ANGIOGÊNESE E VEGF

Os vasos sanguíneos são formados durante o desenvolvimento embrionário pela vasculogênese, onde uma rede vascular primitiva é estabelecida a partir de células precursoras, chamadas angioblastos. Estas células se diferenciam em células endoteliais, formam lumens e originam os vasos sanguíneos. No indivíduo adulto, o processo de formação dos vasos sanguíneos é conhecido como angiogênese, onde a neovascularização ocorre a partir de vasos preexistentes (CLAPP et al., 2009; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; CARMELIET, 2003).

A angiogênese está envolvida em importantes processos fisiológicos que demandam maior aporte sanguíneo, como a embriogênese e alterações associadas ao ciclo reprodutivo feminino. Está presente também, em eventos patológicos, como as reações inflamatórias, isquemia e crescimento tumoral; e pode resultar de uma hipertrofia, distensão luminal e colateralização em resposta a situação de estresse, onde o fluxo sanguíneo foi redirecionado, devido à estenose ou obstrução dos vasos distais (CLAPP et al., 2009; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).

A morfogênese vascular envolve uma complexa interação entre as células endoteliais e o ambiente extracelular (UCUZIAN et al., 2010). As células endoteliais proliferam, passam por ativação, migração, alinhamento, formam tubos, ramificações e anastomoses. Todo esse processo tem início com a dilatação de vênulas preexistentes, as quais podem sofrer brotamento ou intussuscepção, em que os capilares se dividem por colunas de células periendoteliais, originando dois ou mais vasos (CLAPP et al., 2009; CARMELIET, 2003; CHUNG et al., 2000).

As etapas da angiogênese envolvem vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular em resposta ao óxido nítrico e VEGF. A partir daí, as células endoteliais migram, impulsionadas pelo VEGF, angiopoietina-1, angiopoietina-2, fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), além de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento transformador β (TGF-β) (ADAMS; ALIKATO, 2007; LAMALICE; LE BOEUF; HUOT, 2007). Proteases serão liberadas pelas células endoteliais, incluindo ativadores do plasminogênio, metaloproteinases da matriz (MMP), heparinase, catepsinas, entre outras, alterando a composição da matriz extracelular, permitindo suporte e orientação para migração das células endoteliais, além da extensão de brotos (SERINI; VALDEMBRI; BUSSOLINO, 2006). Eventualmente, esses brotos irão se unir e se converter em tubos, comandados por uma proteína da matriz extracelular, a estatina vascular endotelial (CLAPP et al., 2009; KAMEI et al., 2006).

Com o restabelecimento do fluxo sanguíneo, os níveis de oxigênio serão elevados, diminuindo a expressão do VEGF local e inibindo a proliferação de células endoteliais. Estes eventos, em conjunto com o recrutamento de pericitos e deposição de membrana basal subendotelial, promovem a maturação dos vasos sanguíneos neoformados (CLAPP et al., 2009; ARMULIK; ABRAMSSON; BETSHOLTZ, 2005).

Os vasos sanguíneos, que se desenvolvem em resposta a estímulos patológicos, como inflamações, infecções, tumores, traumas, são anormais, em relação a sua estrutura e organização. Eles são distribuídos de maneira irregular, formam shunts (comunicação anormal artério-venosa), são estruturalmente e funcionalmente heterogêneos e, em geral, são muito permeáveis ao plasma e suas proteínas (JANICE et al., 2007). Esses vasos neo formados, podem ser observados por microscopia de luz, onde os vasos sanguíneos são evidenciados, a partir do uso de anticorpos com afinidade pelas células endoteliais (MATOS, 2010; DAVEY et al., 2008).

Mecanismos fisiológicos celulares e moleculares asseguram que o sistema de vasos sanguíneos se ramifique nos tecidos em todas as direções, suprindo as necessidades locais durante o desenvolvimento normal e também em circunstâncias patológicas. A hipóxia compreende um importante estímulo para o crescimento de novos vasos sanguíneos, pois uma vez detectada falta de oxigênio em qualquer tipo de célula será desencadeado um mecanismo homeostático, visando assegurar que os vasos sanguíneos penetrem em cada região do corpo (CLAPP et al, 2009; CARMELIET, 2003).

Quando ocorre redução nos níveis de oxigênio, as células aumentam a expressão do fator regulador de hipóxia (HIF-1 α), um importante fator de transcrição nuclear que, por sua

vez, irá estimular a produção de vários fatores envolvidos nas diferentes etapas da angiogênese, incluindo o VEGF, angiopoietina 1 e 2 e óxido nítrico (NG et al, 2011; ALBERTS et al, 2006).

Estudos têm documentado a natureza altamente vascular da periodontite e o VEGF tem sido avaliado no fluido gengival de pacientes com doenças periodontais, onde foi observado aumento de sua expressão (SANTOS, 2009). Em um estudo, realizado por Ng (2007), em que foram examinados espécimes gengivais saudáveis e com periodontite, através de imuno-histoquímica, foi observado, que as expressões do VEGF e HIF-1 α estavam aumentadas em bolsas periodontais, quando comparadas com gengivas saudáveis, demonstrando, assim, um possível envolvimento dessas proteínas na regulação do metabolismo angiogênico, progressão da doença e processo de destruição tecidual.

O VEGF é um potente fator indutor da angiogênese. Atua como regulador da permeabilidade vascular, indutor da proliferação e migração de células endoteliais, além de promover a expressão de proteínas anti-apoptóticas nessas células. É considerado a substância mais importante da neovascularização fisiológica e patológica (OLIVEIRA et al., 2007).

O VEGF é uma glicoproteína homodimérica de 45kDa. Foi mapeado no cromossomo 6p21.3 e compreende uma família de proteínas que incluem o VEGF-A ou VEGF, - B, -C, -D, -E. Possui cinco principais isoformas distintas, denominadas: VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165,

VEGF 189 e VEGF 206. Onde o VEGF 165 é a isoforma mais frequente e a mais mitogênica

(PRADEEP et al., 2011; MITROU et al., 2009).

A expressão do VEGF é estimulada por citocinas, fatores de crescimento, como por exemplo, TGF-α, TGF-β, PDGF, FGF, PGE, IL-1, IL-6 e IL-8, endotoxinas, hormônios e potencializada em resposta à hipóxia tecidual. É secretado por células mesenquimais e possui receptores específicos nas células do endotélio vascular. O VEGF se liga aos seus receptores (VEGF-R2), induzindo a formação e proliferação de células endoteliais e posteriormente induz a formação de tubos, uma característica dos capilares. A maturação e a elaboração de estruturas mais complexas ficam sob a responsabilidade das angiopoietinas, que interagem com receptores Tie-2 das células endoteliais (MITROU et al., 2009; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; FERRARA et al., 2004).

A doença periodontal inflamatória crônica apresenta intensa vascularização dos tecidos de suporte dos elementos dentários. Essa vascularização periodontal é profundamente afetada durante a progressão da doença, em virtude do aumento da expressão de várias citocinas e fatores de crescimento reguladores da angiogênese, incluindo o VEGF, que é

abundante na maioria dos tecidos inflamados, podendo desempenhar um papel crítico na regulação da doença periodontal (OLIVEIRA et al., 2007; CETINKAYA et al.,2007).

O VEGF tem sido detectado em tecidos periodontais, nas células endoteliais, células plasmáticas e macrófagos, além de epitélio sulcular e juncional. A expressão do VEGF pode ser induzida ainda, por patógenos periodontais, que podem aumentar a expressão de VEGF em fibroblastos gengivais além da redução, nos níveis de angiopoietina-1, em gengivas inflamadas, que também podem aumentar a atividade do VEGF (PRADEEP et al., 2011; CETINKAYA et al.,2007).

Embora as células endoteliais sejam o alvo principal do VEGF, seus efeitos sobre o recrutamento dos osteoclastos também tem sido investigados. Evidências demonstraram, crescente ligação entre a angiogênese e a remodelação óssea, uma vez que receptores, fenotipicamente semelhantes para o VEGF, foram identificados nas células endoteliais e nos osteoclastos. Adicionalmente, o VEGF possui atividade sobre linfócitos, granulócitos, monócitos e também interfere na sobrevivência e atividade dos osteoblastos e osteoclastos (MITROU et al., 2009; ALDRIDGE et al., 2005; NAKAGAWA et al., 2000).

Em condições inflamatórias, como a doença periodontal, são expressos diversos mediadores, como IL-1, MMP e catepsinas K, capazes de ativar outros mediadores como o RANK e TNF-α, que estão diretamente ligados a reabsorção óssea. Além disso, pode estar presente também, o VEGF, que apresenta poder quimiotático, para células mononucleares, que, por sua vez, podem se diferenciar em osteoclastos, intensificando a osteoclastogênese (ALDRIDGE et al., 2005; NAKAGAWA et al., 2000).

Alguns estudos referem que, o VEGF pode participar da remodelação e reparo dos tecidos, mostrando uma possibilidade, deste fator estar relacionado com a homeostase, e processo de cura das lesões. Predeep et al. (2011) realizaram um estudo com 30 indivíduos adultos, saudáveis e com periodontite crônica induzida por biofilme, em que compararam os níveis de VEGF em fluido gengival com níveis de VEGF séricos. Observaram que a concentração do VEGF, tanto em fluido crevicular gengival quanto em soro, é mais elevada nos pacientes com periodontite crônica. Além disso, observaram ainda que as concentrações séricas do VEGF, em fluido crevicular gengival, aumentaram proporcionalmente com a severidade da doença periodontal, sugerindo a atuação do VEGF, como uma molécula participante da destruição periodontal.

2.3 HIPÓXIA E O FATOR INDUZIDO POR HIPÓXIA - 1 ALFA ( HIF - 1 α)

A hipóxia é uma redução no nível normal de tensão de oxigênio nos tecidos e ocorre durante vários processos fisiopatológicos (HONG; LEE; KIM, 2004). A capacidade de perceber e reagir a mudanças na concentração de oxigênio é uma propriedade fundamental de todas as células nucleadas. Várias situações clínicas, como inflamações e infecções, podem ocasionar uma diminuição na luz das artérias, arteríolas, vênulas e capilares, reduzindo o fluxo sanguíneo, levando a um quadro inicial de isquemia resultando em hipóxia tissular (SUPPA, 2009).

Em resposta às modificações de tensão de oxigênio, as células expressam genes específicos que irão sintetizar proteínas responsáveis por manter a homeostase tecidual. Um grupo de proteínas que realiza essa função compreende o complexo HIF-1 α, encontrado em células de mamíferos, o qual possui um papel central nas respostas celulares e sistêmicas à hipóxia (SEMENZA, 2011; SUPPA, 2009).

O gene HIF-1 está localizado no cromossomo 14q21 e contém 15 éxons. Foi descoberto, em células humanas em 1988, através da identificação de um elemento de resposta à hipóxia (HRE) presente no gene da eritropoietina (EPO), hormônio que controla a produção de eritrócitos e sofre transcrição induzida por hipóxia. Além de ser considerado como um regulador da eritropoietina, o HIF-1 também é responsável pela liberação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o qual estimula a angiogênese e enzimas glicolíticas que adaptam o metabolismo celular à condição de hipóxia (SEMENZA, 2011; FERREIRA, 2009).

O HIF-1 é reconhecido como um fator de transcrição heterodimérico, pertencente a família PAS (PER-ARNT-SIM), composto por uma subunidade alfa (HIF-1 α) e uma subunidade beta (HIF-1 β), ambas com estruturas básicas hélice-alça-hélice (bHLH) (figura 1). A subunidade alfa é regulada pelo nível de oxigênio, sendo degradada rapidamente em condições normais e estabilizada pela hipóxia; enquanto a subunidade beta é expressa constitutivamente. A molécula apresenta ainda dois domínios funcionais de degradação (NODDD e CODDD) e dois domínios de ativação (NAD e CAD) (figura 1). (KE; COSTA, 2006; SCHOFIELD; RATCLIFFE, 2004).

Figura 1. Estrutura esquemática do HIF. Proteína básica hélice-alça-hélice (bHLH); constituída de duas subunidades (α e β), domínio Per-Arnt-Sim (PAS); domínios de degradação (NODD e CODD); domínios de transativação (NAD e CAD). (SCHOFIELD; RATCLIFFE,2004).

Em condições de normóxia, o HIF é degradado por uma enzima intracelular, a prolil hidroxilase (PHD), enquanto que, em condições de reduzida concentração de oxigênio, essa enzima é inibida, favorecendo a união entre as subunidade α e β, formando um heterodímero, que se desloca para o núcleo da célula com o intuito de ativar a transcrição de vários genes, cujas proteínas estão envolvidas em mecanismos homeostáticos, fisiológicos e patológicos, como, por exemplo, genes codificadores da eritropoietina, transferrina, endotelina, hemoxigenase e VEGF (figura 2) (FERREIRA, 2009; SCHOFIELD; RATCLIFFE, 2004).

Figura 2. Produtos proteicos com evidências de ativação pelo HIF (SCHOFIELD; RATCLIFFE, 2004).

Na presença do oxigênio, a inativação do HIF-1 α ocorre a partir da hidroxilação de aminoácidos específicos (prolina) pela enzima prolil-hidroxilase, dentro de sua subunidade α. Essa hidroxilação promove a interação, com a proteína do gene supressor de tumor, Von Hippel-Lindau (VHL), levando a degradação do HIF-1 α por sistema ubiquitina-proteassoma (figura 3) (SEMENZA, 2011; RATCLIFFE, 2007).

O gene VHL codifica um componente de reconhecimento da ubiquitina ligase, responsável em direcionar o HIF-1 α para a via ubiquitina-proteassoma (figura 3). Quando a proteína Von Rippel-Lindau (pVHL) é inativada, o HIF-1 α será estabilizado, ocorrerá união do heterodímero α e β a um elemento de resposta a hipóxia (HRE) presente no núcleo e a cascata transcricional será ativada (figura 3) (CARROLL; ASHCROFT, 2005).

Figura 3. Regulação do HIF-1α em normóxia e hipóxia. Em normóxia, o HIF-1α é hidroxilado pela prolina hidroxilase (PhD1, 2 e 3). HIF-1α hidroxilados (OH) será reconhecido pela proteína von Hippel-Lindau, que, juntamente com um complexo ubiquitina ligase, permitirá o reconhecimento pelo proteassoma com posterior degradação. Em resposta à hipóxia, a hidroxilação de prolina é inibida. O que leva a acumulação do HIF-1α e translocação para o núcleo. Lá, o HIF-1α dimeriza com HIF-1β, liga-se a elementos responsivos a hipóxia (hRes) dentro dos promotores dos genes-alvo, recruta co-ativadores, como p300/CBP, para que seja então ativada a cascata transcricional (CARROLL; ASHCROFT, 2005).

É reconhecido que, na doença periodontal, a inflamação ocasiona dano endotelial, falha na microcirculação e redução no fornecimento de oxigênio local. Além disso, os lipopolissacarídeos (LPS) e outros fatores de virulência de patógenos periodontais podem, também, aumentar a infiltração das células inflamatórias, o que contribuirá, ainda mais, para o déficit de oxigênio local. Em consequência poderá acontecer uma maior expressão de HIF-1 α, que, por sua vez, conduzirá a liberação de fatores angiogênicos, principalmente do VEGF; na tentativa de restabelecer a homeostase nos tecidos periodontais inflamados (LEE et al., 2004; PAPANDREOU et al, 2005; DEHNE, BRUNE et al, 2009).

Embora pouco estudado em doenças periodontais, alguns autores como Jing-Ping et al. (2011) estudaram a participação do HIF-1 α nessa doença, através de um trabalho, em que utilizaram fibroblastos humanos, obtidos a partir de biópsias gengivais. Esses fibroblastos foram expostos, a condições de normóxia e hipóxia, assim como também ao LPS bacteriano. Foi verificada a expressão do HIF-1 α, por meio de PCR, onde detectaram a expressão deste, em ambas as condições de concentração de oxigênio; porém, essa expressão, era consideravelmente mais elevada, quando os fibroblastos foram expostos ao LPS. Assim, esses autores demonstraram existir, a participação do HIF-1α, nos processos biológicos dos tecidos periodontais, e quando, na presença de alguns eventos, além da hipóxia, como, por exemplo, a ação do LPS, a sua acumulação e ativação, também podem ser desencadeados.

3 PROPOSIÇÃO

O objetivo do presente trabalho consistiu, em analisar descritiva e comparativamente, por meio de imuno-histoquímica, a expressão das proteínas VEGF e HIF-1 α, em espécimes de periodontite crônica, gengivite crônica e gengivas saudáveis; com a finalidade de contribuir para um maior entendimento, quanto à participação destas proteínas, na patogênese e progressão da doença periodontal.