Análises químico-bromatológicas 96

Para estimativa dos teores de matéria mineral (MM), proteína bruta (PB), fibra insolúvel em detergente neutro (FDN), fibra insolúvel em detergente ácido (FDA), hemicelulose (HEM) e digestibilidade verdadeira in vitro da matéria seca (DVIVMS) foi utilizada a espectroscopia de reflectância de infravermelho proximal (NIR). O método utilizado foi previamente descrito por Berzaghi; Cozzi e Andrighetto (1997) e Cozzolino; Acosta e Garcia (2001).

O equipamento utilizado foi o espectrômetro modelo NIRSystems 5000 (FOSS NIRSystems® Inc., Silver Spring, MD, USA) acoplado a microcomputador equipado com

software WinISI II 1.5 (Intrasoft International, Port Matilda, PA, USA). Para obtenção dos

espectros NIR as amostras secas e moídas a 1,0 mm foram escaneadas utilizando-se a célula Transport quarter cup, modelo IH – 0379. Para tanto, se utilizou uma população de 523 amostras, geradas dos três experimentos que compõem esta tese.

O conjunto de amostras foi escaneado nesse equipamento obtendo leituras compreendidas entre comprimentos de onda de 1100 a 2498 nm. Esses espectros foram armazenados em curvas log (1/R), a intervalos de 2 nm. Utilizaram-se os métodos de seleção de amostras existentes no software do equipamento, por meio dos algoritmos CENTER e SELECT (SHENK; WESTERHAUS, 1991). O algoritmo CENTER descarta as amostras com distância superior a 3,0 H (distância padronizada de Mahalanobis) da média, sendo consideradas como outliers. O algoritmo SELECT

verifica a distância de seu vizinho mais próximo no conjunto de amostras, adotando-se a distância máxima de NH (Neighborhood H) de 0,8 H, de forma a selecionar amostras representativas de variação espectral. Do total de amostras do banco de dados o

software selecionou 99 para a análise química e posterior desenvolvimento de curvas

de calibração.

Os teores de matéria seca (MS) e mineral (MM) das amostras selecionadas pelo NIR foram determinados segundo método da AOAC (1980).

A determinação do teor PB ocorreu por meio da combustão das amostras, de acordo com o método de Dumas, utilizando-se um auto-analisador de nitrogênio, marca LECO® _{(Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA), modelo FP-528 (WILES; GRAY;}

KISSLING, 1998).

As análises dos teores de FDN e FDA foram realizadas pelo método seqüencial proposto pela ANKOM Fiber Analyser (ANKOM® _{Technology Corp., Fairport, NY, USA)}

e descrito por Holden (1999). O teor de HEM foi calculado pela diferença entre os teores de FDN e FDA, sendo que o mesmo também foi inserido no banco de dados do NIR e calculado da mesma maneira.

O coeficiente de DVIVMS foi calculado seguindo o mesmo protocolo proposto da

ANKOM Daisy Incubator (ANKOM® Technology Corp., Fairport, NY, USA), também

descrito por Holden (1999). O fluído ruminal foi obtido de uma vaca da raça Holandesa fistulada no rúmen, pesando aproximadamente 600 kg. O animal foi mantido previamente em alimentação básica com feno de gramínea e mistura mineral.

Foi utilizado o modelo de regressão multivariada MPLS (Modified Partial Least

Squares) com vários tratamentos matemáticos dos espectros NIR para que cada uma

das variáveis fosse calculada separadamente. Os tratamentos matemáticos (derivative,

gap over, smooth, second smooth) utilizados foram: 1,4,4,1; 2,4,4,1; 2,10,10,1;

2,20,20,1. As equações desenvolvidas foram selecionadas pelos menores erros padrão de calibração (SEC) e validação cruzada (SECV) e pelos maiores coeficientes de determinação da calibração (R2) e de validação cruzada (1-VR). Depois de escolhidas as equações, estimou-se os teores dos nutrientes de todo o banco de dados.

Os teores de MS, MM, PB, FDN, FDA e HEM, bem como o coeficiente de DVIVMS dos ingredientes concentrados (polpa cítrica peletizada, farelo de algodão e

milho em grão moído) foram analisados somente pela química líquida, conforme as metodologias descritas acima, sem a inserção destes valores no conjunto de amostras que foram analisadas e calculadas pelo NIR. A análise bromatológica média para esses ingredientes está demonstrada na Tabela 3.2.

Tabela 3.2 – Análise químico-bromatológica dos ingredientes concentrados utilizados nas rações dos tourinhos da raça Nelore

Variável PCP1 FA2 MGM3 MS, % 94,35 92,89 90,01 MM, % MS 5,48 6,38 1,41 PB, % MS 7,54 45,14 10,01 FDN, % MS 27,79 29,93 10,34 FDA, % MS 20,32 23,22 3,51 HEM, % MS 7,47 6,71 6,83 DVIVMS, % 82,12 66,24 79,07

Notas: 1 PCP – Polpa cítrica peletizada; 2 FA – Farelo de algodão; 3 MGM – Milho grão moído.

As amostras das fontes de volumosos coletadas semanalmente foram descongeladas e preparadas segundo metodologia de Kung Junior et al. (1984). A uma amostra de 25 g de forragem foram adicionados 225 mL de água deionizada, sendo processada durante um minuto no liquidificador industrial, modelo TA-02, da marca Skymsen®_{. Em seguida o valor de pH foi medido no material processado com o uso de}

potenciômetro digital modelo DM 20, marca Digimed®_{. Na seqüência, o extrato}

preparado foi filtrado em papel de filtro Whatman® 54, acidificado com três gotas de ácido sulfúrico (50%) e centrifugado durante 15 minutos a 10.000 x g. O sobrenadante foi transferido para microtubos plásticos com capacidade de 1,5 mL e armazenados à - 20°C.

O extrato aquoso foi ponto de partida para determinação dos carboidratos solúveis (CHO’s) em água da cana-de-açúcar fresca e silagens. A metodologia utilizada foi a descrita por Dubois et al. (1956), a qual se inicia com o preparo de uma solução de fenol (5%) e uma solução padrão de sacarose. Em tubo de ensaio contendo extrato aquoso da silagem ou das soluções padrões de sacarose foi adicionada a solução de

fenol. Depois de homogeneizadas, as soluções descritas acima foram acidificadas com ácido sulfúrico 98%, sendo em seguida conduzidas ao banho-maria à 37°C, onde permaneceram por 20 minutos. Passado este período, uma alíquota das soluções foi pipetada para placas de microtubo e encaminhada para leitura de absorbância em leitor de microplaca (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA) utilizando-se filtro para absorbância de 490 nm. O software do equipamento fez os cálculos dos teores de CHO’s à partir de valores de absorbância da curva padrão e estimou os teores das amostras (µg/mL). Os valores foram corrigidos para percentual da MS para fins de comparação com resultados de literatura.

O ácido lático foi determinado segundo metodologia adaptada de Pryce (1969). As soluções padrões de ácido lático foram preparadas segundo método descrito pelo autor. Adicionou-se 3,95 mL do reagente precipitante (contendo tungstato de sódio, ácido ortofosfórico 90% e sulfato de cobre) a 50 µL de solução padrão ou extrato de silagem em tubos de ensaio e agitados por cinco segundos. A seguir, centrifugou-se por cinco minutos a 2000 x g. O sobrenadante foi pipetado para outro tubo de ensaio e a ele foram adicionados 6 mL de ácido sulfúrico concentrado. Depois de dois minutos os tubos foram agitados por dez segundos em vortex, seguido de resfriamento dos mesmos em água corrente. A etapa seguinte foi adição de 100 µL de reagente de coloração (1,5 g de p-hidroxibifenil, em 100 ml de dimetilformamida) ao produto de análise e nova agitação em vortex por cinco segundos. Depois de descanso de dez minutos, os tubos passaram por banho em água fervente durante 90 segundos, estando assim, prontos para a leitura de absorbância que foi realizada pelo espectrofotômetro, modelo 6405 UV/Vis., da marca Jenway®, calibrado para comprimento de onda de 565 nm.

Para análise dos ácidos graxos voláteis (C2, C3 e C4) seguiu-se a metodologia descrita por Campos; Nussio e Nussio (2004), na qual 800 µL do extrato aquoso da silagem, juntamente com 200 µL de ácido fórmico e 100 µL de padrão interno foram transferidos para frascos de cromatografia. A leitura foi realizada em cromatógrafo líquido-gasoso, CLG (Hewlett Packard® 5890, série II), equipado com braço mecânico HP Integrator 3396, série II (Hewlett Packard Company®_{). O gás de arraste e os}

20, 30 e 400 mL/min. A temperatura do injetor foi de 150°C, do detector de 190°C e da coluna 115°C.

O teor de etanol (g/L) foi determinado por meio de leitura direta utilizando-se o analisador bioquímico YSI 2700 Select (Biochemistry Analyzer®, Yellow Spring, OH, USA). Também para fins de comparação com dados de literatura, os valores foram calculados em função do percentual de MS das amostras.