu crescimento em número (RICE et al., 2004; HOLLENBECK & RICE, 2012). Caso os enterococos mostrem outros fatores de virulência, como invasinas, torna-se viável o estabelecimento de uma infecção enterocócica (ARIAS & MURRAY, 2012). Portanto, a análise de fatores de virulência relacionados à adesão ou à invasão mostra-se necessária mesmo em bactérias isoladas de alimentos.
Quando a moléstia enterocócica (i.e. bacteremias, endocardite e outras) se estabelece, a bactéria causadora é comumente caracterizada através de métodos convencionais de rotina baseados em sucessivos cultivos. Isto, entretanto, retarda o melhor tratamento antimicrobiano, levando eventualmente os indivíduos infectados a óbito (GAIESKI et al., 2010; DINGLE & BUTLER-WU, 2013). Entretanto, métodos como MALDI-TOF/MS mostraram-se alternativas viáveis às técnicas de identificação convencionais de bactérias, bolores e leveduras em decorrência de serem confiáveis, baratos (custo/amostra), velozes e de fácil uso (ANGELETTI, 2017).
Atualmente, MALDI-TOF/MS também é utilizado com outros intuitos, como o de verificar a sensibilidade a certos fármacos antimicrobianos ou discriminar, através de quimiometria, isolados microbianos (MALDI-typing) (GRIFFIN et al., 2012; CHONG et al., 2015; FREITAS et al., 2017). Contudo, como são finalidades recentes, os estudos se mostram controversos em virtude de eventuais não-concordâncias entre os dados obtidos em MALDI-TOF/MS com os resultados de um método de referência utilizado (LASCH et al., 2014; SARACLI et al., 2015). Os estudos envolvendo
Enterococcus spp. são, também, escassos, sobretudo os relacionados a E. faecalis.
Sinteticamente, o atual estudo descreveu a ocorrência de fatores de virulência em E. faecalis, E. faecium e Enterococcus spp. isolados de amostras de ambiente, leite cru e queijos Minas frescal de uma indústria de laticínios. Com o intento de correlacionar isolados de E. faecalis encontrados em amostras clínicas de urina e alimentos, a fim de determinar a iminência dos últimos em se tornarem infectantes, utilizou-se como critérios, além da ocorrência de fatores de virulência, a sensibilidade a antimicrobianos e análises multivariadas com dados obtidos em MALDI-TOF/MS.
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Descrever a ocorrência de genes de virulência e resistência à vancomicina em
Enterococcus spp., E. faecalis e E. faecium isolados de amostras de ambiente e
alimentos oriundas de uma indústria de laticínios. Correlacionar culturas selecionadas de E. faecalis encontrados em alimentos com culturas de amostras clínicas de urina, utilizando como critérios, além da ocorrência de genes de virulência, a resistência a antimicrobianos e análises multivariadas com dados obtidos em MALDI-TOF/MS.
2.2 Objetivos Específicos
Verificar a ocorrência de genes de virulência (agg, ace, efaA, esp, cylA, cylB,
cylM e gelE) e também de resistência à vancomicina (vanA e vanB) em Enterococcus
spp. isolados de um laticínio e em E. faecalis oriundos de material clínico de urina. Verificar a sensibilidade in vitro de 60 culturas de E. faecalis (30 selecionadas de alimentos e 30 de uroculturas) aos antimicrobianos ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, norfloxacina, rifampicina, tetraciclina, teicoplanina e vancomicina, correlacionando a resistência observada entre os isolados com a fonte de isolamento.
Obter os espectros de massa das 60 culturas de E. faecalis comentadas anteriormente através de MALDI-TOF/MS e correlaciona-los através de quimiometria, utilizando as análises multivariadas Support Vector Machine (SVM), Partial Least
Squares Discriminant Analysis (PLS-DA), Hierarchical Cluster Analysis (HCA) e Heatmap.
3. Revisão Bibliográfica
3.1 Histórico
Thiercelin & Jouhaud (1899) cunharam o termo “enterococcus” ao descreverem uma bactéria de ocorrência intestinal suscetível a tornar-se infectante. Em 1906, Andrewes & Horder encontraram bactérias em um indivíduo com endocardite e as classificaram como Streptococcus faecalis em decorrência destas formarem cadeias curtas e se assemelharem a bactérias intestinais, levando erroneamente a inclusão de enterococos como membros do gênero Streptococcus. Em 1919, Orla-Jensen relatou a existência de uma nova bactéria, Streptococcus faecium, diferenciando-se de S. faecalis em virtude de fermentar a arabinose (apud LEBRETON, WILLEMS & GILMORE, 2014; ZHONG et al., 2017).
Posteriormente, Lancefield (1933) desenvolveu um sistema sorológico de caracterização de Streptococcus e observou a ocorrência do antígeno D em bactérias intestinais. Em 1937, Sherman recomendou a subdivisão de Streptococcus em 4 diferentes classes: “Pyogenic”, “Viridans”, “Lactic” e “Enterococcus”. Tanto S. faecalis como S. durans constituíram a última classe, mas não S. faecium, em virtude de Sherman não o considerar diferente de S. faecalis (apud LEBRETON, WILLEMS & GILMORE, 2014; ZHONG et al., 2017).
Em 1970, Kalina assinalou a necessidade de se transferir a classe “Enterococcus” a um novo táxon e, inicialmente, a ideia não foi formalmente aceita. Entretanto, Schleifer & Kilpper-Bälz (1984) evidenciaram o distanciamento de S.
faecalis e S. faecium de outros Streptococcus utilizando hibridização DNA-DNA,
corroborando com Kalina (1970). Sucessivamente, outras bactérias foram reclassificadas como Enterococcus, como E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E.
gallinarum e E. malodoratus (apud LEBRETON, WILLEMS & GILMORE, 2014;
ZHONG et al., 2017).
Até o momento, 58 espécies compõem o gênero Enterococcus e, entre elas, E.
faecalis e E. faecium mostram-se as mais recorrentes tanto em alimentos como em
amostras clínicas (LPSN, acesso em 2019).
3.2 Características e Habitat Primário
Enterococcus são cocos Gram (+) encontrados aos pares ou em cadeias
(6,5%), sais biliares (40%) e em pH entre 4,0 e 9,6 (DEVRIESE et al., 1993; GIRAFFA, 2003; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2009a). Enterococcus são mesófilos; contudo, crescem entre 10 a 45ºC e sobrevivem até 30 minutos a 62,8ºC, mostrando-se, assim, resistentes à pasteurização (GIRAFFA, 2003). Como Streptococcus, não detêm enzimas citrocromáticas e, assim, mostram-se como catalase (-) e oxidase (-). Pertencem às bactérias ácido-láticas (LAB) e sintetizam L-ácido lático através de homofermentação (FOULQUIÉ MORENO et al., 2006).
Enterococcus spp. são comensais de ocorrência intestinal em indivíduos e
animais sadios e, através das fezes, colonizaram numerosos nichos em decorrência de resistirem e/ou crescerem em circunstâncias desfavoráveis, como evidenciado acima (HAMMERUM, 2012; CHAJĘCKA-WIERZCHOWSKA, ZADERNOWSKA & ŁANIEWSKA-TROKENHEIM, 2017). Portanto, são bactérias ubíquas e sua ocorrência em alimentos não indica necessariamente a contaminação fecal, limitando o uso de enterococos como indicadores (FRANCO & LANDGRAF, 2008).
3.3 Enterococcus spp. em Produtos Lácteos
Enterococcus spp. são comumente encontrados em alimentos oriundos de
animais e, entre eles, o leite e seus derivados (GIRAFFA, 2002). Termotolerantes,
Enterococcus spp. crescem em leite termicamente tratado e em refrigeração
(GIRAFFA, 2003). Persistem em instrumentos de ordenha e em reservatórios de leite, contaminando a linha de produção em decorrência de sobreviverem a sanitizantes. Provavelmente, tal característica está associada com a formação de biofilmes (GELSOMINO et al., 2002).
Contudo, Enterococcus spp. exercem efeitos benéficos em alimentos fermentados, sobretudo os laticínios, onde ocorrem naturalmente como bactérias ácido-láticas não-starters (NSLAB), isto é, não são adicionadas intencionalmente ao alimento. Em variedades de lácteos oriundos de leite cru ou submetido à pasteurização, exercem atividade acidificante, lisam macromoléculas e metabolizam citrato em elementos de aroma e sabor, acelerando, assim, a maturação (GIRAFFA, 2003; FOULQUIÉ MORENO, 2006). Ademais, certos Enterococcus spp. podem sintetizar bacteriocinas, peptídeos formados no metabolismo primário com atividade contra outras bactérias, como Listeria monocytogenes, Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus, Clostridium spp. e Vibrio cholera (GIRAFFA, 2003; FRANZ et al, 2007; DAL BELLO et al., 2010; PERUMAL & VENKATESAN, 2017). Como não são
comumente acrescidos em alimentos, com ressalva à nisina de Lactococcus lactis, as enterocinas são somente sintetizadas in situ. Mesmo sendo um lantibiótico (bacteriocina de classe II), a citolisina é um notório fator de virulência de Enterococcus spp. em virtude de ter atividade lítica em células eucarióticas, evidenciando o caráter dual de tal enterocina (FRANZ et al., 2007).
Certas culturas enterocócicas são administradas como probióticos para o tratamento de diarreias, associadas ou não ao uso de antimicrobianos, síndrome do intestino irritável, controle de colesterol sérico e estímulo do sistema imune. Em animais de abate, são administrados com diferentes finalidades, sobretudo com o intuito de dificultar o estabelecimento de diarreias (FRANZ et al., 2011). Ademais, a
European Food Safety Authority e a Association of American Feed Control Officials
autorizam o uso de enterococos com tais intentos (EFSA, 2017; AAFCO, 2018). Todavia, Enterococcus spp. ascenderam como notórios causadores de moléstias nosocomiais, incentivando a discussão acerca de sua inocuidade em alimentos. Ademais, o uso indiscriminado de antimicrobianos em ambiente rural, com intuito medicinal ou acrescido à dieta animal como fomentador de crescimento, acarretou a ocorrência de Enterococcus spp. carreadores de resistência aos antimicrobianos de relevância clínica em variadas matrizes alimentares e indivíduos sadios (HAMMERUM, LESTER & HEUER, 2012; TOP & WILLEMS, 2012). Neste âmbito, observou-se a ascensão em 1980 de enterococos resistentes à vancomicina (VRE). Tal advento é associado à resistência cruzada entre a vancomicina e avoparcina, um fármaco de uso veterinário administrado em suinoculturas e aviculturas em doses inferiores ao recomendado (WEGENER et al., 1999).
Veiculados através de alimentos, Enterococcus spp. com mecanismos ocasionadores de adesão, caso sobrevivam ao trato gastrointestinal (TGI), aderirão-se às musocas intestinais e as colonizarão. Poderão, em tal ambiente, transmitir EGM codificando virulência ou resistência antimicrobiana a outros Enterococcus spp. ou a bactérias correlatas (HUDDLESTON, 2014). O indivíduo colonizado, ao fazer uso de fármacos antimicrobianos, seleciona indiretamente Enterococcus spp. resistentes ao mesmo, favorecendo seu crescimento em número (RICE et al., 2004; HOLLENBECK & RICE, 2012). Caso as bactérias expressem outros fatores de virulência, como invasinas, estabelece-se a infecção enterocócica (ARIAS & MURRAY, 2012).
Enterococcus spp. resistentes a antimicrobianos e carreadores de fatores de
de E. faecalis e E. faecium. Em laticínios, foram encontrados em mozzarella e queijos frescos vendidos em comércio (PESAVENTO et al., 2014), em linha de produção de ricota (FERNANDES et al., 2015), em queijos de leite cru karish (HAMMAD, HASSAN & SHIMAMOTO, 2015), em queijos Minas frescal (CASTRO et al., 2017) e em queijos brancos turcos (ISPIRLI, DEMIRBAS & DERTLI, 2017).
3.4 Virulência e Patogênese de E. faecalis e E. faecium
Os enterococos, sobretudo E. faecalis e E. faecium, são bactérias oportunistas causadoras de moléstias nosocomiais (SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012). Clinicamente, infectam o trato urinário, feridas, cavidades abdominais e, raramente, o sistema nervoso central. Também causam bacteremias oriundas do TGI e trato urinário, além de constituírem uma das maiores causas de endocardite infectiva (HILL et al., 2007; O’DRISCOLL & CRANK, 2015).
Em decorrência de resistirem a sanitizantes e a numerosas classes de antimicrobianos, intrínseca ou extrinsecamente, os Enterococcus spp. mantêm-se em ambientes de assistência à saúde, contaminando os indivíduos internados através dos funcionários. Tornaram-se, então, alarmantes em tal esfera em virtude de não serem facilmente eliminados (BRADLEY & FRAISE, 1996; ZIRAKZADEH & PATEL, 2006). Ademais, o genoma de Enterococcus spp. é plástico (até 25% é constituído de DNA exógeno) favorecendo a eventual transferência de EGM a outros Enterococcus spp. ou, ainda, a outras bactérias Gram (+) em ambiente favorável, como é o caso de alimentos, biofilmes e TGI baixo (FRANZ et al., 1999; PAULSEN et al., 2003; HUDDLESTON, 2014; HAUBERT et al., 2018).
Bactérias comensais, autóctones ou não, modulam a imunidade dos indivíduos (HOOPER & GORDON, 2001). Quando em tratamento antimicrobiano, a microbiota altera-se substancialmente, ocasionando a colonização e crescimento de outras bactérias resistentes, como VREs (DONSKEY et al., 2000; UBEDA et al., 2010). Associa-se a este fenômeno ao decréscimo de bactérias Gram (-), responsáveis por estimular a síntese de lectinas (REGIIIγ) em células de Paneth. Tal substância mostra atividade antimicrobiana contra bactérias Gram (+), incluindo VREs (BRANDL et al., 2008). O aumento em número de VRE em ambiente intestinal está associado ao início de uma invasão enterocócica (UBEDA et al., 2010).
Para o estabelecimento de uma moléstia, é necessário obedecer a uma sucessão de eventos, como adesão das bactérias aos tecidos, lesão dos mesmos,
invasão e evasão do sistema imune. Geneticamente codificados, os fatores de virulência microbianos viabilizadores destes eventos necessitam de um indivíduo suscetível a fim de infectá-lo, com idade e circunstância de saúde favoráveis, falta de asseio, malnutrido, com stress físico ou emocional e ocasionalmente associado a um tratamento com antimicrobianos (JOHNSON, 1994; MIMS, NASH & STEPHEN, 2001). Proteínas de adesão viabilizam aos Enterococcus spp. se aderirem às células das mucosas e mesmo com a matriz extracelular (ECM). Com a inexistência das adesinas, estes enterococos eliminar-se-iam naturalmente através do fluxo de conteúdo luminal decorrente da motilidade intestinal (JETT et al., 1994). Proteínas como as adesinas são comumente constituídas de LPxTG (Leu-Pro-X-Thr-Gly) na localização C-terminal e recebem o nome de MSCRAMMs (Microbial Surface
Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) em virtude de se associarem a
elementos da ECM (MANDLIK et al., 2008). Em Enterococcus spp., são relevantes a Substância Agregativa (Agg), Proteínas de Superfície Enterocócica (Esp/Espfm), Proteína de Ligação ao Colágeno (Ace/Acm) e Antígeno A Endocardite-Específico (EfaAfs/EfaAfm).
Genes como agg são induzidos através de certos feromônios, como caD1, e resultam em uma adesina com estrutura filamentar relacionada com a agregação de células enterocócicas, facilitando a troca de EGM entre elas ao ocasionarem um contato íntimo (SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012). Também está relacionada com a evasão do sistema imune, adesão à ECM, endotélio e a mucosas, além de estar indicativamente associada à formação de biofilmes (SOARES et al., 2014; CHAJĘCKA-WIERZCHOWSKA, ZADERNOWSKA & ŁANIEWSKA-TROKENHEIM, 2017).
O codificante de Esp foi somente detectado em Ilhas de Patogenicidade (PAI), unidades de virulência comumente inseridas de forma lateral aos cromossomo, i.e. oriundas de EGM (SHANKAR, BAGHDAYAN & GILMORE, 2002). Putativamente, tal adesina auxilia a formação de biofilmes em Enterococcus spp.; contudo, demonstrou-se a formação destes em ausência de esp, insinuando a necessidade de outros fatores ambientais e/ou genéticos (TOLEDO-ARANA et al., 2001; KRISTICH et al., 2004; HEIKENS, BONTEN & WILLEMS, 2007). Estruturalmente, o domínio C-terminal de Esp contém variante de LPxTG, o domínio N-terminal interrelaciona-se com as células eucarióticas e o seu sítio central está associado com evasão de imunidade (TOLEDO-ARANA et al., 2001). Mostra-se similar à proteína Bap de Staphylococcus aureus, R28
de Streptococcus pyogenes, Rib e proteínas α-C de Streptococcus agalactiae (SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012). Em E. faecium, Espfm é a adesina correlata, com 90% de similaridade e, em decorrência disto, assume-se o mesmo desempenho
in vivo da adesina encontrada em E. faecalis (HEIKENS, BONTEN & WILLEMS, 2007;
SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012).
Ace ocasiona a adesão de E. faecalis a elementos de ECM, como colágeno I, IV e laminina (NALLAPAREDDY et al., 2000). Pertence à família das MSCRAMMs e é induzida em crescimento com sal biliar, urina, soro, elementos da ECM e também em cultivo a 46ºC (XIAO et al., 1998; SHEPARD & GILMORE, 2002; LEBRETON et al., 2009). Em E. faecium, é encontrada a adesina Acm, similar a Ace de E. faecalis, com aderência somente aos colágenos I e IV, mas mais ao I. (NALLAPAREDDY et al., 2000). Tal fator de virulência está relacionado às fases iniciais de adesão de uma infecção enterocócica e, assim, é de relevância estudá-lo (LEBRETON et al., 2009).
Lowe, Lambert & Smith (1995) identificaram em E. faecalis isolados de soro de indivíduos com endocardite uma adesina, nomeando-a EfaA. Os autores verificaram a similaridade estrutural de EfaA a adesinas de Streptococcus, como FimA de S.
parasanguis, ScaA de S. gorgonii, PsaA de S. pneumoniae e Ssab de S. sanguis. Em
um modelo de peritonite in vivo, observou-se maior sobrevida de camundongos infectados com E. faecalis efaA- relativamente aos animais infectados com E. faecalis efaA+ (SINGH et al., 1998). Ademais, Kafil et al. (2016) mostraram que a presença de gentamicina induz a expressão de efaA, estando tal evento também correlacionado com a formação de biofilmes. Isto indica o risco do uso de gentamicina não-associado a outro fármaco ou em doses subclínicas, em virtude de enterococos serem intrinsicamente resistentes a ele.
Posteriormente à adesão e à colonização, ocorre a invasão de tecidos. Com a finalidade de se alastrarem, Enterococcus spp. sintetizam moléculas incumbidas de realizar o detrimento tecidual, viabilizando nutrientes, ocasionando evasão de imunidade e a invasão em si (SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012). Em
Enterococcus spp., as substância mais conhecidas e secretas com tal finalidade são:
Citolisina (Cyl), Gelatinase (GelE) e Hialuronidase (Hyl).
Citolisina de Enterococcus spp. ocasiona a lise de outras bactérias Gram (+), células do sistema imune e eritrócitos. Portanto, a ocorrência de Cyl está relacionada com o aumento da letalidade em moléstias enterocócicas (HAAS & GILMORE, 1999; TYNE, MARTIN & GILMORE, 2013). É um lantibiótico (bacteriocina de classe II) em
decorrência de ser estruturalmente constituída de lantionina e β-metil-lantionina, mas não é inócuo em virtude de lisar células eucarióticas (WILLEY & VAN DER DONK, 2007). Localiza-se em plasmídeo paD1, assim como agg, mas também foi encontrado em cromossomos enterocócicos e mesmo em PAI (IKE & CLEWEL, 1992; GILMORE et al., 1994). O operon cyl é modulado através de quorum sensing e é necessário à sua síntese a ocorrência simultânea de cylLL, cylLs, cylM, cylB e cylA (HAAS, SHEPARD & GILMORE, 2002). Para a síntese de Cyl funcional, é necessário o remodelamento de dois monômeros, CylLL e CylLs. Inicialmente, os monômeros a serem modificados recebem em suas estruturas unidades de β-metil-lantionina de CylM. Posteriormente, CylB cliva e encaminha CylLL e CylLs ao ambiente extra-celular, culminando com CylA removendo aminoácidos do domínio N-terminal, ativando-os. Quando em ausência de células-alvo, os monômeros se unem, formando multímeros inativos (SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012). Genes como cylI, localizado imediatamente à jusante de cylA, codificam auto-resistência membrânica contra os efeitos deletérios de Cyl em Enterococcus spp. (COBURN et al., 1999).
Gelatina, elementos do sistema complemento e ECM são alvos de hidrólise comuns à GelE de Enterococcus spp. (LOPES et al., 2006; PARK et al., 2008). Qin et al., (2000) descreveram o locus cromossômico fsr (fsrA, fsrB e fsrC) encontrado a montante de gelE e associaram sua ocorrência com a síntese de GelE. Portanto,
Enterococcus spp. gelE+ não necessariamente mostram atividade enzimática em virtude da ausência ou silenciamento de fsrA, fsrB ou fsrC (EATON & GASSON, 2001; SEMEDO et al., 2003a). Outro limitante é a necessidade do feromônio GBAP (Gelatinase Biosynthesis Activating Pheromone) (TEIXEIRA, MERQUIOR & TRABULSI, 2008). Mesmo com ausência de atividade, a ocorrência silenciosa de gelE é relevante em virtude de sua eventual transmissão através de EGM (SEMEDO et al., 2003a).
Hyl está associado com a hidrólise de ácido hialurônico e, assim, com o desmonte de tecidos conectivos, favorecendo a invasão (KAYAOGLU & ORSTAVIK, 2004). Outrora atribuído somente a E. faecium, Hyl foi também encontrado em isolados de E. faecalis, E. casseliflavus, E. mundtii e E. durans (TRIVEDI, CUPAKOVA & KARPISKOVA, 2011). Hyl é similar à hialuronidase de Streptococcus pyogenes, S.
pneumoniae e Staphylococcus aureus (HYNES & WALTON, 2000; VANKERCKHOVEN et al., 2004). O gene hyl é encontrado em plasmídeos de alta massa molecular (170 a 375 kb) e está associado ao Complexo Clonal 17 (CC17) de
E. faecium, comumente envolvido em moléstias nosocomiais; contudo, hyl não está
limitado a estes clones (FREITAS et al., 2010). Como é ainda escassamente estudado, a relevância de Hyl para a virulência de Enterococcus mantém-se em discussão (SEMEDO-LEMSADDEK & MATO, 2012).
3.5 Resistência a Antimicrobianos
Classifica-se a resistência antimicrobiana em intrínseca e assimilada. Os mecanismos intrínsecos são codificados em cromossomos e, assim, conferem resistência aos membros de um mesmo táxon (i.e. espécie ou gênero). Padrões de resistência intrínseca são sabidamente conhecidos, não existindo a necessidade de realizar ensaios ou mesmo de relatar em caso de não-sensibilidade antimicrobiana (BRASIL, 2008; WERNER et al., 2012). Tanto E. faecalis como E. faecium são intrinsicamente resistentes a penicilinas semissintéticas, monobactâmicos, cefalosporinas, polimixinas, clindamicina e sulfametoxazol associado ao trimetoprim. Toleram, também, baixas doses de gentamicina e estreptomicina, os únicos aminoglicosídeos testados rotineiramente em laboratórios (BRASIL, 2007; WERNER et al., 2012; HOLLENBECK & RICE, 2012).
Mutações e transferência de EGM (e.g. plasmídeos e transposons) constituem a resistência assimilada e tal mecanismo mostra potencial de concessão de resistência a todos os antimicrobianos conhecidos (WERNER et al., 2012). Genes em elementos móveis carreiam resistência a variados antimicrobianos clinicamente relevantes e convenientes ao tratamento de infecções enterocócicas, como os β-lactâmicos, glicopeptídeos, oxazolidinonas, glicilciclinas e aminoglicosídeos. Os últimos, em decorrência de Enterococcus mostrarem-se tolerantes aos mesmos, devem ser associados a um fármaco inibidor da síntese de parede celular a fim de se obter o efeito bactericida (BRASIL, 2007; FMUSP, 2011; WERNER et al., 2012; HOLLENBECK & RICE, 2012).
Relativamente à resistência assimilada, é alarmante a troca lateral de EGM entre enterococos ou, ainda, entre bactérias correlatas mais virulentas, difundindo a resistência aos fármacos antimicrobianos e dificultando o tratamento de infecções bacterianas (MORRISON, WOODFORD & COOKSON, 1997; SCHWARZ, PERRETEN & TEUBER, 2001). Credita-se a um VRE a transmissão de resistência à vancomicina a um Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), ocasionando o advento de VMRSA (S. aureus resistente à meticilina e vancomicina)
durante uma coinfecção (NOBLE, VIRANI & CREE, 1992; FRANZ et al., 2003; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2009b).
Primeiramente descritos em 1989, os VREs ascenderam como uma das maiores causas de moléstias nosocomiais em virtude de seu difícil tratamento (SAHM et al., 1989; HOLLENBECK & RICE, 2012). O uso de glicopetídeos ocorre em última instância caso os β-lactâmicos não mostrem atividade bactericida (WOODFORD & JOHNSON, 1994). São vários os mecanismos de resistência à vancomicina, mas os medidados por VanA e VanB são os mais recorrentes entre Enterococcus spp.
O operon vanA está situado no transposon Tn1546 e confere resistência aos antimicrobianos vancomicina e teicoplanina. O operon vanB é encontrado nos transposons Tn1547, Tn1549 e/ou Tn5382 e ocorre, também, em cromossomos, caracterizando, assim, resistência intrínseca. Tal operon, diferentemente de VanA, torna os enterococos somente resistentes à vancomicina (WERNER et al., 2012). Existem outros mecanismos relacionados à resistência aos glicopeptídeos, como VanC, responsável pela resistência inata em E. gallinarum e E. casseliflavus (HOLLENBECK & RICE, 2012).
Brevemente, a resistência a estes fármacos se dá através da síntese de extremidades não-convencionais de peptidoglicanos, diminuindo drasticamente a sua afinidade aos glicopeptídeos. Os VREs, ao invés de D-Ala, sintetizam terminais D-Lac (vanA e vanB, assim como vanD e vanM) ou D-Ser (vanC, vanE, vanG, vanL e vanN). Para tal troca, o operon inclui outras enzimas, como hidrolases e insertases (WERNER, STROMMENGER & WITTER, 2008; ARIAS & MURRAY, 2012; CHEN & XU, 2015).
3.6 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight MS
Os métodos convencionais de identificação de micro-organismos se baseiam no crescimento diferencial em meios de cultura, morfologia e em séries bioquímicas. Entretanto, são demorados e retardam o melhor tratamento antimicrobiano de indivíduos infectados (GAIESKI et al., 2010; DINGLE & BUTLER-WU, 2013).
Quantitave Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) e outros
métodos moleculares aceleram a análise; contudo, são ainda caros e difíceis de serem utilizados em rotinas laboratoriais com alto volume de amostras (BIZZINI & GREUB, 2010). Promissora, MALDI-TOF/MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization –
identificação de bactérias, bolores e leveduras em virtude de ser barata (custo/amostra), veloz e de fácil uso (GRIFFIN et al., 2012; WERNER et al., 2012; CHRIST et al., 2017; ANGELETTI, 2017).
Proteínas extraídas ou células intactas são colocadas em targets e então embebidas em uma matriz, normalmente de α-ciano-4-hidroxicinâmico (4-HCCA). Pulsos de laser convertem as moléculas da amostra em íons(g) 1+ com mínimas roturas. Estes são eletricamente acelerados e então detectados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z) em uma faixa de 2-20 kDa concernente aos ribossomos. Posteriormente, os dados são confrontados com bibliotecas contendo espectros de
status taxonômico conhecido e, então, parâmetros numéricos determinam a máxima
similaridade entre eles, alocando o espectro desconhecido em um determinado gênero ou espécie (SINGHAL et al. 2015). Tais bases de dados são obtidas através dos fabricantes (Biotyper™ e Saramis™); contudo, o software viabiliza o desenvolvimento de uma biblioteca própria (KOSTER & BRUL, 2018).
Utilizando a mesma técnica, é possível verificar a resistência microbiana frente a fármacos de relevância clínica através do monitoramento dos sinais concernentes a eles. Chong et al. (2015) detectaram a atividade de lactamases em bactérias da família Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii através de MALDI-TOF/MS. O imipenem concebe um sinal a 300 Da e, assim, a ocorrência ou não deste classifica a bactéria como sensível ou resistente ao fármaco. Os resultados obtidos foram validados com o Carba-NP, um teste colorimétrico utilizado com o intuito de detectar a atividade de diferentes lactamases. Sinteticamente, os resultados mostraram boa concordância entre ambas as técnicas. Entretanto, Saracli et al. (2015), ao avaliarem a resistência de Candida spp. frente a 3 antimicrobianos, relataram a necessidade de melhor desenvolver os métodos a fim de aumentar sua robustez. Eles encontraram concordância variável (54 a 97%) entre os dados obtidos em MALDI-TOF/MS e o ensaio de Concentração Inibitória Mínima (MIC). Os estudos envolvendo tal finalidade em Enterococcus spp. são, ainda, escassos.
Isolados de E. faecium resistentes à vancomicina e vanB+ detectados através de PCR foram corretamente discriminados de isolados sensíveis em MALDI-TOF/MS. Picos de massa de 2212, 4717, 5095, 5946 e 8328 Da constituíram o modelo discriminatório. Estes isolados adentraram o banco de dados e foram classificados como “VRE (+)”. Posteriormente, tal modelo foi utilizado na rotina laboratorial a fim de detectar VRE vanB+ através de MALDI-TOF/MS e, assim, validá-lo. Os autores
analisaram 281 spots referentes a 129 amostras, encontrando concordância dos achados em 274 (97,50%). Somente 7 spots (2,50%) foram identificados incorretamente, sendo 4 falso (-) e 3 falso (+), revelando 96,70% de sensibilidade e 98,10%, de especificidade. Ademais, os autores observaram o contraste entre os espectros de E. faecium vanA+ e vanB+ ao analisarem os sinais obtidos entre 6460 e 6830 Da (GRIFFIN et al., 2012).
Outra finalidade é o MALDI-typing, onde a similaridade entre os isolados microbianos é avaliada através de quimiometria. Griffin et al. (2012) examinaram um surto de VRE ocorrido em um nosocômio australiano em 2009. Para tanto, 66 E.
faecium vanB+ foram analisados em MALDI-TOF/MS e submetidos à Análise de Cluster Hierárquico (HCA). Firmado em cutoff de similaridade de 2.5, os autores identificaram a existência de 4 clusters prováveis de terem causado o surto. Com o intuito de validar os resultados, os autores incluíram na análise 4 clones caracterizados através de PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis). Utilizando o
cutoff de 2.5, observou-se a sua divisão em 2 clusters diferentes. Quando analisados
sozinhos, os 4 clones formaram um único cluster em um cutoff de 1.7. Os autores associaram tal erro à uniformidade amostral e, mesmo com essas não-concordâncias, constataram como válido o uso de MALDI-typing.
Em outro estudo, Freitas et al. (2017) discriminaram culturas de E. faecium associados ao ambiente nosocomial de isolados associados à comunidade (indivíduos saudáveis e suínos). Foram utilizados 77 E. faecium caracterizados a nível molecular com o uso de MLST (Multilocus Sequence Typing) associado ao software BAPS (Bayesian Analysis of Population Structure), totalizando 17 STs (Sequence Types). Os isolados clínicos de E. faecium foram classificados em BAPS2.1a, 3.3a1 e 3.3a2 (13 STs) e os relacionados à comunidade em BAPS2.1b e 3.2. (4 STs). O uso de quimiometria viabilizou o correto discernimento com mais de 99,00% de acurácia entre as bactérias de ambas as fontes de isolamento baseadas nas classes criadas em
software BAPS. O discernimento entre os STs foi variável (33,00% a 99,30%, média
de 70,80%) e, assim, insuficiente. Os autores não identificaram biomarcadores relacionados aos clones, mas demonstraram a eficácia de MALDI-typing em discernir isolados relacionados ao ambiente clínico e à comunidade. Diferentemente de Griffin et al. (2012), eles não visualizaram contrastes entre E. faecium vanA+ e vanB+.
Lasch et al. (2014) utilizaram MALDI-TOF/MS com intuito de diferenciar 112 isolados clínicos de E. faecium (CC17) e relacionados à comunidade, como os
encontrados em animais de abate ou em alimentos cárneos. Os isolados foram caracterizados anteriormente com o uso de MLST, resultando em 52 STs diferentes. Os autores somente discriminaram os isolados clínicos de E. faecium dos demais com 87,00% de acurácia e, assim como Freitas et al. (2017), não identificaram biomarcadores associados a eles. Sumariamente, não aconselham o uso de
MALDI-typing em E. faecium/VRE.
Em alimentos, Nacef et al. (2017) analisaram amostras de Maroilles a fim de identificar as Bactérias-Ácido Láticas (LAB) utilizando MALDI-TOF/MS. Como são correlatas, as LAB eventualmente são identificadas incorretamente através de métodos convencionais e mesmo moleculares. Foram isoladas 197 LAB identificadas como Leuconostoc pseudomesenteroides, Enterococcus devriesei e Lactobacillus spp., como L. plantarum, L. paracasei, entre outros. Posteriormente, os autores realizaram a análise de HCA e verificaram uma clara divisão entre as espécies, com ressalvas somente a um cluster misto constituído de Lactobacillus curvatus e
Lactobacillus fructivorans. Para validar os dados, eles escolheram 10 bactérias em
diferentes clusters e as identificaram novamente através do 16S rDNA. Houve concordândia entre ambos os métodos.
Para identificar bactérias, bolores e leveduras em MALDI-TOF/MS, é necessário utilizar culturas isoladas em meio sólido, limitando o seu uso em virtude de cultivos adicionais. Entretanto, Barreiro et al. (2012) identificaram culturas ATCC de
Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus inoculadas em
amostras de leite. Pellets de 103 a 108 UFC receberam 1 mL de leite e os extratos bacterianos foram obtidos conforme o kit MALDI Sepsityper™ e, consecutivamente, com ácido fórmico a 70% e acetonitrila. Previsivelmente, análises envolvendo baixa densidade bacteriana resultaram em escassez de sinais e, assim, elas não foram identificadas. Tal viés foi contornado ao incubar o leite a 37ºC/4 horas, evidenciando a viabilidade de MALDI-TOF/MS ser utilizado em outras áreas não voltadas à clínica. Promissores, os estudos envolvendo MALDI-typing em Enterococcus spp. são ainda escassos. Observando a literatura, nota-se um foco maior em E. faecium, sobretudo os VRE. Preconiza-se no atual estudo a análise discriminatória de E.
4. Material e Métodos
4.1 Culturas Bacterianas
Foram utilizados 155 isolados de enterococos, sendo 116 de E. faecalis, 26 de
E. faecium e 13 de Enterococcus spp. (10 E. gallinarum, 1 E. durans, 1 E. hirae e 1 E. casseliflavus). Os isolados de E. faecalis e E. faecium foram identificados como tal
através de PCR (ddlE. faecalis e ddlE. faecium, em ordem) e os de Enterococcus spp., com o uso de MALDI-TOF/MS. Todos foram anteriormente isolados de ambiente fabril, leite cru e queijos Minas frescal de uma indústria de laticínios situada no interior de São Paulo (CASTRO, 2012) e encontram-se criopreservadas em freezer -80°C pertencente ao Laboratório de Higiene e Legislação do Departamento de Tecnologia de Alimentos, localizado na Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
Outros 30 isolados de E. faecalis oriundos de uroculturas foram também analisados. Os mesmos foram solicitamente cedidos pelo Laboratório de Microbiologia – Divisão de Patologia Clínica (HC-UNICAMP) e tal concessão estendeu-se de 08/2017 a 09/2017 concomitantemente com a sua ocorrência em amostras clínicas de urina. Estes enterococos também foram confirmados como E. faecalis através de PCR.
4.2 Ativação de Culturas Congeladas
Uma alçada de cultura criopreservada em freezer -80ºC foi inoculada em 5 mL de caldo Brain Heart Infusion (BHI) e incubada a 35ºC/24 horas. Em seguida, uma alçada foi semeada em placa de Petri contendo meio diferencial ágar KF
Streptococcus acrescido de TTC (Cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazólio) a 1% e incubado
a 35ºC/48 horas. Colônias características de cor arroxeada ou rósea que apresentaram halo amarelo foram transferidas para tubos contendo ágar BHI inclinado. Posteriormente, as culturas foram congeladas a fim de manter uma coleção própria.
4.3 Pesquisa de Genes de Virulência
4.3.1 Extração de DNA
Para tal, as culturas foram inoculadas em caldo BHI e incubadas a 35ºC/24 horas. Posteriormente, 600 µL de cada cultura ativada foram transferidos para microtubos de 1,5 mL (Eppendorf) e estes foram submetidos a centrifugação a 13.000 xg/10 minutos (centrífuga Hettich Mikro 185). O sobrenadante foi descartado e os
pellets, ressuspendidos com 95 µL de tampão TE (10 mM Tris, 0,1mM EDTA, pH 8,0).
Adicionou-se, então, 4 µL de lisozima (50 mg/mL) e manteve-se os microtubos à temperatura ambiente por 15 minutos. Subsequentemente, foi adicionado 1 µL de proteinase K (20 mg/mL) seguido de incubação em banho-maria a 58ºC/1 hora, com tratamento final para a inativação da enzima a 95ºC/6 minutos (FURRER et al., 1991). O DNA extraído foi mantido congelado a -20ºC.
4.3.2 PCR Convencional
Os genes ddlE. faecalis, ddlE. faecium, agg, ace, efaA, esp e vanB foram amplificados separadamente, conforme métodos descritos por Dutka-Malen, Evers & Courvalin (1995) e Mannu et al. (2003), com modificações (FERNANDES, 2014). Para tal, utilizou-se volume reacional de 25 μL constituído de 1 μL de DNA molde, tampão PCR 1X (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 0,8% [v/v] Nonidet P40, pH 8,8 a 25ºC), 2,0 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 0,2 μM de cada primer, 1 U de enzima Taq DNA Polimerase e água ultrapura esterilizada. O transcurso em termociclador (Eppendorf 5331 Mastercycler Gradient) constituiu-se de desnaturação inicial a 94ºC/2 minutos, 30 ciclos a 94ºC/1 minuto, anelamento por 1 minuto (Tabela 1), 72ºC/1 minuto e extensão final a 72ºC/10 minutos.
O gene vanA dispõe de condições operacionais distintas e foi executado conforme Clark et al. (1993), com modificações. A ciclagem constituiu-se de desnaturação inicial a 94ºC/2 minutos, 30 ciclos a 94ºC/30 segundos, anelamento por 30 segundos (Tabela 1), 72ºC/30 segundos e extensão final a 72ºC/10 minutos.
4.3.3 PCR Duplex
Os genes gelE e cylB, cylA e cylM foram analisados simultaneamente por PCR Duplex segundo métodos descritos por Vankerckhoven et al. (2004) e Gomes et al. (2008), com modificações (FERNANDES, 2014). O volume reacional de 25 μL foi
constituído de 1 μL de DNA molde, tampão PCR 1X, 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 0,2 μM de cada primer, 1 U de enzima HotStart Taq DNA Polimerase e água ultrapura esterilizada. Em termociclador (Eppendorf 5331 Mastercycler Gradient), utilizou-se desnaturação inicial a 94ºC/3 minutos, 35 ciclos a 94ºC/1 minuto, anelamento por 1 minuto (Tabela 1), 72ºC/1 minuto e extensão final a 72ºC/10 minutos.
Tabela 1. Características dos primers utilizados para a identificação de espécies, detecção de fatores virulência e resistência à vancomicina em Enterococcus spp.
Gene Sequência (5' → 3') Tamanho do Produto Temperatura de Anelamento Referência ddlE. faecalis ATCAAGTACAGTTAGTCT
941 54ºC Dutka-Malen, Evers &
Courvalin (1995) ACGATTCAAAGCTAACTG
ddlE.
faecium
GCAAGGCTTCTTAGAGA
550 54ºC Dutka-Malen, Evers &
Courvalin (1995) CATCGTGTAAGCTAACTTC
agg AAGAAAAAGAAGTAGACCAAC 1553 58ºC Eaton & Gasson (2001)
AAACGGCAAGACAAGTAAATA
ace AAAGTAGAATTAGATCCACAC 320 50ºC Mannu et al. (2003)
TCTATCACATTCGGTTGCG
efaA CGTGAGAAAGAAATGGAGGA 499 60ºC Mannu et al. (2003)
CTACTAACACGTCACGAATG
esp TTGCTAATGCTAGTCCACGACC 933 65ºC Eaton & Gasson (2001)
GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA
vanA CCCTTTAACGCTAATACGATCAA 1030 58ºC Clark et al. (1993)
CATGAATAGAATAAAAGTTGCAAT
vanB GTGACAAACCGGAGGCGAGGA 529 58ºC Clark et al. (1993)
CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA
cylM CTGATGGAAAGAAGATAGTAT 742 56ºC Eaton & Gasson (2001)
TGAGTTGGTCTGATTACATTT
cylB ATTCCTACCTATGTTCTGTTA 843 54ºC Eaton & Gasson (2001)
AATAAACTCTTCTTTTCCAAC
cylA TGGATGATAGTGATAGGAAGT 517 56ºC Eaton & Gasson (2001)
TCTACAGTAAATCTTTCGTCA
gelE ACCCCGTATCATTGGTTT 419 54ºC Eaton & Gasson (2001)
4.3.4 Eletroforese
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% submerso em tampão 0,5X Tris/Borato/EDTA (TBE) e então relevados com SYBR Safe (Invitrogren) de 20 a 30 minutos. Os produtos foram visualizados com auxílio de transiluminador UV (Kodac Gel Logic 200) e, então, fotodocumentados.
4.4 Teste de Sensibilidade a Antimicrobiano
Este perfil foi determinado pelo método padrão de disco-difusão recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2016). Para tal, as culturas foram ativadas em caldo BHI a 35ºC/24 horas. Posteriormente, realizou-se novo repique em caldo BHI com incubação a 35ºC de 4 a 6 horas até a obtenção em Densimat (bioMérieux) de turbidez correspondente à escala McFarland 0,5 (≅ 1,5x108 UFC/mL). Quando necessário, diluiu-se a cultura com solução salina esterilizada (NaCl 0,85%). Em até 15 minutos, uma alíquota desta suspensão bacteriana foi espraiada uniformemente em ágar Müeller-Hinton. Posteriormente à secagem e com o auxílio de pinça esterilizada, o meio recebeu discos de antimicrobianos e foi incubado a 35ºC/24 horas. Os halos foram diametralmente mensurados (milímetros) e a sensibilidade bacteriana foi determinada de acordo com CLSI (2016). Os antimicrobianos selecionados são comumente utilizados para o tratamento de infecções e estão dispostos abaixo com suas respectivas concentrações (Tabela 2).
Tabela 2. Antimicrobianos testados em E. faecalis isolados de laticínios e uroculturas e os devidos valores dos diâmetros dos halos de inibição.
Classe Antimicrobiano Concentração (µg)
Diâmetro do Halo (mm)
R I S
Aminoglicosídeos Gentamicina (Gent) 120 ≤ 6 7 – 9 ≥ 10
Estreptomicina (Strep) 300 ≤ 6 7 – 9 ≥ 10
Ansamicinas Rifampicina (Rif) 5 ≤ 16 17 – 19 ≥ 20
β-Lactâmicos Ampicilina (Amp) 10 ≤ 16 - ≥ 17
Fenicóis Cloranfenicol (Clo) 30 ≤ 12 13 – 17 ≥ 18
Glicopetídeos Teicoplanina (Teic) 30 ≤ 10 11 – 13 ≥ 14
Vancomicina (Van) 30 ≤ 14 15 – 16 ≥ 17
Macrolídeos Eritromicina (Eri) 15 ≤ 13 14 – 22 ≥ 23
Quinolonas Norfloxacina (Nor) 10 ≤ 12 13 – 16 ≥ 17
Tetraciclinas Tetraciclina (Tet) 30 ≤ 14 15 – 18 ≥ 19
R: Resistente; I: Intermediário; S: Sensível. Fonte: CLSI (2016).
4.5Teste χ² de Homogeneidade
Utilizou-se o Teste χ² de Homogeneidade a fim de verificar a associação entre a ocorrência de fatores de virulência (agg, ace, efaA, esp, cylA, cylB, cylM e gelE) e a fonte de isolamento das culturas de Enterococcus faecalis (laticínios ou urina). Para tal, adotou-se α = 0,05. Como o teste foi realizado com 1 Grau de Liberdade, aceitou-se H0 (ocorrência similar) em caso de χ² ≤ 3,84.
4.6 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight MS
Esta análise foi realizada em colaboração com o Laboratório Thomson de Espectrometria de Massas, localizado no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
Foram analisados 60 isolados de E. faecalis, sendo 30 encontrados em laticínios e 30 em amostras clínicas de urina, com o intuito de discriminá-los molecularmente e realizar MALDI-typing. Ademais, os 13 isolados de Enterococcus spp. oriundos de laticínios, não identificados através de PCR, foram identificados
através do software MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Bremem, Germany) e os resultados concernentes aos mesmos encontram-se no anexo C.
4.6.1 Extração de Proteínas
Para tal, utilizou-se o método Biotyper (ácido fórmico a 70% e acetronitrila) de acordo com o manual do fabricante. Os isolados foram cultivados em ágar BHI a 35ºC/24 horas. Posteriormente, 300 μL de água ultrapura foram adicionados em microtubos de 1,5 mL (Eppendorf). Estes receberam uma alçada microbiana e, em seguida, 900 μL de etanol. Uma vez homogêneos, os microtubos foram centrifugados duas vezes a 13.000 xg/2 minutos (centrífuga Hettich Mikro 185), com descarte de sobrenadante ao final de ambas. Os pellets foram ressuspendidos em 50 μL de ácido fórmico a 70% e em 50 μL de acetonitrila (ACN). Uma nova centrifugação ocorreu a 13.000 xg/2 minutos e, desta vez, transferiu-se o sobrenadante para outro recipiente e este foi mantido a -20ºC até a análise, realizada em no máximo 24h. Para cada isolado, o procedimento acima foi efetuado em triplicata.
4.6.2 Obtenção de Espectros
Transferiu-se 1 µL das proteínas extraídas anteriormente para o target e, após secagem, adicionou-se 1 µL da matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (4-HCCA). Para cada isolado, o procedimento acima foi realizado em triplicata. Posteriormente à secagem dos spots, inseriu-se o target no equipamento Bruker Autoflex III SmartBeam™ (Bruker Daltonics, Bremem, Germany). Utilizando o software AutoFlex Control (versão 3.4), obteve-se os espectros de todos os spots utilizando uma faixa de detecção de 2 a 20 kDa em Modo Linear Positivo.
4.6.4 Processamento de Dados
Escolheu-se o espectro mais característico de cada isolado para o pré-tratamento em software flexAnalysis (versão 3.3) (Bruker Daltonics) com remoção da linha de base, smoothing e alinhamento externo. Os picos iônicos foram detectados utilizando o algoritmo Centroid com limiar de sinal/ruído = 4. Para as análises uni e multivariadas, utilizou-se o software de acesso livre MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca). Nele, os dados foram normalizados por soma, log-transformados e Pareto-escalados, com tolerância de desvio de massa de ± 3 Da. Um total de 38 isolados foram randomicamente selecionados com o intuito de se construir
um método estatístico classificatório utilizando o Support Vector Machine (SVM) e os demais isolados (22) foram utilizados como teste deste modelo (Tabela 3). O SVM é uma análise utilizada a fim de detectar biomarcadores. Curvas Receiver Operating
Characteristic (ROC) foram calculadas com o intuito de avaliar o funcionamento dos
modelos SVM e os modelos com os maiores valores de AUC (Area Under the Curve) foram selecionados. Outras análises, como Heatmap, Hierarchical Cluster Analysis (HCA) e Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) foram realizadas considerando as 60 culturas de E. faecalis.
Tabela 3. Culturas de E. faecalis utilizadas como treinamento e teste de SVM.
Origem Treinamento Teste
Laticínios
E11, E13, E14, E15, E17, E18, E20, E23, E24, E51, E127, E151, E161,
E176, E257, E267, E271, E302
E12, E19, E21, E22, E61, E84, E89, E191, E207, E261,
E291, E312 Urina H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H10, H11, H13, H14, H16, H17, H25, H27, H30, H31, H32, H34, H35 H12, H15, H18, H19, H20, H22, H23, H24, H26, H28
5. Resultados & Discussão
5.1 Perfil de Genes de Virulência em Enterococcus spp. Isolados de Laticínios Estudou-se em todos os 155 isolados de enterococos, sendo 116 de E. faecalis, 26 de E. faecium e 13 de Enterococcus spp. (10 E. gallinarum, 1 E. durans, 1 E. hirae e 1 E. casseliflavus) os genes cylABM (Citolisina), gelE (Gelatinase), efaA (Antígeno A Endocardite-Específico), ace (Proteína de Ligação ao Colágeno), esp (Proteína de Superfície Enterocócica), agg (Substância Agregativa), vanA e vanB (resistência à vancomicina). Os amplicons obtidos a partir de bactérias portadoras dos genes avaliados e suas massas moleculares estimadas estão mostrados na Figura 1.
Observou-se a ausência dos fatores de virulência avaliados em 22 (14,19%) isolados de enterococos (15 E. faecium, 6 E. gallinarum e 1 E. casseliflavus). Em 21,94% (34/155), detectou-se simultaneamente até 3 fatores. O acontecimento simultâneo de 4 genes de virulência foi o mais comum e foi observado em 40,65% (63/155) das culturas estudas; relativamente a elas, 47 (30,32%) contiveram gelE,
Figura 1. Foto de eletroforese em gel de agarose 1,5% mostrando os amplicons gerados em cada PCR. M: Marcador de massa molecular 1 kb plus (TianGen Biotech, China); 1 e 2:
Enterococcus faecalis ATCC 29212; 3: E. faecalis 54USP; 4: E. faecalis 37UEL; 5 e 6: E. faecalis ATCC 29212; 7: E. faecalis 5UEL; 8: E. faecalis ATCC 51299
