Kelvin Probe Force Microscopy (KPFM) - Estudo das características elétricas do biossensor do ti

Kelvin Probe Force Microscopy é uma técnica associada ao AFM no modo não contato para medir intera¸cões elétricas entre a ponta e a amostra. A Figura 2.7 mostra uma representa¸cão do método. A medida é feita simultanemaente `

a medida de topografia, mas para medir a for¸ca eletrostática separadamente de outras for¸cas de intera¸cão (por exemplo van der Waals) aplica-se um potencial ac, Vac, entre a ponta e a amostra, na frequência fac que é diferente da frequência de oscila¸cão mecânica da alavanca, e um potencial VDC, que pode ser aplicado a ponta ou a amostra. O KPFM permite medir a diferen¸ca de potencial de contato VCP D, também chamado de potencial de superf´ıcie (SP) que é a nomenclatura que usaremos na apresenta¸cão dos resultados deste trabalho. A equa¸cão 2.1 mostra

Figura 2.6: Potencial de for¸ca interatômica em fun¸cão da distância entre ponta de prova e a superf´ıcie da amostra [70].

que o VCP D´e definido como a diferen¸ca entre as fun¸c˜oes trabalho da ponta, Φponta, e da amostra, Φamostra [71-73].

VCP D =

Φamostra− Φponta

e = SP (2.1)

Nas medidas de potencial de superf´ıcie, a for¸ca eletrostática leva a uma deflexão na alavanca e o sinal medido no fotodetector é enviado a um amplificador Lock -in. Um modelo simples [72] para a for¸ca eletrostática consiste em representar o sistema ponta-amostra como um capacitor de placas paralelas separadas por uma distância d no eixo z, sendo C(r) a capacitância entre a ponta e um ponto r da amostra. Como são aplicados dois potenciais: Vdc e Vac, na frequência fac, o potencial total ´

V (t) = Vdc− VCP D+ Vacsin (2πfact) (2.2)

A for¸ca eletrostática, Fel é a derivada da energia eletrostática em rela¸cão a separa¸cão z entre a ponta e a amostra. Portanto:

Figura 2.7: Representa¸c˜ao do KPFM, mostrando medidas simultˆaneas para a topografia e o potencial de superf´ıcie [74].

Fel= −1 2 ∂C(r) ∂z V 2 (t) (2.3)

Substituindo a equa¸c˜ao 2.2 na equa¸c˜ao 2.3:

Fel = − 1 2 ∂C(r) ∂z [(Vdc− VS) 2₊1 2V 2 ac] − ∂C(r) ∂z (Vdc− VS)Vacsin (2πfact) (2.4) + 1 4 ∂C(r) ∂z cos (2π(2fact))

Podemos identificar 3 termos na equa¸c˜ao 2.4: uma termo dc, um termo Ffac que

depende da frequência fac, que é o termo usado para medir o VCP D, e um termo que depende da frequência 2fac. Fel como:

onde: Fdc = − 1 2 ∂C(r) ∂z [(Vdc− VS) 2₊1 2V 2 ac] (2.6) Ffac = − ∂C(r) ∂z (Vdc− VS)Vacsin (2πfact) (2.7) F2fac = + 1 4 ∂C(r) ∂z cos (2π(2fact)) (2.8)

A equa¸cão 2.5 para a for¸ca eletrostática é válida para um sistema ponta-amostra metálico. No caso de uma amostra semicondutora o termo Ffac pode ser escrito

como:

Ffac =

QS 0

Cef fVacsin (2πfact), (2.9) onde QS é a carga superficial do semicondutor, 0 é a constante dielétrica e Cef f é a capacitância efetiva do sistema. Neste caso o termo −C(Vdc− VS) é substitu´ıdo por QS.

Podemos observar na equa¸cão 2.7 que o termo Fw da for¸ca eletrostática total é proporcional ao potencial de superf´ıcie Vs e pode ser anulado pela tensão Vdc. As- sim pode ser feita uma varredura sistemática para medir o potencial de superf´ıcie através da tensão dc aplicada [72].

A Figura 2.8 mostra um diagrama de energia representando a intera¸cão elétrica entre a ponta e a amostra e a fun¸cão trabalho, que é a diferen¸ca entre o n´ıvel de Fermi e o n´ıvel de vácuo, para os dois materiais.

Figura 2.8: Diagrama de energia: (a)ponta e amostra isoladas eletricamente; (b)contato el´etrico e (c) aplica¸c˜ao do potencia VDC para anular a diferen¸ca de

No caso (a) a ponta e a amostra estão separadas a uma distância d e estão isoladas eletricamente. Os n´ıveis de vácuo estão alinhados, mas o n´ıvel de Fermi varia de acordo com a fun¸cão trabalho. Em (b), quando as amostras são conectadas eletricamente, há uma transferência de elétrons e os n´ıveis de Fermi se alinham na situa¸cão de equil´ıbrio. Devido à transferência de cargas, há uma for¸ca eletrostática entre a ponta e amostra e um diferen¸ca de potencial de contato VCP D que é a diferen¸ca entre as fun¸cões trabalho. Em (c) é aplicado um potencial VDC de modo a anular VCP D, que é o potencial de superf´ıcie a ser medido.

Resumindo, no KPFM a for¸ca eletrostática gera uma deflexão na alavanca que é medida pelo fotodetector e o sinal é enviado a um amplificador Lock-in que separa a componente Ffac. O sistema de retroalimenta¸cão mapeia então o potencial Vdc que

anula (ou minimiza) a amplitude da for¸ca Ffac. Neste caso, o microsc´opio realiza a

medida no modo AM-KPFM (amplitude-modulation). A for¸ca eletrostática entre a ponta e a amostra leva à modula¸cão da frequência de ressonância f0 da alavanca pelas frequências fac e 2fac e portanto, ao aparecimento de bandas laterais em f0± fac e f0 ± 2fac ao redor do pico de ressonância f0. Assim, um outro modo de opera¸cão é o FM-KPFM (frequency-modulation), que consiste em anular (ou minimizar) a componente de frequência f0±fac, que também depende do potencial VDC.

As medidas de potencial de superf´ıcie apresentadas neste trabalho foram realizadas no modo AM-KPFM com o Microscópio Agilent 5500, que possui módulo MAC III com 3 Lock -ins. Foram usadas pontas metalizadas SCM-PIT/ Pt-Ir. Durante as medidas, imagens de topografia, fase e SP foram obtidas simultaneamente. O microscópio possui uma câmara para fluxo de nitrogênio. A medida é realizada após um tempo prévio da amostra na câmara em ambiente seco para diminuir efeitos de estados eletrônicos de superf´ıcie devido à oxida¸cão ou adsor¸cão de água, por exemplo.

As amostras para medidas de potencial de superf´ıcie foram funcionalizadas de acordo com o protocolo descrito no in´ıcio desse cap´ıtulo.

As imagens de SP apresentam um mapeamento do potencial de superf´ıcie em rela¸cão a um ponto de referência. Como as amostras funcionalizadas apresen- taram em geral, superf´ıcies homogêneas, não é poss´ıvel estabelecer uma região de referência para medir as varia¸cões de potencial em outras regiões da amostra. Então foi utilizada como referência uma amostra de InP, com plasma de O2, mas

sem nenhum processo de funcionaliza¸cão e uma amostra correspondente funcionalizada. As duas amostras foram montadas no mesmo suporte do microscópio. Foram feitas medidas em 3 regiões da amostra de referência e em seguida em 3 regiões da outra amostra, sem modificar os ajustes do microscópio. Desse modo foi poss´ıvel observar varia¸cões no SP médio calculado para cada amostra.

Cap´ıtulo 3

Resultados

3.1 Biossensor

A seguir serão apresentados os resultados das medidas elétricas realizadas para 4 biossensores. Foram feitas 6 medidas I x V, aplicando uma rampa de tensão de -100 mV a 100 mV e medindo a corrente, a cada 10 min. A resistência foi calculada a partir do inverso da inclina¸cão da curva. Cada ponto do gráfico obtido para a resistência em fun¸cão do tempo representa uma média dos valores de resistência calculados nas 6 curvas IxV.

O biossensor 1 foi feito com a amostra de InP#3227 que possui aproximadamente 70 nm de espessura nominal e concentra¸cão de portadores da ordem de 1015_cm−3_. A Figura 3.1 mostra as medidas de resistência em fun¸cão do tempo do biossensor 1.

Inicialmente, para a calibra¸cão da resposta do dispositivo, foi feita uma medida com buffer TRIS, 1 h depois de adicionar a solu¸cão na célula l´ıquida. A Figura 3.1 ilustra que a resistência do dispositivo com o buffer TRIS estabiliza em R0= (0,739 ± 0,003) MΩ após 20 min a partir do in´ıcio da medida. A barra de erro para o primeiro ponto do gráfico apresenta-se maior que nos demais (onde não é vis´ıvel na escala utilizada) devido à intera¸cão dos ´ıons da solu¸cão com a superf´ıcie. Depois da medida de calibra¸cão, a solu¸cão com buffer TRIS foi removida e substitu´ıda por uma solu¸cão de TRIS contendo as móleculas de target ssDNA com concentra¸cão de 10 pM, a qual foi a menor concentra¸cão utilizada nas medidas do biossensor.

Observamos que ap´os 30 min a partir do in´ıcio da medida, a resistˆencia estabilizou em um valor maior que R0.

Figura 3.1: Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 1, mostrando inicialmente a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os experimentos de

titula¸c˜ao com target ssDNA.

Depois de 1 h de medidas com esta concentra¸cão, a solu¸cão na célula l´ıquida foi substitu´ıda pela solu¸cão com target ssDNA na concentra¸cão de 20 pM. O mesmo procedimento foi realizado para as concentra¸cões de 30 pM e 50 pM. Não observamos a estabiliza¸cão da resposta na concentra¸cão de 50 pM pois o tempo de medida foi menor, obtendo apenas três pontos. Visto que a varia¸cão da resistência em rela¸cão às medidas com a concentra¸cão anterior (30 pM) foi pequena, as medidas indicam que a satura¸cão da reposta do biossensor ocorre na concentra¸cão de 50 pM, isto é, os receptores na superf´ıcie já estão preenchidos de modo que a adi¸cão de mais ligantes não modifica a deple¸cão do canal de condu¸cão e portanto não observaremos um aumento na resitência com a di¸cão de concentra¸cões maiores de target DNA.

A Figura 3.2 ilustra a varia¸c˜ao relativa ∆R

R0 de cada ponto em rela¸c˜ao ao valor de ca-

libra¸cão R0, para as concentra¸cões de 10 pM a 50 pM, em fun¸cão do tempo. Como a resistência establilizou após 30 min a partir da adi¸cão de cada concentra¸cão, assumimos que este é o tempo de resposta do dispositivo.

Figura 3.2: Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão do tempo, a partir da adi¸cão de target em concentra¸cões entre 10 pM e 50 pM para o

biossensor 1.

O aumento da resistência a partir da adi¸cão de DNA indica que o dispositivo funciona no modo depletado, isto é, as cargas negativas do DNA na superf´ıcie provocam um band bending no potencial ∆V0, na interface entre o semicondutor e a camada funcionalizada, de modo que esta varia¸cão no potencial vai modular a largura da camada de deple¸cão. Aumentando a quantidade de cargas negativas na superf´ıcie, esperamos que a largura da camada de deple¸cão aumente, já que o semicondutor é do tipo n. Consequentemente, a resistência deve aumentar. A Figura 3.3 ilustra a resposta ∆R_R

0 em fun¸c˜ao da concentra¸c˜ao de target DNA no

analito para o biossensor 1 . Cada ponto do gráfico é uma média dos 3 últimos valores obtidos nas medidas elétricas para cada concentra¸cão de DNA. A curva verde apresenta um ajuste pelo modelo de isoterma de Langmuir (equa¸cão 3.1), que permite obter a constante de afinidade de liga¸cão entre as biomoléculas no equil´ıbrio. Assim, a resposta ∆R_R

0 do biossensor foi ajustada `a fun¸c˜ao:

F (x) = Km´ax· x x + Kd

(3.1)

Kmáx representa a constante de adsor¸cão máxima de ligantes (target ssDNA na superf´ıcie e KD é uma constante de equil´ıbrio que representa a afinidade de liga¸cão

Figura 3.3: Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão da concentra¸cão de target DNA para o biossensor 1. Os pontos representam a média da resposta do biossensor após a estabiliza¸cão em cada concentra¸cão de target e as barras de erro representam o desvio da média. A curva verde representa o ajuste realizado pela fun¸cão f (x) = Kmax· x/(x + KD) do modelo de isoterma

de Langmuir.

entre os ligantes (target ssDNA) e receptores (probe ssDNA) na superf´ıcie. Os valores obtidos atrav´es do ajuste com a isoterma de Langmuir foram: Km´ax = (35 ± 2) e KD = (16 ± 2) pM.

O biossensor 2 foi feito com a amostra de InP#3235, que apresenta a mesma espessura da amostra do biossensor 1, por´em a dopagem residual apresentou uma concentra¸c˜ao de portadores (N ) mais baixa que o primeiro. Neste caso temos N '1014 cm−3 .

A Figura 3.4 ilustra as medidas de resistência em fun¸cão do tempo para as medidas com o buffer e em seguida com concentra¸cões de target ssDNA de 10 pM, 20 pM e 30 pM. Na calibra¸cão com o buffer TRIS, o valor encontrado para R0 foi (4, 27 ± 0, 01)M Ω. Após 40 min de medidas, foi inserida a solu¸cão com target ssDNA 10 pM, e similarmente ao biossensor 1 a resistência aumentou.

Com a adi¸cão de solu¸cões com 20 pM e 30 pM, não verificamos varia¸cões signi- ficativas em rela¸cão à resistência medida na primeira concentra¸cão, o que indica

que a resposta deste dispositivo saturou para 10 pM, diferentemente do biossensor 1. Além disso o valor da resistência estabilizou 40 min após a adi¸cão de cada concentra¸cão. Assim, este biossensor apresentou um tempo de resposta maior que o primeiro.

Figura 3.4: Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 2, mostrando inicialmente a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os experimentos de

titula¸c˜ao com target ssDNA.

A Figura 3.5 apresenta a resposta ∆R_R

0 em fun¸c˜ao do tempo para as medidas com

target. Observamos que a concentra¸cão de 10 pM fornece uma varia¸cão de aproximadamente 18 % no valor da resistência, mas a varia¸cão para as concentra¸cões 20 pM e 30 pM não foi significativa, com as resistências permanecendo próximas do valor para 10 pM.

A Figura 3.6 ilustra as medidas de resistência em fun¸cão do tempo na calibra¸cão com buffer e nos experimentos de titula¸cão com target em concentra¸cões entre 10 pM e 10 µM para o biossensor 3, que foi feito com a amostra InP#3228, cuja dopagem residual também apresentou uma concentra¸cão de portadores da ordem de 1014_cm−3_{, mas a espessura da amostra foi de ' 140 nm, sendo o dobro da} espessura das duas primeiras amostras.

Como pode ser observado na Figura 3.6, o valor médio para R0 encontrado nas medidas com o buffer TRIS foi de (1, 28 ± 0, 01) MΩ. Após a adi¸cão de target

Figura 3.5: Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão do tempo, a partir da adi¸cão de target ssDNA em concentra¸cões entre 10 pM e 30 pM para

o biossensor 2.

Figura 3.6: Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 3, mostrando inicialmente a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os experimentos de

ssDNA, variando a concentra¸cão de 10 pM até 10 nM, não observamos uma varia¸cão significativa na resistência, isto é, a varia¸cão em rela¸cão ao valor calibrado R0 foi menor que 10%, o que está dentro da faixa de resposta para medidas não espec´ıficas em experimentos realizados anteriormente com o biossensor de InP [63]. A Figura 3.7 apresenta a resposta ∆R_R

0 para os experimentos de titula¸c˜ao, onde

notamos varia¸cões menores que 10% para concentra¸cões de até 10 nM. Quando adicionamos a concentra¸cão de 1 µM, a resposta aumentou para 20%, o qual foi o valor encontrado para os dois primeiros biossensores. Aumentando a concentra¸cão para 10 µM, ocorre a satura¸cão da resposta.

Figura 3.7: Gráfico da varia¸cão relativa da resistência em fun¸cão do tempo, a partir da adi¸cão de target ssDNA em concentra¸cões entre 10 pM e 10 µM para

o biossensor 3.

O biossensor 4 foi feito com a amostra InP#3154, dopada com Si, que apresentou concentra¸cão de portadores da ordem de '1018 cm−3 e tem maior espessura (aproximadamente 300 nm). A Figura 3.8 ilustra as medidas de resistência em fun¸cão do tempo para este biossensor.

O valor da resistência com o buffer TRIS estabiliza em R0 = (150, 706 ± 0, 002)Ω. Porém após a adi¸cão de concentra¸cões de DNA 10 pM e 50 pM, a resistência pra- ticamente não varia, ou seja, o campo elétrico das moléculas de DNA na superf´ıcie não é suficiente para modular a largura da camada de deple¸cão.

Figura 3.8: Medidas de resistência em fun¸cão do tempo para o biossensor 4, mostrando a estabiliza¸cão com buffer TRIS e os experimentos de titula¸cão com

target ssDNA nas concentra¸c˜oes de 10 pM e 50 pM.

No documento Estudo das características elétricas do biossensor do tipo FET baseado em InP (páginas 49-62)