An´ alise do potencial de superf´ıcie - An´ alise da funcionaliza¸c˜ ao

3.2 An´ alise da funcionaliza¸c˜ ao

3.2.2 An´ alise do potencial de superf´ıcie

Para caracterizar o processo de funcionaliza¸cão, através de medidas de potencial de superf´ıcie utilizando o método Kelvin Probe Force Microscopy, as amostras foram funcionalizadas de acordo com o protocolo descrito na prepara¸cão do biossensor. Após a imobiliza¸cão de probe DNA, as amostras foram passivadas com etileno glicol e foi adicionado target ssDNA em diferentes concentra¸cões.

As medidas de potencial de superf´ıcie foram feitas com uma amostra de referência (InP sem funcionaliza¸cão) e em seguida com a amostra funcionalizada. As duas foram montadas no mesmo porta-amostra para manter os ajustes do lock-in para as medidas elétricas. Dessa forma, os ajustes foram feitos com a ponta próxima da amostra de referência. Uma vez realizadas as medidas nessa amostra, a ponta foi levantada e aproximada na amostra funcionalizada, mantendo os mesmos ajustes da medida anterior. Assim podemos comparar o potencial de superf´ıcie médio das duas amostras.

As imagens foram obtidas com velocidade de varredura de 0.5 ln/s e com resolu¸cão de 256 x 256 pixels. As medidas foram feitas sob fluxo de N2na câmara que contém as amostras, após um intervalo de tempo entre 30’ e 4 h entre o in´ıcio do fluxo e a medida.

As Figuras 3.11 (a), (b) e (c) apresentam as imagens de topografia, fase e SP respectivamente para a amostra InP#3154 sem funcionaliza¸c˜ao (referˆencia) e as Figuras 3.11 (d), (e) e (f) ilustram as imagens para a amostra funcionalizada com PEG.

Medidas similares foram feitas para a amostra de referência e a amostra funcionalizada com moléculas de probe ssDNA (Figuras 3.11 (g), (h) e (i)). A Tabela 3.1 a seguir apresenta os valores médios do SP calculados para as imagens de SP das amostras com PEG e com probe ssDNA e as medidas de referência correspondentes. O erro representa o valor do rms para toda a imagem.

Observamos que o SP médio da amostra funcionalizada com PEG aumenta 140 mV em rela¸cão à referência, notando que a escala dos valores para o SP é negativa. Já a amostra com probe ssDNA apresenta um SP médio 190 mV menor que a referência, como é ilustrado na Figura 3.12.

Figura 3.11: Imagens de 5 µm x 5 µm de (a) topografia, (b) fase e (c) SP para a amostra InP#3154 sem funcionaliza¸c˜ao (referˆencia); (d) topografia, (e) fase e (f) SP para a amostra InP#3154 funcionalizada com PEG e (g) topografia, (h)

fase e (i) SP para a amostra InP#3154 funcionalizada com probe ssDNA.

Tabela 3.1: Potenciais de superf´ıcie m´edios para as amostras de InP#3154 funcionalizadas com PEG e probe DNA e as medidas de referˆencia correspon-

dentes.

Um estudo semelhante foi feito para amostras de InP#3228 com probe ssDNA e com target ssDNA nas concentra¸cões 10 pM e 10 µM. As imagens obtidas para a referência, probe ssDNA target ssDNA 10 pM são apresentadas na Figura 3.13. A amostra com target 10 µM apresentou comportamento similar. As imagens de topografia e fase apresentam superf´ıcies homogêneas, com um pequeno aumento na varia¸cão de altura para as amostras funcionalizadas.

Figura 3.12: Diagrama representando a varia¸c˜ao de potencial de superf´ıcie entre as amostras de InP#3154 funcionalizadas e a referˆencia correspondente.

Figura 3.13: Imagens de 0,5 µm x 0,5 µm de: (a) topografia, (b) fase, (c) SP para a amostra InP#3228 de referˆencia, e (d) topografia, (e) fase e (f) SP para a amostra de InP#3228 com probe DNA, (g) topografia, (h) fase e (i) SP para

Tabela 3.2: Potenciais de superf´ıcie médios para as amostras de InP#3228 funcionalizadas com probe DNA, amostras com titula¸cão de target DNA nas concentra¸cões 10 pM, 10 nM e 10 µM e as medidas de referência correspondentes.

Os valores médios para o potencial de superf´ıcie das amostras com probe e target ssDNA e das amostras de referência correspondentes são apresentados na Tabela 3.2. Encontramos que o valor médio da amostra com probe ssDNA está 90 mV abaixo do valor da referência, e para as amostras com target a varia¸cão aumenta, sendo 280 mV e 360 mV abaixo da referência para as concentra¸cões de 10 pM e 10 nM, respectivamente. O diagrama da Figura 3.14 ilustra essas varia¸cões.

Figura 3.14: Diagrama representando a varia¸c˜ao de potencial de superf´ıcie entre as amostras de InP#3228 funcionalizadas e a referˆencia correspondente.

Porém, não podemos relacionar, a princ´ıpio, a varia¸cão do potencial de superf´ıcie às diferentes concentra¸cões de target ssDNA, pois verificamos que a medida depende das condi¸cões ambientes. Por exemplo a umidade e a quantidade de água adsorvida na superf´ıcie, que variam de acordo com o tempo em que a amostra ficou exposta ao fluxo de N2 na câmara do microscópio, alteram significativamente os valores de SP medidos.

A Figura 3.15 ilustra duas medidas de SP realizadas com a mesma amostra de InP#3228 com target ssDNA 10 µM. A primeira medida foi feita ap´os 30 min de fluxo de N2 e a segunda, ap´os 2h.

Figura 3.15: Imagens com 0,5 x 0,5 µm para medidas de SP na amostra InP#3228 com target ssDNA 10µM ap´os (a) 30 min e (b) 2h de exposi¸c˜ao ao

fluxo de N2.

Tabela 3.3: Potenciais de superf´ıcie m´edios para medidas com a amostra InP#3228 com target ssDNA 10µ em diferentes tempos de exposi¸c˜ao ao fluxo

de N2.

A Tabela 3.3 apresenta os valores médios para o potencial de superf´ıcie da amostra de referência InP#3228 sem funcionaliza¸cão e da amostra InP#3228 funcionalizada com target ssDNA 10 µM nas duas medidas: após 30 min e 2 h em fluxo de N2. As varia¸cões do SP médio das duas imagens em rela¸cão ao SP médio das amostras de referência correspondentes são ilustradas no diagrama da Figura 3.16. Para a medida feita após 30 min em fluxo de N2 na câmara, encontramos uma varia¸cão de potencial de -360 mV, enquanto para a medida após 2 h de fluxo, a varia¸cão foi de -90 mV. Podemos atribuir esta varia¸cão à contribui¸cão dos momentos de dipolo da água adsorvida na superf´ıcie, pois o brush da camada PEG favorece a liga¸cão de moléculas de água.

Figura 3.16: Diagrama ilustrando as varia¸cões de potencial de superf´ıcie para medidas da amostra InP#3228 com target DNA 10 µM após 30 min e 2h de exposi¸cão ao fluxo de N2 em rela¸cão à medida de referência correspondente.

Em alguns casos a funcionaliza¸cão não resultou em superf´ıcies homogêneas, como mostram as figuras a seguir. A Figura 3.17 ilustra imagens de topografia, fase e SP para duas regiões de uma amostra InP#3227 funcionalizada e com a adi¸cão de target ssDNA na concentra¸cão de 20 pM.

Como podemos observar, a imagem de topografia mostra estruturas de até 40 nm de altura (Figuras 3.17 (d) e (g)), provavelmente formadas pela aglomera¸cão do PEG. As imagens de fase e SP indicam composi¸cões diferentes na superf´ıcie. As medidas de SP (Figuras 3.17 (f) e (i)) mostram uma estratifica¸cão de n´ıveis de potencial para as diferentes composi¸cões encontradas na amostra.

Os n´ıveis estão identificados como 1, 2, 3 e 4 na Figura 3.18, a qual apresenta um zoom em uma região da Figura 3.17 (f) para melhor visualiza¸cão dos n´ıveis observados. Os valores médios do SP calculados para cada n´ıvel nas duas regiões da amostra, Figuras 3.17 (f) e (i), são apresentados na Tabela 3.4 . Nas medidas de referência realizadas na amostra de InP sem funcionaliza¸cão, o potencial de superf´ıcie médio foi (−1, 60 ± 0, 01) V.

Observamos que na primeira região, existem 2 n´ıveis (identificados como 3 e 4) com potencial mais alto que o valor medido na referência, enquanto o n´ıvel 1 está menor e o n´ıvel 2 mais próximo da referência. Como ilustra o diagrama da Figura 3.12, a camada PEG aumenta o potencial de superf´ıcie e adi¸cao de DNA diminui, então inicalmente podemos atribuir os n´ıveis 3 e 4 ao PEG e os n´ıveis 1 e 2 ao DNA hibridizado e probe ssDNA, respectivamente, notando nas imagens que o n´ıvel 1 (região branca) está apenas sobre o n´ıvel 2 (região verde), então

Figura 3.17: Imagens de 0,5 µm x 0,5 µm de: (a) topografia, (b) fase, (c) SP para a amostra de referˆencia, e (d) e (g) topografia, (e) e (h) fase, (f) e (i) SP

para duas regi˜oes da amostra InP#3227 com target DNA 20 pM.

Figura 3.18: Identifica¸cão dos n´ıveis de potencial de superf´ıcie para as diferentes composi¸cões obtidas pelo processo de funcionaliza¸cão na amostra com

Tabela 3.4: Potenciais de superf´ıcie m´edios para os n´ıveis encontrados em duas regi˜oes da amostra com target ssDNA 20pM.

podemos considerar que o n´ıvel 1 corresponde a regi˜oes onde o target e o probe foram hibridizados.

Na imagem da segunda região encontramos uma varia¸cão menor entre os n´ıveis de potencial, o que pode ser atribu´ıdo ao fato desta região apresentar áreas mais homogêneas, o que se reflete no valor médio da Tabela 3.4. Para identifcar as composi¸cões referentes a cada n´ıvel de potencial encontrado, analisamos a área ocupada por cada região na imagem.

A Tabela 3.5 a seguir mostra uma média dos valores de área calculados para as duas regiões da amostra. As regiões referentes aos n´ıveis 3 e 4 ocupam a maior área nas amostras, enquanto a região 1, que supomos ser ocupada pelo DNA hibridizado, ocupa a menor área com ' 3%. A região 2, que supomos ser o probe ssDNA não hibridizado ocupa uma área maior de ' 19%.

Tabela 3.5: Áreas efetivas e relativas ocupadas por cada n´ıvel de potencial calculadas a partir da média das duas regiões da amostra com target ssDNA

20pM.

Também encontramos superf´ıcies não homogêneas numa outra amostra de InP#3227 funcionalizada e com a adi¸cão de target ssDNA na concentra¸cão 30 pM.

Figura 3.19: Imagens de 0,5µm x 0,5µm de: (a) topografia, (b) fase, (c)SP para a amostra de referˆencia, e (d) e (g) topografia, (e) e (h) fase, (f) e (i) SP

para duas regi˜oes da amostra InP3227 com target DNA 30pM.

A Figura 3.19 ilustra as imagens de topografia, fase e SP na amostra de referência e em duas regiões da amostra funcionalizada. Na topografia encontramos aglome- rados com até 60nm de altura e nas imagens de fase e SP observamos diferentes composi¸cões na amostra. A Figura 3.20 apresenta um zoom em uma região da Figura 3.19 (i), onde os 4 n´ıveis para o potencial de superf´ıcie foram identificados de maneira similar à amostra com 20 pM.

Figura 3.20: Identifica¸cão dos n´ıveis de potencial de superf´ıcie para as diferentes composi¸cões obtidas pelo processo de funcionaliza¸cão na amostra com

A Tabela 3.6 apresenta os valores m´edios, nas duas regi˜oes da amostra (Figuras 3.19 (f) e (i)) , para os n´ıveis 1, 2, 3 e 4 identificados na Figura 3.20.

Os valores de SP para cada n´ıvel são similares nas duas regiões da amostra. O potencial de superf´ıcie médio da amostra de referência, Figura 3.19 (c), foi de ' (1, 56±0, 01)V . Fazendo uma análise semelhante à amostra com 20 pM, também podemos atribuir os n´ıveis 3 e 4 à camada PEG, sendo que o potencial de superf´ıcie do n´ıvel 4 está acima do potencial da referência. A média das áreas ocupadas por cada n´ıvel nas duas regiões da amostra são apresentadas na Tabela 3.7.

Tabela 3.6: Potenciais de superf´ıcie m´edios para os n´ıveis encontrados em duas regi˜oes da amostra com target ssDNA 30 pM.

Tabela 3.7: Áreas efetivas e relativas ocupadas por cada n´ıvel de potencial calculadas a partir da média das duas regiões da amostra com target ssDNA 30

pM.

Novamente encontramos que as regiões 3 e 4 correspondentes ao PEG ocupam a maior área. A região 1 correspondente ao DNA hibridizado ocupa a menor área, com ' 5% e a região 2, correspondente ao DNA probe não hibridizado ocupa uma ´

area um pouco maior, com ' 12%.

Comparando as áreas médias nas Tabelas 3.5 e 3.7, observamos que a área do n´ıvel 1 aumenta de 3% , na amostra com target 20 pM, para 5%, na amostra com target 30 pM e a área do n´ıvel 2 diminui de 19% para 12%. Isso dá suporte à conclusão

de que o n´ıvel 1 corresponde ao DNA hibridizado, já que a área ocupada por este n´ıvel aumenta e a área do n´ıvel 2 correspondente ao probe não hibridizado diminui na amostra com concentra¸cão de target maior. Além disso, quando variamos a concentra¸cão de target nas amostras, não há varia¸cão considerável nas áreas ocupadas pelos n´ıveis 3 e 4, atribu´ıdos ao PEG passivado com etileno glicol e ao PEG não passivado.

Cap´ıtulo 4

Conclus˜oes

Foram estudados quatro biossensores baseados em filme fino de InP, crescido ho- moepitaxialmente por Epitaxia de Feixe Qu´ımico (CBE), sobre um substrato de InP semi-isolante. As medidas de Efeito Hall para caracteriza¸cão das propriedades do semicondutor mostraram que as amostras preparadas apenas com a dopagem residual do sistema, possuem concentra¸cões de portadores entre 1014 _{e 10}15 _cm−3 e a amostra dopada com Si, 1018 _cm−3_{. Al´}_{em disso as medidas mostraram que} todas as amostras são do tipo-n. Em fun¸cão do tempo de crescimento no CBE, o filme fino semicondutor foi crescido com diferentes espessuras.

As medidas de deteçcão do biossensor foram realizadas para o sistema de in- tera¸cão espec´ıfica ssDNA, onde oligonucleot´ıdeos receptores (probe ssDNA) foram imobilizados na superf´ıcie funcionalizada do dispositivo para análise do analito contendo oligonucleot´ıdeos complementares (target ssDNA). A hibridiza¸cão das fitas de DNA levam a uma varia¸cão na densidade superficial de cargas, visto que o DNA tem carga negativa intr´ınseca. Essa varia¸cão aumenta a camada de deple¸cão no semicondutor, como foi observado nas medidas de resistência em fun¸cão do tempo, em que a resistência aumenta com a adi¸cão de target.

Nas medidas elétricas de calibra¸cão com o buffer TRIS, observamos uma varia¸cão da resistência no in´ıcio da medida, devido ao efeito capacitivo da configura¸cão dos ´ıons na solu¸cão próximo à superf´ıcie após a aplica¸cão do potencial aplicado entre os contatos de In. O potencial devido aos ´ıons na superf´ıcie depleta (ou acumula) os portadores próximos da interface do semicondutor com a camada funcionalizada, variando a condutância do canal. Depois de 20 min de medidas, o valor da resistência estabiliza em um valor R0, o qual foi utilizado para o cálculo da

varia¸cão da resistência nos experimentos de titula¸cão com diferentes concentra¸cões de DNA.

O biossensor 1 foi feito com a amostra de ' 70nm de espessura e concentra¸cão de portadores da ordem de 1015 _cm−3_{. Ap´}_{os calibrar o dispositivo com buffer TRIS} e adicionar a solu¸cão que contém o target, ocorre uma varia¸cão na resistência por conta dos efeitos do TRIS e do tempo necessário para difusão das moléculas de target até que atinjam à superf´ıcie e ocorra a hibridiza¸cão, e após 20min a resistência estabiliza. Este é, portanto, o tempo de resposta do dispositivo. A varia¸cão ∆R_R

0 apresentou valores significativos para concentra¸c˜oes entre 10 pM e 50

pM. A curva da resposta do sensor em fun¸c˜ao da concentra¸c˜ao de target ssDNA apresentou comportamento semelhante ao biossensor realizado anteriormente em nosso grupo [64], exceto por uma resposta menor, com aproximadamente ' 30% neste caso.

Com uma concentra¸c˜ao menor de portadores, mas mantendo a mesmo espessura da amostra, observamos que a resposta satura com a concentra¸c˜ao de 10 pM, como foi observado no biossensor 2.

No biossensor 3, o filme fino semicondutor tem 1014 portadores/cm3 e a espessura ´

e o dobro da amostra anterior. Encontramos que a resposta para concentra¸cões de target entre 10 pM e 10 nM foi menor que 10%, diferentemente dos biossensores 1 e 2. Mas a adi¸cão de concentra¸cões de 1 µM provoca uma varia¸cão na resistência de aproximadamente 20%, comparável com as respostas encontradas anteriormente. Neste caso, porém, a sensibilidade foi reduzida de pM para µM .

O biossensor 4, que foi feito com a amostra dopada, com concentra¸cão de portadores da ordem de 1018_cm−3_{, n˜}_{ao apresentou varia¸c˜}_{ao com a adi¸c˜}_{ao de target e} também não apresentou varia¸cão significativa com a adi¸cão de buffer, indicando que a varia¸cão no potencial da superf´ıcie devido aos ´ıons da sulu¸cão e a hibridiza¸cão do DNA não foi suficiente para depletar os portadores do canal de condu¸cão. A hibridiza¸cão do DNA na superf´ıcie depende de vários fatores como densidade de receptores imobilizados (probe ssDNA) e for¸ca iônica do buffer TRIS. A deteçcão dos eventos de hibridiza¸cão também depende das condi¸cões do buffer e da altura da camada funcionalizada, visto que apenas eventos que ocorrem até o comprimento de Debye serão detectados. Como as amostras foram funcionalizadas e medidas sob as mesmas condi¸cões, então podemos atribuir a varia¸cão observada na resposta dos biossensores às propriedades do filme fino semicondutor.

Portanto, para amostras com baixa densidade de portadores, é necessário obter camada mais finas para obter sensibilidade para detectar concentra¸cões da ordem de pM. Para amostras dopadas, uma tensão VG deveria ser aplicada no gate, além do potencial da camada de biomoléculas.

Para isso seria necessário fazer um dispositivo com um backgate, para aplicar um potencial VG e modular a camada de deple¸cão no caso das amostras dopadas, as quais podem ser crescidas com controle da dopagem e, portanto, concentra¸cões de portadores definidas, diferentemente da dopagem residual que depende das condi¸cões do sistema CBE. Dessa forma, seria poss´ıvel estudar a resposta do biossensor em fun¸cão da concentra¸cão de portadores e obter amostras que podem ser mais reprodut´ıveis. A Figura 4.1 ilustra uma representa¸cão da estrutura do biossensor com backgate, que pode ser feito a partir da deposi¸cão de uma camada de Au na parte inferior do substrato.

Figura 4.1: Representa¸c˜ao da estrutura do biossensor de InP de grande ´area, mostrando o filme de InP do tipo-n sobre um substrato de InP semi-isolante e

uma camada de Au, funcionando como contato do backgate.

Mas, como o InP é muito quebradi¸co, não foi poss´ıvel montar essa estrutura. Então uma alternativa ao biossensor de InP de grande área seria fazer o dispositvo com nanofios de InP, o que foi feito em nosso grupo [62]. O biossensor com nanofios de InP dopados apresentando concentra¸cão de portadores da ordem de 1018 _cm−3_, mostrou sensibilidade para medidas de concentra¸cões de target ssDNA da ordem de fM, apresentando respostas com até 30% de varia¸cão na resistência.

A espessura da camada funcionalizada medida por AFM mostrou que o processo de funcionaliza¸cão utilizado permite obter camadas com aproximadamente 2nm de espessura, o que é esperado para o funcionamento do biossensor, pois é necessário obter camadas muito finas para que os eventos de hibridiza¸cão ocorram dentro do comprimento de Debye.

As medidas de potencial de superf´ıcie pelo método Kelvin Probe Force Microscopy mostraram que a funcionaliza¸cão da superf´ıcie com polietileno glicol (PEG) provoca um aumento no potencial de superf´ıcie (SP) em rela¸cão ao da amostra de referência, a qual não passou por nenhum processo de funcionaliza¸cão. A adi¸cão de probe ssDNA, que é imobilizado covalentemente na camada PEG, causa uma diminui¸cão no SP, que neste caso passa a ser mais negativo que o SP da amostra de referência.

As imagens com as amostras fucnionalizadas com probe ssDNA e target ssDNA apresentaram-se homogêneas com varia¸cões de no máximo 3nm na altura, como pode ser visto nas medidas de topografia. A fase e o SP também mostraram uma distribu¸cão homogênea sobre a superf´ıcie. A partir da compara¸cão dos valores médios de SP para cada imagem, vimos que o SP diminui em rela¸cão à referência para a amostra com probe, confirmando os resultados da medida anterior. A adi¸cão de target provoca uma diminui¸cão maior no potencial, porém não podemos a princ´ıpio fazer uma anologia precisa entre os valores médios observados na varia¸cão e as concentra¸cões de DNA utilizadas, visto que vários fatores podem influenciar nas medidas de potencial de superf´ıcie, como foram apresentados nos resultados que comparam o SP medido para uma mesma amostra sob tempos de exposi¸cão diferentes ao fluxo de N2 na câmara do microscópio.

Nas amostras homogêneas não é poss´ıvel identificar varia¸cões locais no SP, pois não há resolu¸cão na medida para varia¸cões de potencial de estruturas muito peque- nas (2-3 nm encontradas nas imagens de topografia), da´ı as análises foram feitas comparando o valor médio do SP da imagem da amostra funcionalizada com o

No documento Estudo das características elétricas do biossensor do tipo FET baseado em InP (páginas 64-86)