Estudo das características elétricas do biossensor do tipo FET baseado em InP

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INSTITUTO DE F´ISICA GLEB WATAGHIN

Aldeliane Maria da Silva

Estudo das caracter´ısticas el´

etricas do biossensor

do tipo FET baseado em InP

CAMPINAS 2016

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Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Física Gleb Wataghin Lucimeire de Oliveira Silva da Rocha - CRB 8/9174

Silva, Aldeliane Maria da,

Si38e SilEstudo das características elétricas do biossensor do tipo FET baseado em InP / Aldeliane Maria da Silva. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.

SilOrientador: Mônica Alonso Cotta.

SilDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin.

Sil1. Biossensores. 2. Fosfeto de índio. 3. DNA. 4. Transistores de efeito de campo. I. Cotta, Mônica Alonso,1963-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Física Gleb Wataghin. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Study of electrical characteristics of FET-type biosensor based on

InP Palavras-chave em inglês: Biosensors Indium phosphide DNA Field-effect transistors

Área de concentração: Física Titulação: Mestra em Física Banca examinadora:

Mônica Alonso Cotta [Orientador] Christoph Friedrich Deneke Antonio Riul Júnior

Data de defesa: 12-07-2016

Programa de Pós-Graduação: Física

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MEMBROS DA COMISSÃO JULGADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE

ALDELIANE MARIA DA SILVA - RA 153904 APRESENTADA E APROVADA AO

INSTITUTO DE FÍSICA “GLEB WATAGHIN”, DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, EM 12 / 07 / 2016.

COMISSÃO JULGADORA:

- Profa. Dra. Mônica Alonso Cotta – Orientadora – DFA/IFGW/UNICAMP

- Prof. Dr. Christoph Friedrich Deneke – LNNano/CNPEM

- Prof. Dr. Antonio Riul Júnior – DFA/IFGW/UNICAMP

OBS.: Informo que as assinaturas dos respectivos professores membros da banca

constam na ata de defesa já juntada no processo vida acadêmica do aluno.

CAMPINAS

2016

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A Deus por todas as maravilhas da vida e pela oportunidade de realizar este trabalho.

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A minha orientadora Profa.Dra. Mônica Cotta pela orienta¸cão, apoio e também pela paciência infinita desde o in´ıcio do mestrado.

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A minha mãe Ozilma por estar comigo sempre e me apoiar em todas as escolhas, além de me ensinar a não ter medo dos desafios.

Ao meu pai Aldo pelo apoio, ensinamentos e incentivo para o estudo da ciˆencia e realiza¸c˜ao deste trabalho.

Aos meus irmãos pela amizade e apoio nos momentos mais dif´ıceis, e ao meu pequenino sobrinho Ricardo por me dar alegria infinita e inspira¸cão pela ciência.

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A Mariana Zavarize (amiga do lab) pela amizade e apoio durante o mestrado, e pela ajuda com o programa do LabView para a aquisi¸c˜ao das medidas el´etricas do biossensor.

Ao Adinei pelo apoio indo ao laboratório para me ajudar a abrir as garrafas de reagentes para funcionaliza¸cão das amostras (aquelas tampas são muito apertadas para mim) e pela ajuda indispensável com o LaTex.

Aos amigos e membros do grupo Moniellen, Duber, Douglas, Jacobo, Bruno. `

A Moniellen e Duber pela amizade e ajuda no lab e na prepara¸cão dos buffers. Ao Richard Janissen pelo protocolo de funcionaliza¸cão das amostras e pre-para¸cão do biossensor.

Ao Prasana Sahoo pela ajuda e paciência na funcionaliza¸cão das amostras. Ao Alberto pela ajuda na discussão sobre o biossensor.

Ao Antônio von Zuben (Totó) pelo incentivo desde o in´ıcio deste trabalho e pela prepara¸cão das minhas amostras com plasma de O2.

Ao H´elio Obata pelo crescimento das amostras do biossensor e pela ajuda com os contatos el´etricos de In.

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A Rita Gullen pelos ensinamentos e apoio. `

A amiga da gradua¸c˜ao Bruna Gabrielly pelo incentivo (Klim!). `

As meninas da rep´ublica: Danittiele, Renata, Vanessa, Zhang Xiao Dan (Alice) pelo incentivo.

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phenomena which impress him like a fairy tale.”

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Este trabalho apresenta resultados de nossa investiga¸cão sobre as propriedades elétricas do biossensor do tipo transistor de efeito de campo (FET, do inglês Field Effect Transistor ) baseado em fosfeto de ´ındio (InP). A estrutura deste biossen-sor consiste em um filme fino de InP do tipo-n crescido por Epitaxia de Feixe Qu´ımico (CBE, do inglês Chemical Beam Epitaxy) sobre um substrato de InP semi-isolante. No nosso biosensor, o contato da porta foi substitu´ıdo por uma camada de biomoléculas carregadas de interesse para a deteçcão, funcionalizadas na camada de óxido do InP. O campo elétrico associado a estas biomoléculas pode modular o canal de condu¸cão. O sistema de intera¸cão espec´ıfica utilizado foi a hibridiza¸cão de fitas de ssDNA (single stranded DNA) complementares, onde os oligonucleot´ıdeos receptores (probe) ssDNA foram imobilizados covalentemente na superf´ıcie da amostra. Este procedimento foi realizado através da oxida¸cão com plasma de O2, seguida da funcionaliza¸cão utilizando etanolamina e polietileno

gli-col (PEG), que serve como linker para a imobiliza¸cão de receptores na superf´ıcie. As medidas elétricas de deteçcão foram feitas com as moléculas de target dilu´ıdas em buffer TRIS. A hibridiza¸cão do DNA provoca um aumento na densidade de cargas na superf´ıcie, que consequentemente aumenta a largura da região de de-ple¸cão no semicondutor, variando a resistência medida. A resposta do biossensor corresponde à varia¸cão da resistência em fun¸cão da concentra¸cão de target. O biossensor apresentou sensibilidade para medidas de concentra¸cões entre 10 pM e 30 pM, onde ocorre a satura¸cão, e o tempo de resposta, no qual encontramos a estabiliza¸cão do sinal medido, foi de aproximadamente 20 min. Variando a concentra¸cão de portadores e a espessura da camada semicondutora, verificamos altera¸cões no limite de satura¸cão (até µM) e na sensibilidade do dispositivo. O controle destas propriedades, porém, mostrou-se limitado devido à varia¸cões na dopagem residual do semicondutor, e por isso discutimos aqui alternativas à ge-ometria do dispositivo. Analisamos também a camada funcionalizada através de medidas de topografia e potencial de superf´ıcie usando métodos de microscopia de varredura por sonda (SPM, do inglês Scanning Probe Microscopy). Pudemos iden-tificar a varia¸cão no potencial de superf´ıcie associada à imobiliza¸cão do PEG e do DNA probe, mas não obtivemos resolu¸cão para o DNA target. Esta técnica permi-tiu porém verificar a estratifica¸cão de quatro n´ıveis de potencial de superf´ıcie, no caso onde a funcionaliza¸cão resultou em camadas mais espessas do que os valores t´ıpicos (∼ 2 nm de espessura), em pequenas áreas do semicondutor.

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This dissertation presents our results for the electrical properties investigation of Indium Phosphide (InP) based Field Effect Transistor (FET) biosensor. The structure of this biosensor consists of a thin n-type InP film grown by Chemical Beam Epitaxy (CBE) on a semi-insulating InP substrate. In our biosensor, the gate contact has been replaced by charged biomolecules of interest for detection, functionalized to the InP oxide layer. The electric field associated with these bi-omolecules provides the conduction channel modulation. The specific interaction system used here was the hybridization of single stranded-DNA (ssDNA) comple-mentary oligonucleotides, for which the ssDNA receivers (probes) were covalently immobilized on the sample surface. The functionalization was carried out by oxi-dation with O2 plasma, followed by grafting biomolecules using ethanolamine and

polyethylene glycol (PEG), which act as a linker for immobilizing the receptors on the surface. Electrical detection measurements were made with the target mole-cules diluted in TRIS buffer. DNA hybridization causes an increase in the surface charge density; consequently the semiconductor depletion width increases, affec-ting the measured resistance. The biosensor response function corresponds to the resistance variation as a function of target concentration. Our biosensor showed measured sensitivity to concentrations between 10 pM and 30 pM, for which signal saturation occurs. The response time, for which the measured signal stabilization was observed, was approximately 20 min. By varying the carrier concentration and the thickness of the semiconductor layer, we observed changes in the saturation limit (up µM) and device sensitivity. The control of these properties, however, is limited due to variations in the residual doping of the semiconductor. Therefore we discuss here alternative device geometries. We also analyzed the functionalized layer by topography and surface potential measurements obtained using scanning probe microscopy (SPM) methods. We were able to identify the change in surface potential associated with the immobilization of PEG and probe DNA, but not for the target DNA. These techniques have however shown four surface potential le-vels in the case when the functionalization resulted in non-uniform layers, thicker than the typical values (∼ 2 nm), in small areas of the semiconductor.

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1.1 Representa¸cão da estrutura de um biossensor (receptor biológico integrado a um transdutor), a intera¸cão com o analito levará à ob-ten¸cão de um sinal mensurável, adaptado de [1]. . . 19 1.2 Ilustra¸cão do processo de reconhecimento espec´ıfico que levará a um

sinal mensurável no biossensor, adaptado de [1]. . . 20 1.3 Estrutura e composi¸cão da molécula dsDNA [20]. . . 23 1.4 Ilustra¸cão de 4 métodos comuns para imobiliza¸cão de biomoléculas:

aprisionamento em membrana, microencapsulamento, adsor¸cão f´ısica e liga¸cão covalente, adaptado de [26]. . . 24 1.5 Representa¸cão esquemática de diferentes formas de imobiliza¸cão de

biomoléculas receptoras na superf´ıcie (probes): 1) adsor¸cão, 2) imo-biliza¸cão por rea¸cões aleatórias e 3) imobiliza¸cão por liga¸cão em um s´ıtio espec´ıfico da superf´ıcie, comparando a perda de atividade dos probes imobilizados pelos processos 1 e 2 em rela¸cão ao 3, que permite uma configura¸cão orientada, adaptado de [19]. . . 25 1.6 Representa¸cão da imobiliza¸cão orientada de (a) molécula de ssDNA

e (b) anticorpo, adaptado de [19]. . . 26 1.7 Representa¸cão esquemática de um biossensor baseado em ressonância

de plásmons de superf´ıcie (SPR). Nesta configura¸cão é utilizado um prisma como objeto óptico, adaptado de [33]. . . 29 1.8 Diagramas de bandas de energia para uma estrutura capacitiva MIS

nos modos: (a) acumula¸cão, (b) deple¸cão e (c) inversão, adaptado de [52]. . . 32 1.9 Varia¸cão da largura da região de deple¸cão em fun¸cão do potencial

de band bending para InP com diferentes concentra¸c˜oes de portadores. 33 1.10 Diferentes configura¸c˜oes para dispositivos do tipo FET, adaptado

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dois casos, cargas negativas no contato da porta ou na superf´ıcie do nanofio levam ao aumento da condutância entre fonte (F) e dreno (D), adaptado de [56]. . . 35 1.12 Representa¸cão esquemática de uma molécula de DNA imobilizada

covalentemente na superf´ıcie de um sensor FET e os comprimentos de Debye λD para solu¸c˜oes com diferentes for¸cas iˆonicas, adaptado

de [47]. . . 37 1.13 Representa¸c˜ao de um (a) FET e (b) biossensor de InP do tipo FET,

onde o contato da porta foi substitu´ıda por uma camada de bioma-terial. . . 38 2.1 Representa¸c˜ao da estrutura do biossensor de InP. Um filme fino de

InP tipo-n é crescido sobre um substrato de InP semi-isolante. Os contatos elétrico de In (em amarelo) foram feitos nas laterais da superf´ıcie do dispositivo, definido uma área ativa (verde) do dispo-sitivo. A parte superior da figura representa a funcionaliza¸cão com uma camada de etanolamina (azul), camada PEG, as biomoléculas receptoras imobilizadas e os ligantes que serão detectados através de intera¸cão espec´ıfica com os receptores, adaptado de [64]. . . 41 2.2 Esquema simplificado do sistema CBE instalado no IFGW da

Uni-camp. Precursores do material do grupo III (TEG e TMI), junta-mente com seu g´as de arraste (H2), e precursores do grupo V (P H3

e AsH3) craqueados termicamente s˜ao introduzidos em uma cˆamera

de crescimento que está em alto vácuo (inicialmente em ultra alto vácuo). As paredes da câmara de crescimento são resfriadas com nitrogênio l´ıquido para ajudar a manter pressão baixa durante o crescimento e também capturar os precursores que tenham dessor-vido do substrato [67]. . . 43 2.3 Etapas do processo de funcionaliza¸cão da superf´ıcie: 1.Oxida¸cão;

2.Amina¸cão; 3.Camada PEG e 4.Imobiliza¸cão covalente de probe ssDNA, adaptado de [65]. . . 45 2.4 A) Amostra de InP (1) conectada através de fios de cobre (2) a

uma placa de circuito para medidas elétricas. B) Célula l´ıquida de acr´ılico adaptada a amostra de InP com os contatos elétricos para medidas de deteçcão, a estrutura foi montada sobre um suporte de PVC [63]. . . 47 2.5 Representa¸cao do AFM [69]. . . 49 2.6 Potencial de for¸ca interatômica em fun¸cão da distância entre ponta

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2.8 Diagrama de energia: (a)ponta e amostra isoladas eletricamente; (b)contato el´etrico e (c) aplica¸c˜ao do potencia VDC para anular a

diferen¸ca de potencial de contato VCP D, adaptado de [71]. . . 52

3.1 Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 1, mostrando inicialmente a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os expe-rimentos de titula¸cão com target ssDNA. . . 56 3.2 Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão do tempo, a

partir da adi¸cão de target em concentra¸cões entre 10 pM e 50 pM para o biossensor 1. . . 57 3.3 Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão da

concen-tra¸cão de target DNA para o biossensor 1. Os pontos representam a média da resposta do biossensor após a estabiliza¸cão em cada concentra¸cão de target e as barras de erro representam o desvio da média. A curva verde representa o ajuste realizado pela fun¸cão f (x) = Kmax· x/(x + KD) do modelo de isoterma de Langmuir. . . 58

3.4 Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 2, mostrando inicialmente a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os expe-rimentos de titula¸cão com target ssDNA. . . 59 3.5 Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão do tempo, a

partir da adi¸cão de target ssDNA em concentra¸cões entre 10 pM e 30 pM para o biossensor 2. . . 60 3.6 Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 3,

mostrando inicialmente a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os expe-rimentos de titula¸cão com target ssDNA. . . 60 3.7 Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão do tempo, a

partir da adi¸cão de target ssDNA em concentra¸cões entre 10 pM e 10 µM para o biossensor 3. . . 61 3.8 Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 4,

mostrando a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os experimentos de titula¸cão com target ssDNA nas concentra¸cões de 10 pM e 50 pM. . 62 3.9 Imagens de (a) topografia e (b) friçcão, obtidas após 20 medidas

no modo contato do AFM em uma mesma região de 5 µm x 5 µm da amostra funcionalizada com etanolamina, PEG e probe ssDNA. A região mais escura com aproximadamente 1,5 µm de largura na imagem de topografia representa a região de onde foi retirado mais material com a ponta do AFM. A linha rosa representa uma cross-section para estimar aaltura da camada. . . 63

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rosa na imagem de topografia. . . 63 3.11 Imagens de 5 µm x 5 µm de (a) topografia, (b) fase e (c) SP para

a amostra InP#3154 sem funcionaliza¸cão (referência); (d) topogra-fia, (e) fase e (f) SP para a amostra InP#3154 funcionalizada com PEG e (g) topografia, (h) fase e (i) SP para a amostra InP#3154 funcionalizada com probe ssDNA. . . 65 3.12 Diagrama representando a varia¸cão de potencial de superf´ıcie entre

as amostras de InP#3154 funcionalizadas e a referˆencia correspon-dente. . . 66 3.13 Imagens de 0,5 µm x 0,5 µm de: (a) topografia, (b) fase, (c) SP para

a amostra InP#3228 de referˆencia, e (d) topografia, (e) fase e (f) SP para a amostra de InP#3228 com probe DNA, (g) topografia, (h) fase e (i) SP para a amostra InP#3228 com target DNA 10 pM. 66 3.14 Diagrama representando a varia¸c˜ao de potencial de superf´ıcie entre

as amostras de InP#3228 funcionalizadas e a referˆencia correspon-dente. . . 67 3.15 Imagens com 0,5 x 0,5 µm para medidas de SP na amostra InP#3228

com target ssDNA 10µM ap´os (a) 30 min e (b) 2h de exposi¸c˜ao ao fluxo de N2. . . 68

3.16 Diagrama ilustrando as varia¸cões de potencial de superf´ıcie para medidas da amostra InP#3228 com target DNA 10 µM após 30 min e 2h de exposi¸cão ao fluxo de N2 em rela¸cão à medida de referência

correspondente. . . 69 3.17 Imagens de 0,5 µm x 0,5 µm de: (a) topografia, (b) fase, (c) SP para

a amostra de referência, e (d) e (g) topografia, (e) e (h) fase, (f) e (i) SP para duas regiões da amostra InP#3227 com target DNA 20 pM. . . 70 3.18 Identifica¸cão dos n´ıveis de potencial de superf´ıcie para as diferentes

composi¸c˜oes obtidas pelo processo de funcionaliza¸c˜ao na amostra com target ssDNA 20pM. . . 70 3.19 Imagens de 0,5µm x 0,5µm de: (a) topografia, (b) fase, (c)SP para

a amostra de referência, e (d) e (g) topografia, (e) e (h) fase, (f) e (i) SP para duas regiões da amostra InP3227 com target DNA 30pM. 72 3.20 Identifica¸cão dos n´ıveis de potencial de superf´ıcie para as diferentes

composi¸c˜oes obtidas pelo processo de funcionaliza¸c˜ao na amostra com target ssDNA 30 pM. . . 72

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semi-isolante e uma camada de Au, funcionando como contato do backgate. . . 77

(16)

2.1 Valores médios para a concentra¸cão e mobilidade de portadores e re-sistividade do filme fino de InP. Estes valores foram obtidos através de 4 medidas Hall. Também são apresentados o tempo de cresci-mento das amostras no CBE e a espessura nominal relacionada. . . 44 2.2 Materiais utilizados na prepara¸cão dos buffers e os valores de pH

obtidos. . . 46 3.1 Potenciais de superf´ıcie m´edios para as amostras de InP#3154

fun-cionalizadas com PEG e probe DNA e as medidas de referˆencia correspondentes. . . 65 3.2 Potenciais de superf´ıcie m´edios para as amostras de InP#3228

fun-cionalizadas com probe DNA, amostras com titula¸cão de target DNA nas concentra¸cões 10 pM, 10 nM e 10 µM e as medidas de referência correspondentes. . . 67 3.3 Potenciais de superf´ıcie médios para medidas com a amostra InP#3228

com target ssDNA 10µ em diferentes tempos de exposi¸c˜ao ao fluxo de N2. . . 68

3.4 Potenciais de superf´ıcie m´edios para os n´ıveis encontrados em duas regi˜oes da amostra com target ssDNA 20pM. . . 71 3.5 Areas efetivas e relativas ocupadas por cada n´ıvel de potencial cal-´

culadas a partir da média das duas regiões da amostra com target ssDNA 20pM. . . 71 3.6 Potenciais de superf´ıcie médios para os n´ıveis encontrados em duas

regi˜oes da amostra com target ssDNA 30 pM. . . 73 3.7 Areas efetivas e relativas ocupadas por cada n´ıvel de potencial cal-´

culadas a partir da m´edia das duas regi˜oes da amostra com target ssDNA 30 pM. . . 73

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AFM- Microscopia de For¸ca Atômica (do inglês Atomic Force Microscopy) AM-KPFM - Amplitude-Modulation Kelvin Probe Force Microscopy CBE - Epitaxia de Feixe Qu´ımico (do inglês Chemical Beam Epitaxy) CTV - Citrus Tristeza Virus

DI - deionizada

DMSO - Dimethyl Sulfoxide DNA - ´Acido desoxirribonucleico dsDNA - double stranded DNA

EDC - (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FET - Transistor de Efeito de Campo (do inglˆes Field Effect Transistor ) FM-KPFM - Frequency-Modulation Kelvin Probe Force Microsopy GFP - Green Fluorescent Protein

GOx - Glicose oxidase

ISFET - Ion Sensitive Field Effect Transistor KPFM - Kelvin Probe Force Microscopy

LOD - Limite de deteçcão (do inglês Limit of Detection) MES - (2-(N-morpholino)-ethanesulfonnic acid)

MIS - Metal-Isolante-Semicondutor

MOSFET - Metal-Oxide Semiconductor Field Effect Transistor

PCR - Rea¸c˜ao em Cadeia da Polimerase (do inglˆes Polymerase Chain Reaction) PEG - Polietilenoglicol

pH - Potencial hidrogeniˆonico

QCM - Microbalan¸ca de Cristal de Quartzo (do inglˆes, Quartz Crystal Microba-lance)

ssDNA - single stranded DNA SP - Potencial de Superf´ıcie

SPM - Microscopia de varredura por sonda (do inglˆes Scanning Probe Micros-copy)

SPR - Ressonância de Plásmons de Superf´ıcie (do inglês Surface Plasmons Reso-nance)

TEG - trietil-g´alio TMI - trimetil-´ındio

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Agradecimentos ii

Resumo v

Abstract vi

1 Introdu¸c˜ao 19

1.1 Biossensor: defini¸c˜ao . . . 19

1.2 Motiva¸c˜ao para o estudo de biossensores . . . 21

1.3 Receptores biol´ogicos . . . 22

1.4 Modos de Transdu¸c˜ao . . . 26

1.5 Biossensores do tipo FET . . . 30

1.5.1 Estrutura de um FET . . . 31

1.5.2 Estrutura do biossensor . . . 34

1.5.3 Biossensor de InP . . . 38

2 Metodologia experimental 41 2.1 Prepara¸c˜ao das amostras . . . 42

2.1.1 Epitaxia de Feixe Qu´ımico (CBE) . . . 42

2.1.2 Crescimento e caracteriza¸c˜ao das amostras semicondutoras . 43 2.1.3 Funcionaliza¸c˜ao da superf´ıcie . . . 44

2.2 Medidas el´etricas do biossensor . . . 47

2.3 Microscopia de For¸ca Atˆomica (AFM) . . . 48

2.4 Kelvin Probe Force Microscopy (KPFM) . . . 49

3 Resultados 55 3.1 Biossensor . . . 55

3.2 An´alise da funcionaliza¸c˜ao . . . 62

3.2.1 Espessura da camada . . . 62

3.2.2 An´alise do potencial de superf´ıcie . . . 64

4 Conclus˜oes 75

(19)

Cap´ıtulo 1

Introdu¸

c˜

ao

1.1 Biossensor: defini¸

c˜

ao

Um sensor qu´ımico, em geral, é um dispositivo que mede uma grandeza f´ısica ou qu´ımica e a transforma em um sinal detectável. No biossensor, o sistema de re-conhecimento é baseado em biomoléculas que estão acopladas a um transdutor. Esta é a estrutura que deve converter a resposta das rea¸cões bioqu´ımicas em um sinal mensurável. As biomoléculas funcionarão como receptores espec´ıficos para um analito que se deseja analisar [1]. A Figura 1.1 ilustra os componentes básicos da estrutura de um biossensor (receptor biológico e transdutor).

Figura 1.1: Representa¸cão da estrutura de um biossensor (receptor biológico integrado a um transdutor), a intera¸cão com o analito levará à obten¸cão de um

sinal mensur´avel, adaptado de [1].

O sistema de intera¸cão espec´ıfica consiste na liga¸cão entre biomoléculas a par-tir de uma rela¸cão ”chave-fechadura”como ocorre nas enzimas, por exemplo. As

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moléculas alvo (targets) irão interagir com os receptores na superf´ıcie e se houver reconhecimento espec´ıfico, haverá um sinal gerado no transdutor (Figura 1.2).

Figura 1.2: Ilustra¸cão do processo de reconhecimento espec´ıfico que levará a um sinal mensurável no biossensor, adaptado de [1].

O conceito inicial de biossensor foi implantado em 1962, com o eletrodo de oxigênio de Leyland C. Clark para monitoramento de oxigênio no sangue. Clark e Lions propuseram que a incorpora¸cão de enzimas ao sistema de deteçcão de oxigênio seria a base para o desenvolvimento de dispositivos para sensoriamento. Tal sistema passou a ser conhecido como eletrodo enzimático. Um exemplo é a imobiliza¸cão da enzima Glicose oxidase (GOx) a um eletrodo de platina para a deteçcão de glicose

em amostras reais, o que deu origem aos biossensores amperométricos de primeira gera¸cão. Na presen¸ca de GOx, a glicose reage com o oxigênio levando à forma¸cão

de ácido glucônico e peróxido de hidrogênio, e o monitoramento da quantidade de O2 consumido (ou H2O2 formado) pode ser associada à concentra¸cão de glicose

[2-4].

Após duas décadas do desenvolvimento de eletrodos enzimáticos, sistemas de transdu¸cão óptica come¸caram a ser integrados a anticorpos para o desenvolvi-mento de sensores com bioafinidade, ou imunussensores, constituindo uma se-gunda linha de instrumenta¸cão nessa área. Outros sistemas de deteçcão baseados em ressonância acústica ou transdu¸cão termométrica e magnética, por exemplo, come¸caram a ser desenvolvidos porém, estes apresentaram um impacto menor nas aplica¸cões, sendo os métodos eletroqu´ımicos mais dominantes nas análises cl´ınicas [2]. Nos últimos anos, muitos trabalhos envolvem o uso de dispositivos semicondu-tores baseados em efeito de campo (FETs, do inglês Field Effect Transistors) para deteçcão elétrica de alta sensibilidade. Estes representam dispositivos promissores para integra¸cão em estruturas emergentes como o lab-on-a-chip [5-9].

(21)

1.2 Motiva¸

c˜

ao para o estudo de biossensores

Os biossensores têm aplica¸cões em áreas de saúde para deteçcão precoce de doen¸cas, farmacêutica no desenvolvimento de medicamentos, análises cl´ınicas, monitora-mento ambiental de poluentes, monitoramonitora-mento de toxinas em alimonitora-mentos e em bi-ologia molecular, na análise da afinidade de intera¸cão entre biomoléculas. A di-versidade de aplica¸cões dos biossensores e a possibilidade de fazer dispositivos que apresentam alta sensibilidade têm levado a um aumento significativo das pesquisas dessa área nas últimas décadas [10-15].

Uma análise dos estudos reportados na literatura pode ser feita a partir de duas abordagens: a primeira consiste no desenvolvimento de instrumentos laboratoriais sofisticados, de alto desempenho para medidas precisas e de alta sensibilidade de componentes e intera¸cões biológicas. A segunda, no desenvolvimento de dispositi-vos portáteis e fáceis de usar, que podem ser utilizados por pessoas não especia-lizadas e que podem, portanto, ser utilizados para análises in situ ou domésticas. Estes representam biossensores de baixo custo e que podem ser produzidos em grande escala para aplica¸cões comerciais como, por exemplo, o caso dos biossen-sores de glicose [2,16].

As principais propriedades que caracterizam um biossensor são: (i) especificidade, que está relacionada a capacidade de reconhecimento da biomolécula de interesse e depende substancialmente da forma como as biomoléculas receptoras são in-tegradas à superf´ıcie do sensor; (ii) sensibilidade, que consiste na concentra¸cão m´ınima do analito que pode ser detectada, esta depende da configura¸cão e das caracter´ısticas do transdutor utilizado e das condi¸cões ambientes em que a medida de deteçcão é feita; (iii) tempo de resposta, que está associado principalmente ao tempo de difusão das biomoléculas na solu¸cão e ao tempo para liga¸cão com os receptores na superf´ıcie até a obten¸cão de um sinal estável; (iv) custo e (v) tempo de vida do dispositivo .

A configura¸cão do dispositivo para estas propriedades depende da necessidade da aplica¸cão. Por exemplo, a deteçcão precoce de patógenos, quando a doen¸ca ainda está em fase assintomática, exige dispositivos com alta sensibilidade e especifi-cidade, já que as moléculas de interesse estarão em concentra¸cões muito baixas [17,18]. Em regiões onde existem epidemias é necessário o uso de dispositvos que apresentem resposta rápida e alta sensibilidade.

(22)

Neste cap´ıtulo será apresentada uma revisão da literatura sobre os receptores biológicos que são comumente utilizados e algumas formas de como podem ser integrados ao sensor; em seguida sobre os modos de transdu¸cão que constituem os diferentes tipos de biossensores, e por fim, os objetivos deste trabalho.

1.3 Receptores biol´

ogicos

Alguns sistemas de intera¸cão espec´ıfica consistem na liga¸cão ant´ıgeno-anticorpo, liga¸cões protéicas, enzimas e liga¸cões espec´ıficas entre ácidos nucléicos (hibri-diza¸cão). Por exemplo, as enzimas são biomoléculas que possuem atividade ca-tal´ıtica [19] e são caracterizadas por um s´ıtio ativo que deve se ligar especificamente a um substrato. Duas hipóteses principais explicam como esse tipo de intera¸cão pode ocorrer: a hipótese de intera¸cão do tipo chave-fechadura, em que o s´ıtio ativo da enzima interage com o substrato espec´ıfico, e a hipótese de ajuste induzido, em que a presen¸ca do substrato induz uma modifica¸cão no s´ıtio ativo da enzima, até que a liga¸cão ocorra.

Um outro sistema de intera¸cão espec´ıfica consiste na hibridiza¸cão de fitas com-plementares nos ácidos nucléicos, estes são formados por cadeias de nucleot´ıdeos unidos por liga¸cões fosfodiésters. Os nucleot´ıdeos são constitu´ıdos por uma base nitrogenada, uma pentose (a¸cúcar) e um grupo fosfato, no caso do DNA a pentose ´

e a desoxirribose. Como foi descoberto por Watson e Crick, o DNA é formado por duas cadeias que se entrela¸cam em forma de dupla hélice. As intera¸cões res-ponsáveis por manter as cadeias unidas são as pontes de hidrogênio que ligam as bases nitrogenadas especificamente e as intera¸cões hidrofóbicas. O sistema de de-teçcão espec´ıfica utilizado é a hibridiza¸cão de fitas simples de DNA, isto é, single stranded DNA (ssDNA) para formar a molécula double-stranded DNA (dsDNA). A estrutura de dupla hélice e a composi¸cão do dsDNA são representadas na Figura 1.3.

A composi¸cão de uma molécula de DNA baseia-se em cadeias formadas por um grupo fosfato P O3−₄ , uma pentose, que no caso do DNA é a desoxirribose, e uma base nitrogenada. A molécula é formada por duas fitas que se ligam especifi-camente através das pontes de hidrogênio que conectam as bases nitrogenadas : adenina (A) que se liga especificamente com a timina (T), e citosina (C) que se liga com a guanina (G). A liga¸cão entre as fitas é feita entre os grupos da termina¸cão

(23)

Figura 1.3: Estrutura e composi¸c˜ao da mol´ecula dsDNA [20].

5’ de uma das fitas dos grupos da termina¸cão 3’ da fita complementar. Os grupos fosfatos no backbone da estrutura são responsáveis pela carga negativa do DNA Dependendo do sistema biomolecular analisado os biossensores também são en-contrados na literatura com diferentes nomenclaturas como: imunossensores ou biossensores de afinidade, no caso de sistema ant´ıgeno-anticorpo, biossensores en-zimáticos, e genossensores, no caso dos ácidos nucléicos [19,21-25].

O método de imobiliza¸cão das biomoléculas receptoras ao transdutor é fundamen-tal para a especificidade e sensibilidade do dispositivo. A Figura 1.4 ilustra quatro métodos principais para imobiliza¸cão de biomoléculas na superf´ıcie de um sensor: armadilhamento em uma membrana, microencapsula¸cão em s´ıtios in-tersticiais de um gel, adsor¸cão f´ısica e liga¸cão covalente.

No primeiro caso, uma membrana semipermeável separa os receptores biológicos do meio da solu¸cão, mantendo as biomoléculas em contato com a superf´ıcie do sensor. A microencapsula¸cão é baseada no armadilhamento em uma matriz porosa,

(24)

Figura 1.4: Ilustra¸cão de 4 métodos comuns para imobiliza¸cão de bi-omoléculas: aprisionamento em membrana, microencapsulamento, adsor¸cão

f´ısica e liga¸c˜ao covalente, adaptado de [26].

ou na forma¸cão de um encapsulamento poroso, como s´ıtios intersticiais de um gel, em torno das biomoléculas. Esses métodos são comuns para biossensores eletroqu´ımicos.

A adsor¸cão f´ısica é um método direto e simples, mas depende de uma com-bina¸cão de várias intera¸cões na superf´ıcie, como for¸cas de van der Waals, for¸cas hidrofóbicas, pontes de hidrogênio e for¸cas iônicas. A vantagem de utilizar ad-sor¸cão f´ısica é que a superf´ıcie do sensor pode ser regenerada facilmente e não exige processamentos adicionais da superf´ıcie, porém o tipo de amostra a ser ana-lisada é limitado, visto que a adsor¸cão de moléculas não espec´ıficas compromete a sensibilidade do biossensor.

A imobiliza¸cão por liga¸cão covalente é baseada em processos de funcionaliza¸cão da superf´ıcie para ligar moléculas bifuncionais que sevirão de linker para a imo-biliza¸cão dos recptores de interesse. É o processo que apresenta maior eficiência em rela¸cão a resposta do biossensor, pois permite a imobiliza¸cão orientada dos receptores na superf´ıcie. A Figura 1.5 ilustra uma compara¸cão entre bioreceptores

(25)

(probes) ligados covalentemente com uma orienta¸c˜ao otimizada e probes adsorvi-dos fisicamente, os quais levam a uma perda de atividade, dificultando o processo de liga¸c˜ao espec´ıfica com os targets [19].

Figura 1.5: Representa¸cão esquemática de diferentes formas de imobiliza¸cão de biomoléculas receptoras na superf´ıcie (probes): 1) adsor¸cão, 2) imobiliza¸cão por rea¸cões aleatórias e 3) imobiliza¸cão por liga¸cão em um s´ıtio espec´ıfico da superf´ıcie, comparando a perda de atividade dos probes imobilizados pelos pro-cessos 1 e 2 em rela¸cão ao 3, que permite uma configura¸cão orientada, adaptado

de [19].

A funcionaliza¸cão da superf´ıcie consiste em formar uma camada ordenada e ho-mogênea de moléculas funcionais para liga¸cão covalente de biomoléculas sobre uma superf´ıcie limpa. O processo depende de condi¸cões do meio, como temperatura e for¸ca iônica da solu¸cão (buffer ). Torna-se necessário o uso de camadas passivan-tes, como polietilenogicol (PEG), comumente utilizado em biossensores,que servem para passivar estados eletrônicos, evitando a liga¸cão não espec´ıfica de moléculas in-desejadas. Além disso, atua como linker para a liga¸cão de biomoléculas, facilitando o processo de intera¸cão espec´ıfica com as moléculas do analito, pois é necessário que os receptores estejam a uma certa distância da superf´ıcie e orientados para que a intera¸cão com os targets possa ocorrer [19].

A Figura 3.9 apresenta uma ilustra¸cão da imobiliza¸cão orientada de DNA probe e de um anticorpo. Este precisa ter o s´ıtio ativo para liga¸cão espec´ıfica do ant´ıgeno orientado para que ocorra o reconhecimento.

Dependendo do substrato a ser utilizado (vidro ou semicondutor, por exemplo) e do tipo de biomoléculas que serão imobilizadas, existem protocolos que permitem a liga¸cão eficiente dessas moléculas [27].

(26)

(a) (b)

Figura 1.6: Representa¸cão da imobiliza¸cão orientada de (a) molécula de ssDNA e (b) anticorpo, adaptado de [19].

1.4 Modos de Transdu¸

c˜

ao

Os biossensores podem ser classificados em rela¸cão ao modo de transdu¸cão utili-zado, isto é, em rela¸cão ao tipo de propriedade f´ısica ou qu´ımica que é medida no processo de deteçcão biológica [27,28]. Os modos mais comuns encontrados em aplica¸cões cl´ınicas, ambientais e comerciais são os eletroqu´ımicos e os ópticos. (i) Biossensores eletroqu´ımicos:

Estes biossensores baseiam-se em quantificar rea¸cões bioqu´ımicas a partir da me-dida de propriedades como corrente elétrica, concentra¸cão iônica e potencial de oxi-redu¸cão. De acordo com a grandeza medida, estes biossensores são configurados de diferentes formas, podendo ser classificados em amperométricos, condutimétricos e potenciométricos. O sensoriamento eletroqu´ımico usualmente requer um eletrodo de referência, um eletrodo auxiliar e um eletrodo de trabalho, também conhecido como eletrodo sensitivo ou eletrodo redox. O eletrodo de referência, comumente feito de Ag/AgCl é mantido a uma certa distância do local ativo onde ocorre a rea¸cão, com o objetivo de manter um potencial estável e conhecido. O eletrodo de trabalho atua como elemento de transdu¸cão das rea¸cões bioqu´ımicas, o eletrodo auxiliar estabelece uma conexão com a solu¸cão eletrol´ıtica, e uma corrente pode ser estabelecida até o eletrodo de trabalho [29,30].

Nos biossensores amperométricos aplica-se um potencial entre dois eletrodos e a grandeza medida é a corrente elétrica produzida pela oxida¸cão ou redu¸cão das espécies eletroativas, dessa forma a medida pode ser relacionada à concentra¸cão

(27)

do analito [31]. Como em geral as espécies biológicas de interesse podem não ser eletroativas é comum o uso de enzimas como catalizadores da rea¸cão. Um exemplo de biossensor amperométrico é o sensor de glicose. [32] As técnicas de medidas mais comuns são a cronoamperometria, onde é aplicado um potencial fixo e a resposta da corrente gerada no eletrodo é monitorada em fun¸cão do tempo; e a voltametria c´ıclica que consiste na aplica¸cão de um potencial que varia ciclicamente com o tempo, enquanto se mede a resposta da corrente em fun¸cão do potencial aplicado [29].

No caso dos biossensores potenciométricos, uma rampa de tensão é aplicada a um eletrodo e o parâmetro medido é potencial de oxida¸cão ou redu¸cão de uma rea¸cão eletroqu´ımica. Quando a rampa de tensão é aplicada, ocorre um fluxo de corrente devido à rea¸cão e o potencial no qual as rea¸cões ocorrem pode ser relacionado a espécies particulares. A resposta do sensor é governada pela equa¸cão de Nernst:

Ecel = Ecel0 −

RT

nF ln Q, (1.1)

Ecelrepresenta o potencial observado no eletrodo da c´elula eletroqu´ımica `a corrente

nula, E_cel0 é a contribui¸cão constante para o potencial, R é a constante universal dos gases, T é a temperatura, n é o número de cargas no eletrodo da rea¸cão, F é a constante de Faraday e Q é a razão entre as concentra¸cões iônicas no anodo e no catodo. Portanto, na deteçcão potenciométrica, deve-se utilizar eletrodos ´ıons seletivos para detectar a varia¸cão na concentra¸cão de ´ıons. Os limites de deteçcão mais baixos reportados para esse modo de transdu¸cão estão entre 10−8 e 10−11 M [29].

Os biossensores condutimétricos medem a condutância ou resistência da solu¸cão, aplicando um potencial ac ao eletrodo para evitar efeitos indesejados como proces-sos faradaicos. Como as rea¸cões eletroqu´ımicas produzem ´ıons ou elétrons, os quais alteram a condutância da solu¸cão, a varia¸cão obtida pode ser então calibrada com as espécies reagentes. Esse método porém apresenta sensibilidade relativamente baixa.

Outro modo de transdu¸cão associado aos processos eletroqu´ımicos é a deteçcão elétrica feita por sensores do tipo FET, onde as rea¸cões bioqu´ımicas são integradas a um semicondutor para medidas da varia¸cão das propriedades elétricas. Esses biossensores serão discutidos na se¸cão 1.5 deste cap´ıtulo.

(28)

(ii) Biossensores ´opticos:

Os biossensores ópticos baseiam-se em métodos de transdu¸cão que devem detectar mudan¸cas em propriedades como absor¸cão, fluorescência, fosforescência, quimi-luminescência, refletividade, espalhamento da luz e ´ındice de refra¸cão. Dentre os vários métodos, os mais comuns são deteçcão por fluorescência e por técnicas baseadas em mudan¸ca do ´ındice de refra¸cão, como Ressonância de Plásmons de Superf´ıcie (SPR) [33-38].

Um dispositivo baseado em fluorescência monitora a emissão de radia¸cão ele-tromagnética, previamente estimulada por absor¸cão de radia¸cão e subsequente gera¸cão de um estado excitado que existe por um curto intervalo de tempo. As-sim, as moléculas podem ser excitadas repetidamente para emitir um sinal de-tectável. O sensoriamento por fluorescência pode ocorrer diretamente, monito-rando as biomo-léculas antes e depois de uma rea¸cão espec´ıfica, mas em geral é necessário o uso de marcadores (fluoróforos), como a prote´ına GFP (green flu-orescent protein), para as biomoléculas do analito. No entanto, a marca¸cão de biomoléculas dificulta a deteçcão de eventos localizados devido ao background de fluorescência. Além disso, o processo de marca¸cão também pode levar a perda de funcionalidade de algumas moléculas, por exemplo prote´ınas, e dificultar a in-tera¸cão espec´ıfica, causando perda de sensibilidade e especificidade neste método. Da´ı, o interesse em técnicas de deteçcão label-free [38].

O SPR é um fenômeno óptico baseado na incidência de um feixe de luz em uma interface de dois meios com constantes dielétricas de sinais opostos, como um dielétrico e um metal. A estrutura do sensor consiste no acoplamento de uma interface óptica que pode ser um prisma, guia de onda ou grade de difra¸cão, com uma fina camada metálica (geralmente ouro, ou prata). A Figura 1.7 ilustra a configura¸cão mais comum, cujo objeto óptico é um prisma.

Quando a luz incide num prisma, com o ângulo de incidência maior que um ângulo cr´ıtico θc, ocorre a reflexão interna total. Na configura¸cão do SPR, quando o

prisma é coberto por uma camada metálica, existe um outro ângulo θSP R maior

que θc, no qual ocorre a ressonˆancia. Quando o feixe incidente satisfaz a condi¸c˜ao

de ressonância, este excita uma oscila¸cão da densidade de carga (elétrons livres na superf´ıcie), conhecida como onda de plásmons de superf´ıcie, cerca de 100 nm acima e abaixo da camada metálica. A condi¸cão de ressonância depende do ângulo inci-dente, comprimento de onda e fun¸cões dielétricas do metal e do dielétrico. Neste

(29)

Figura 1.7: Representa¸cão esquemática de um biossensor baseado em res-sonância de plásmons de superf´ıcie (SPR). Nesta configura¸cão é utilizado um

prisma como objeto ´optico, adaptado de [33].

caso a intensidade da luz refletida diminui e o campo evanescente percorre o meio adjacente ao dielétrico, cerca de alguns nanometros acima da camada metálica e decai exponencialmente com a distância acima da superf´ıcie, como é indicado pela linha pontilhada na Figura 1.7. Dessa forma, o ângulo incidente ressonante no qual plásmons de superf´ıcie são excitados depende criticamente do ´ındice de refra¸cão na superf´ıcie da camada metálica, isto é na interface da camada metálica e da amostra, que pode ser uma camada de biomoléculas receptoras, isto é elemen-tos de afinidade como anticorpos e ácidos nucléicos. A liga¸cão espec´ıfica entre as biomoléculas na superf´ıcie leva a uma varia¸cão no ´ındice de refra¸cão e, portanto, no ângulo ressonante, e pode ser monitorada em tempo real [36,41].

(iii) Biossensores piezoel´etricos:

Cristais piezoelétricos são materiais que têm a propriedade de gerar um potencial elétrico em resposta à uma for¸ca mecânica aplicada ou se deformarem em resposta a um potencial aplicado. A adi¸cão de massa na superf´ıcie de um sensor baseado em um piezoelétrico leva a uma varia¸cão mensurável na frequência de ressonância do cristal. Por exemplo, no caso de um biossensor com oligonucleot´ıdeos imo-bilizados na superf´ıcie de um cristal (tipicamente quartzo) em contato com uma solu¸cão contendo targets, isto é, oligonucleot´ıdeos complementares, o processo de hibridiza¸cão (liga¸cão espec´ıfica) implicará no aumento da massa na superf´ıcie do

(30)

cristal e uma diminui¸cão proporcional da frequência de ressonância da oscila¸cão do cristal.

O tipo mais comum de biossensor piezoelétrico é a microbalan¸ca de cristal de quartzo (QCM). As principais vantagens desse modo de transdu¸cão consistem na obten¸cão econômica de dispositivos que podem ser usados na deteçcão direta e ”label-free”de ácidos nucléicos. Entretanto, a medida de varia¸cão de massa está sujeita a interferência do meio da solu¸cão (buffer ) com a superf´ıcie do cristal, o que implica em uma especificidade relativamente baixa. Existem estudos repor-tados para o desenvolvimento de biossensores baseados em QCM integrados com dispositivos para PCR (Polimerase Chain Reaction), de modo a aumentar a sen-sibilidade do sensor para limites de deteçcão de concentra¸cões na ordem de pM [42,43].

(iv) Outros modos de detec¸c˜ao:

Além dos biossensores mais comuns discutidos até agora, existem outros tipos de transdu¸cão baseados em métodos magnéticos, de ressonância acústica e espectros-copia de for¸ca usando pontas de AFM (Atomic Force Microscopy) funcionalizadas [44,45].

Também são desenvolvidos outros métodos mais simples, porém com baixa sen-sibilidade como os calor´ımetros, também conhecidos como biossensores térmicos. Estes medem a varia¸cão de entalpia em uma rea¸cão, portanto, são geralmente baseados em rea¸cões enzimáticas e são configurados a partir da imobiliza¸cão de enzimas a um sensor térmico, sendo também conhecidos como termistores en-zimáticos. Estes apresentam LOD para concentra¸cões entre 10−5 M e 10−1 M. Há também biossensores micromecânicos que monitoram varia¸cões na frequência de ressonância e mudan¸cas nas for¸cas de superf´ıcie que ocorrem devido à adsor¸cão de biomoléculas na superf´ıcie. Sensores deste tipo reportados para deteçcão de gli-cose consistem da imobiliza¸cão da enzima GOx em microalavancas e apresentam

respostas mensur´aveis na faixa de 10−2 M e 10−3 M [19].

1.5 Biossensores do tipo FET

Nas últimas décadas, o uso de biossensores baseados em dispositivos semiconduto-res de efeito de campo tem apsemiconduto-resentado grande intesemiconduto-resse devido às vantagens que

(31)

esses dispositivos apresentam em rela¸cão aos outros tipos de biossensores apresen-tados. Por exemplo, a deteçcão elétrica rápida de eventos biológicos na superf´ıcie, a possibilidade de miniaturiza¸cão e integra¸cão de arrays para produ¸cão em larga escala, a alta sensibilidade que apresentam e a deteçcão label-free, isto é, sem a necessidade de marca¸cão prévia do analito, são algumas vantagens atrativas para o estudo desses biossensores. Biossensores do tipo FET reportados na li-teratura fabricados com nanofios semicondutores ou superf´ıcies modificadas com nanopart´ıculas apresentam alta sensibilidade, com limite de deteçcão para con-centra¸cões da ordem de f M [46-49]. O processo de deteçcão ocorre por efeito do campo elétrico devido à distribui¸cão de cargas na superf´ıcie. Dessa forma, a liga¸cão espec´ıfica de biomoléculas carregadas aos receptores imobilizados na su-perf´ıcie causa uma varia¸cão na densidade de cargas e o campo elétrico resultante modula a largura da camada de deple¸cão no semicondutor, modulando, portanto, a condutância [50,51]. A seguir será descrito o princ´ıpio de funcionamento de um FET e em seguida será feita uma analogia para o mecanismo de deteçcão no biossensor.

1.5.1 Estrutura de um FET

Um transistor de efeito de campo (FET) é um dispositivo com três terminais principais gate (porta), dreno e fonte, onde a corrente entre os dois últimos é modulada pela tensão aplicada no gate. Usualmente, coloca-se um dielétrico entre o semicondutor e o contato elétrico do gate, para evitar condu¸cão direta entre eles. A configura¸cão dos portadores próximo da interface entre o semicondutor e o dielétrico dependerá da tensão aplicada e do tipo de portadores majoritários do semicondutor (elétrons para tipo-n ou buracos para tipo-p).

Para um semicondutor do tipo-p, uma tensão positiva no gate levará a uma de-ple¸cão dos buracos abaixo da superf´ıcie, enquanto que uma tensão negativa levará a uma acumula¸cão de portadores nessa região. O contrário ocorre para um se-micondutor do tipo-n, mas dependendo da tensão aplicada podem ocorrer outras configura¸cões como acumula¸cão e inversão.

A Figura 1.8 ilustra o diagrama de bandas para os modos de deple¸cão, acumula¸cão e inversão para uma estrutura capacitiva MIS (Metal-Isolante-Semicondu-tor), que constitui o dispositivo básico para o funcionamento dos FETs [52].

(32)

Figura 1.8: Diagramas de bandas de energia para uma estrutura capacitiva MIS nos modos: (a) acumula¸cão, (b) deple¸cão e (c) inversão, adaptado de [52].

O n´ıvel de Fermi EF encontra-se pr´oximo da banda de condu¸c˜ao para o

semicon-dutor do tipo-n e, próximo da banda de valência para tipo p. A aplica¸cão de um potencial negativo V < 0, Figura 1.8(a), causará um band bending para cima da estrutura de bandas, próximo da interface, o que causa um aumento na diferen¸ca de energia Ei− EF, onde Ei é o n´ıvel de Fermi intr´ınsico. Como a concentra¸cão de

buracos varia exponecialmente com a diferen¸ca Ei− EF, este band bending levar´a

a um aumento na concentra¸cão de buracos, o que corresponde ao modo de acu-mula¸cão. No caso do semicondutor tipo-n, para haver acumula¸cão de portadores deve ser aplicada uma tensão V > 0, que levará a um band bending para baixo, aumentando a diferen¸ca EF− Ei e, portanto aumento da concentra¸cão de elétrons

próximo à superf´ıcie. No modo de deple¸cão, Figura 1.8 (b), uma tensão positiva V > 0 depleta os buracos no semicondutor do tipo-p, com um band bending para baixo e uma tensão negativa depleta os elétrons no semicondutor tipo-n, com um band bending para cima. Aplicando uma tensão maior, de modo que o n´ıvel Ei

atravesse o n´ıvel de Fermi EF como ilustra a Figura 1.8 (c), ocorrer´a a forma¸c˜ao

de uma camada de inversão, com um acúmulo de elétrons (buracos) próximo à su-perf´ıcie do semicondutor tipo-p (tipo-n). A concentra¸cão de elétrons np próximo

(33)

`

a superf´ıcie no semicondutor tipo-p, por exemplo, será maior que a concentra¸cão intr´ınseca ni e a concentra¸cão de buracos pp será menor que ni.

A largura W da região de deple¸cão depende da varia¸cão de potencial na região do band bending da seguinte forma [52,53]:

W = s

2∆V0

qND

, (1.2)

é a permissividade dielétrica, q é a carga elementar e ND é a concentra¸cão de

portadores. O gráfico da Figura 1.9 a seguir apresenta a varia¸cão da largura W com ∆V0 para o semicondutor InP com diferentes concentra¸cões de portadores.

Figura 1.9: Varia¸cão da largura da região de deple¸cão em fun¸cão do potencial de band bending para InP com diferentes concentra¸cões de portadores.

Vemos que a largura da região de deple¸cão é duas ordens de grandeza maior para os casos em que a concentra¸cão de portadores é da ordem de 1014_cm−3 _{em rela¸c˜}_{ao aos}

casos com 1018 cm−3. Então, para os semicondutores mais dopados é necessária a aplica¸cão de um potencial maior na superf´ıcie para obter uma largura de deple¸cão comparável à das amostras com concentra¸cão de portadores pequena.

(34)

No FET a corrente elétrica a partir da aplica¸cão de uma tensão entre a fonte e o dreno, dependerá da tensão aplicada no gate, a qual vai modular a largura do canal de condu¸cão formado. Uma tensão VG negativa aumenta a largura da região

de deple¸cão no semicondutor do tipo-n, diminuindo a condutância do canal. Os dispositivos do tipo FET podem apresentar diferentes configura¸cões como mostra o diagrama da Figura 1.10. .

Figura 1.10: Diferentes configura¸c˜oes para dispositivos do tipo FET, adaptado de [52].

1.5.2 Estrutura do biossensor

A dependência da condutância do dispositivo com a tensão aplicada no gate faz com que os transistores de efeito de campo sejam dispositivos promissores em aplica¸cões de sensoriamento. Por exemplo o ISFET (Ion Sensitive Field Ef-fect Transistor), comumente aplicado na deteçcão de pH, é uma modifica¸cão do MOSFET (Metal-Oxide Semicondutor Field Effect Transistor ) em que o contato metálico da porta é substitu´ıdo por uma solu¸cão eletrol´ıtica e um eletrodo de referência [54,55].

No caso deste biossensor, o campo elétrico das biomoléculas na superf´ıcie pode ser associado à tensão aplicada na porta, modulando a deple¸cão ou acumula¸cão de portadores. A Figura 1.11 ilustra o funcionamento de um FET baseado em Si tipo-p. A aplica¸cão de um potencial negativo na porta leva a um acúmulo de portadores majoritários próximo à superf´ıcie e, portanto, a um aumento da condutância. Em analogia, substituindo o contato da porta por uma camada de biomoléculas com carga negativa, também ocorrerá um acúmulo de cargas positivas próximo à superf´ıcie [56].

(35)

Figura 1.11: Princ´ıpio de funcionamento de um transistor de efeito de campo, ou FET (a) e um biossensor tipo FET (b), baseados em Si. Nos dois casos, cargas negativas no contato da porta ou na superf´ıcie do nanofio levam ao aumento da

condutˆancia entre fonte (F) e dreno (D), adaptado de [56].

O processo de funcionaliza¸c˜ao da superf´ıcie constitui um fator cr´ıtico para a sensi-bilidade e especificidade do biossensor. O caso ideal para dispositivos do tipo FET ´

e a imobiliza¸cão covalente de biomoléculas na superf´ıcie limpa de um substrato se-micondutor, utilizando linkers espec´ıficos, com o objetivo de obter uma alta den-sidade de s´ıtios doadores para a liga¸cão espec´ıfica das biomoléculas. Além disso, isto permite passivar a superf´ıcie para obter uma densidade suficientemente baixa de estados eletrônicos na superf´ıcie do semicondutor, que podem interferir nas propriedades eletrônicas da heteroestrutura semicondutor/biomoléculas [57,58]. As propriedades das biomoléculas dependem fortemente das condi¸cões do meio (solu¸cão). Na estrutura de uma prote´ına, existem grupos que podem sofrer pro-tona¸cão (adi¸cão de H) ou desprotona¸cão (retirada de H), alterando a carga elétrica total da molécula. Assim, a configura¸cão de cargas depende do pH da solu¸cão [59,60].

O pH, ou potencial hidrogeniônico, está relacionado à atividade dos ´ıons H+

presentes na solu¸c˜ao:

(36)

A atividade iônica aH+ é proporcional à concentra¸cão por um coeficiente de

ati-vidade que depende da intera¸cão com os ´ıons da solu¸cão. Para solu¸cões dilu´ıdas, abaixo de 0,1 mol dm−3, o coeficiente de atividade é approximadamente 1 de modo que: aH+ ' [H+]. Desse modo:

pH = − log₁₀[H+] (1.4)

Ou seja, quanto maior a concentra¸c˜ao de ´ıons H+_{, menor o pH. O ponto isoel´}_etrico

(pI) de uma biomolécula é o pH onde ela se encontra eletricamente neutra; quando o pH é menor que o pI de uma prote´ına, esta encontra-se carregada positivamente e quando pH é maior que o pI, encontra-se carregada negativamente.

Portanto, os processos de funcionaliza¸cão da superf´ıcie, imobiliza¸cão de biomol´ e-culas e medidas de deteçcão devem ser realizados em solu¸cões tampões (buffers) para manter a for¸ca iônica do meio estável.

No caso da molécula de DNA, a concentra¸cão iônica da solu¸cão vai interferir na conforma¸cão da molécula e no processo de hibridiza¸cão. A solu¸cão comumente uti-lizada é o buffer TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethane), que possui pH 7,4, que corresponde ao pH do meio intracelular, onde as moléculas de DNA são estáveis. Como as medidas de deteçcão no biossensor do tipo FET são feitas em buffer a resposta do dispositivo também será influenciada pela concentra¸cão iônica, visto que biomoléculas carregadas serão eletricamente ’blindadas’, pelos ´ıons de carga oposta, na solu¸cão em um comprimento caracter´ıstico conhecido como compri-mento de Debye (λD). Como a molécula de DNA que possui carga negativa,

haverá por intera¸cão eletrostática a presen¸ca de ´ıons positivos da solu¸cão ao seu redor. No comprimento λD o número de cargas positivas se aproxima do número

de cargas negativas, fazendo com que o potencial eletrostático do DNA decaia exponencialmente com a distância [61]. Para solu¸cões aquosas em temperatura ambiente, o comprimento de Debye pode ser expresso como [61]:

λD =

1

p4πlBP_iρizi2

, (1.5)

lB é o comprimento Bjerrum (= 0,7 nm, para solu¸cões aquosas em 300 K), ρi é

(37)

iônicas da solu¸cão. Essa expressão mostra a dependência de λD com a concentra¸cão

iˆonica da solu¸c˜ao.

O comprimento de Debye representa um fator importante no desempenho de bi-ossensores de efeito de campo, de modo que a deteçcão será feita apenas para moléculas que estão até uma distância λD da superf´ıcie. A Figura 1.12 ilustra

uma compara¸cão do comprimento de Debye para solu¸cões com diferentes for¸cas iônicas, no caso de uma molécula de DNA imobilizada na superf´ıcie do sensor.

Figura 1.12: Representa¸cão esquemática de uma molécula de DNA imobi-lizada covalentemente na superf´ıcie de um sensor FET e os comprimentos de

Debye λD para solu¸c˜oes com diferentes for¸cas iˆonicas, adaptado de [47].

Portanto, reduzindo a for¸ca iônica do buffer, é poss´ıvel detectar eventos de reco-nhecimento biológico em comprimentos maiores acima da superf´ıcie do biossensor. A intera¸cão do buffer com a camada funcionalizada também leva a a uma varia¸cão do potencial elétrico no semicondutor devido a um efeito capacitivo que surge por conta dos ´ıons próximos a superf´ıcie. Esse efeito modula a configura¸cão dos

(38)

portadores no biossensor. Então é necessário um tempo para estabiliza¸cão quando a solu¸cão é inserida no dispositivo.

Os biossensores do tipo FET também podem ser aplicados no estudo da afinidade de liga¸cão molecular das espécies biológicas, utilizando um modelo baseado em isoterma de Langmuir [6, 40]. As constantes de associa¸cão e de equil´ıbrio podem ser quantificadas de acordo com a resposta do sensor. Resumidamente, para bi-ossensores a varia¸cão da condutância (ou resistência) pode ser ajustada a uma fun¸cão F (x), relacionada à concentra¸cão de ligantes, onde:

F (x) = Kmax· x x + Kd

(1.6)

No modelo de Langmuir, Kmax é a constante de adsor¸cão máxima das biomol´

e-culas do analito (ligantes) na superf´ıcie, e KD ´e a constante de equil´ıbrio, que

depende da intera¸cão dos ligantes com o solvente (buffer TRIS) e com os recep-tores imobilizados na superf´ıcie. Essa constante de equil´ıbrio está relacionada à afinidade de liga¸cão entre as biomoléculas, representando a concentra¸cão do ligante para a qual metade dos receptores estarão ligados [62].

1.5.3 Biossensor de InP

Foi desenvolvido anteriormente em nosso grupo, um biossensor de fosfeto de ´ındio (InP) cujo princ´ıpio de funcionamento baseia-se no dispositivo FET, mas neste caso o contato da porta é substitu´ıdo pela camada funcionalizada que contém as biomoléculas, como é ilustrado na Figura 1.13 [63,64].

Figura 1.13: Representa¸c˜ao de um (a) FET e (b) biossensor de InP do tipo FET, onde o contato da porta foi substitu´ıda por uma camada de biomaterial.

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O dispositivo foi feito com um filme fino de InP tipo-n com dopagem residual, resultando numa concentra¸c˜ao de portadores da ordem 1016_cm−3_{. A camada foi}

crescida com aproximadamente 300 nm de espessura sobre um substrato de InP semi-isolante. Nas laterais da amostra foram feitos dois contatos ôhmicos de ´ındio (In), nos quais foi aplicada uma ddp. As biomoléculas carregadas que interagem especificamente com os receptores na superf´ıcie modulam a camada de deple¸cão no filme fino semicondutor, variando a resistência do canal de condu¸cão. Essa varia¸cão é relacionada com a concentra¸cão de biomoléculas no analito.

Foram analisados 3 sistemas de intera¸cão neste biossensor: hibridiza¸cão de fitas simples de DNA complementares, a prote´ına de adesão Xf.XadA1 da bactéria Xylella fastidiosa e o anticorpo espec´ıfico Anti-Xf.XadA1, e a prote´ına CB-22 do v´ırus CTV (Citrus Tristeza Virus) com o seu anticorpo espec´ıfico 37.d.09. O processo de funcionaliza¸cão foi analisado por microscopia de fluorescência e apresentou-se eficaz para os 3 sistemas estudados. Os resultados apresentaram alta sensibilidade para deteçcão de concentra¸cões de 1 pM para o sistema DNA:DNA e de aproximadamente 2 nM para os sistemas de intera¸cão espec´ıfica das prote´ınas. A deteçcão para o sistema do CTV apresentou sensibilidade 2 ordens de grandeza maior que métodos baseados em ELISA encontrados na literatura. Para o sistema do DNA, métodos baseados em PCR apresentam deteçcão m´ınima da ordem de µM e resultados reportados para uma plataforma FET baseada em sil´ıcio amorfo apresentam sensibilidade para deteçcão de 50 nM. Desta forma, a sensibilidade neste caso é quatro ordens de grandeza menor que o valor de 1 pM encontrado no biossensor de InP de grande área [64].

Este trabalho, porém, não identificou as causas para a alta sensibilidade obser-vada para o biossensor de InP de grande área, comparável a dispositivos de maior complexidade baseados em nanomateriais. Desta forma, é necessário estudar com maior detalhe como as propriedades do semicondutor afetam a resposta e a sensi-bilidade do dispositivo.

Os principais objetivos deste trabalho incluem a prepra¸cão de biossensores de InP, com diferentes amostras (variando a espessura e a concentra¸cão de portadores do filme fino semicondutor) para avaliar a sensibilidade do dispositivo. Inclui também a análise da funcionaliza¸cão em nano escala, com medidas de potencial de superf´ıcie através do método Kelvin Probe Force Microscopy.

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A metodologia utilizada na prepara¸cão e funcionaliza¸cão das amostras, na monta-gem do biossensor e as técnicas para as medidas elétricas de deteçcão e de potencial de superf´ıcie são apresentadas no cap´ıtulo 2 desta disserta¸cão. O cap´ıtulo 3 mos-tra os resultados obtidos e no cap´ıtulo 4 é feita uma discussão com as conclusões gerais do trabalho.

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Cap´ıtulo 2

Metodologia experimental

Este trabalho consiste em estudar a sensibilidade do biossensor de InP do tipo FET, cujo modo de transdu¸cão se baseia em efeito de campo elétrico devido à densidade superficial de cargas das biomoléculas imobilizadas na superf´ıcie. A estrutura do biossensor é representada esquematicamente na Figura 2.1.

Figura 2.1: Representa¸cão da estrutura do biossensor de InP. Um filme fino de InP tipo-n é crescido sobre um substrato de InP semi-isolante. Os contatos elétrico de In (em amarelo) foram feitos nas laterais da superf´ıcie do dispositivo, definido uma área ativa (verde) do dispositivo. A parte superior da figura representa a funcionaliza¸cão com uma camada de etanolamina (azul), camada PEG, as biomoléculas receptoras imobilizadas e os ligantes que serão detectados

atrav´es de intera¸c˜ao espec´ıfica com os receptores, adaptado de [64].

A metodologia do trabalho se baseia em preparar dispositivos utilizando amostras de InP com diferentes propriedades, como espessura e concentra¸cão de portado-res. Para isso é necessário fazer os contatos elétricos, em seguida funcionalizar a

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superf´ıcie para a imobiliza¸cão das biomoléculas receptoras e realizar as medidas elétricas de deteçcão do biossensor. Também foram preparadas amostras, seguindo o protocolo de funcionaliza¸cão do biossensor [64], para análise por Kelvin Probe Force Microscopy (KPFM).

A seguir serão apresentadas as técnicas utilizadas na prepara¸cão da amostras, nas medidas elétricas do biossensor e na caracteriza¸cão das amostras funcionalizadas.

2.1 Prepara¸

c˜

ao das amostras

2.1.1 Epitaxia de Feixe Qu´ımico (CBE)

Os filmes de InP utilizados neste trabalho foram crescidos utilizando um sistema CBE, modelo Riber 32, instalado no Instituto de F´ısica Gleb Wataghin da Univer-sidade Estadual de Campinas. Um esquema simplificado do equipamento pode ser visto na Figura 2.2. Nesta técnica, o crescimento é realizado em ultra alto vácuo, mas utilizando fontes que estão na forma gasosa ou vapor a temperatura ambiente [66]. Neste sistema, trimetil-´ındio (TMI) e trietil-gálio (TEG) são utilizados como precursores do grupo III, enquanto que arsina (AsH3) e fosfina (PH3) são utili-zados como precursores do grupo V. Os vapores de organometálicos (utilizados com H2 como gás de arraste) sofrem pirólise na superf´ıcie do substrato aquecido

durante o crescimento. Já os precursores do grupo V são decompostos em um feixe molecular de d´ımeros do grupo V através de um craqueador a alta temperatura ( 1000-1100 °C) antes de entrarem na câmera de crescimento. Sil´ıcio e ber´ılio são utilizados como dopantes n e p, respectivamente. Neste caso, o controle do fluxo é feito através da temperatura da célula de efusão (tipicamente na faixa de 800-1200 °C) onde estão os elementos em fase sólida. A espessura do filme de InP é contro-lada através da varia¸cão do tempo de crescimento. Nas amostras utilizadas neste trabalho, mantivemos as condi¸cões de fluxo de TMI e PH3 constantes, e variamos a espessura, dopagem e temperatura de crescimento dos filmes de InP, conforme discutido na se¸cão 2.1.

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Figura 2.2: Esquema simplificado do sistema CBE instalado no IFGW da Unicamp. Precursores do material do grupo III (TEG e TMI), juntamente com seu g´as de arraste (H2), e precursores do grupo V (P H3 e AsH3) craqueados

termicamente são introduzidos em uma câmera de crescimento que está em alto vácuo (inicialmente em ultra alto vácuo). As paredes da câmara de crescimento são resfriadas com nitrogênio l´ıquido para ajudar a manter pressão baixa durante o crescimento e também capturar os precursores que tenham dessorvido do

substrato [67].

2.1.2 Crescimento e caracteriza¸

c˜

ao das amostras

semicon-dutoras

Para estudar a resposta do biossensor em rela¸cão às propriedades elétricas do se-micondutor, foram crescidas por Chemical Beam Epitaxy (CBE) 3 amostras de filmes finos de InP sobre substrato de InP (100) semi-isolante. Os filmes apre-sentaram dopagem residual, a qual varia dependedo das condi¸cões da câmara no sistema CBE, e uma amostra com dopagem de Si. A Tabela 2.1 ilustra as proprie-dades das amostras crescidas. A caracteriza¸cão das propriedades do semicondutor foram feitas por medidas de Efeito Hall, realizadas no sistema ECOPIA do LA-MULT/IFGW. Os valores para a concentra¸cão de portadores, mobilidade e resis-tividade apresentados na Tabela 2.1 são uma média dos resultados de 4 medidas Hall para cada amostra. Todas as amostras apresentaram concentra¸cão de porta-dores do tipo n. As amostras InP#3227, InP#3235 e InP#3228 foram crescidas com dopagem residual, a primeira amostra tem concentra¸cão de portadores da or-dem de 1015_{cm−3 e as amostras InP#3235 e InP#3228, 10}14_cm−3_{, sendo portanto}

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mais resistivas que a primeira. A concentra¸c˜ao de portadores da amostra dopada com Si ´e da ordem de 1018_cm−3_{, assim essa amostra apresenta uma resistividade}

muito pequena em rela¸c˜ao `as outras amostras. A espessura das amostras varia proporcionalmente ao tempo de crescimento no CBE.

Tabela 2.1: Valores médios para a concentra¸cão e mobilidade de portadores e resistividade do filme fino de InP. Estes valores foram obtidos através de 4 medidas Hall. Também são apresentados o tempo de crescimento das amostras

no CBE e a espessura nominal relacionada.

As amostras foram clivadas nas dimensões de 15 mm x 7 mm para a montagem do dispositivo. Nas laterais da amostra foram feitos contatos elétricos de In, através de difusão em 450 °C por 15 min em atmosfera de N2, de modo a obter

contatos ôhmicos, isto é, diminuir a barreira de potencial de contato entre o metal e o semicondutor, obtendo uma resistência de contato baixa. As curvas I x V apresentaram comportamento linear nas medidas realizadas na rampa de tensão entre -100 mV e 100 mV. Os contatos de In funcionam como contatos da fonte e dreno, em analogia com um disposito FET. O contato da porta é substitu´ıdo pela camada de biomoléculas.

2.1.3 Funcionaliza¸

c˜

ao da superf´ıcie

Para este projeto foram sintetizadas pela Thermo Scientific fitas simples de ssDNA com 80 pares de bases, com modifica¸c˜ao amina (N H2) na termina¸c˜ao 5’,

consti-tuindo as moléculas de probe ssDNA imobilizadas na superf´ıcie e utilizadas como receptores no biossensor, e fitas ssDNA complementares correspondentes, consti-tuindo as moléculas de target ssDNA utilizadas no analito nas medidas de deteçcão. Após o processamento dos contatos elétricos, as amostras foram funcionalizadas para a imobiliza¸cão dos receptores (probe ssDNA) na superf´ıcie. A Figura 2.3

(45)

mostra as etapas do protocolo utilizado. O processo de funcionaliza¸cão consiste na oxida¸cão da superf´ıcie, amina¸cão, funcionaliza¸cão com polietileno glicol e imo-biliza¸cão covalente de ssDNA [63,64].

Figura 2.3: Etapas do processo de funcionaliza¸cão da superf´ıcie: 1.Oxida¸cão; 2.Amina¸cão; 3.Camada PEG e 4.Imobiliza¸cão covalente de probe ssDNA,

adap-tado de [65].

O protocolo utilizado ´e descrito a seguir.

As amostras com os contatos el´etricos passaram por um processo de limpeza em ultra-som com acetona, isopropanol e ´agua deionizada durante 15 min em cada solvente. Em seguida foi feita uma limpeza em plasma de O2 (100 mTorr, 50 sscm,

40 Watts), por 10 min, para aumentar a densidade de grupos hidroxilas (OH) na superf´ıcie. Ent˜ao dois fios de cobre foram soldados nos contatos el´etricos.

Para a amina¸cão da superf´ıcie, isto é, gera¸cão de grupos amina (NH2), as amostras foram incubadas em uma solu¸cão de 5 M de hidróxido de etanolamina em DMSO (Dimethyl Sulfoxide), pré-aquecida por 1 h em 60 °C, com agita¸cão de 5 em 5 min para obter uma solu¸cão homogênea. A superf´ıcie da amostra foi totalmente coberta com essa solu¸cão e depois colocou-se um cover slip sobre os contatos para evitar evapora¸cão. Após 12 h, as amostras foram lavadas em DMSO, e duas vezes com água DI, depois secadas com fluxo de N2.

Após a amina¸cão da superf´ıcie, foi feito o processo de funcionaliza¸cão com po-lietilenoglicol do tipo NHS-PEG-COOH, que é uma molécula heterobifuncional com uma termina¸cão éster (NHS), que vai ligar aos grupos amina, e a outra ter-mina¸cão sendo um grupo carboxila (COOH) que vai ficar exposto para a imobili¸cão das moléculas de ssDNA. A camada PEG serve como linker para a imobiliza¸cão de probe ssDNA e como passiva¸cão da superf´ıcie contra a adsor¸cão de outras