UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ROSEANE CARVALHO VASCONCELOS
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS VEGF e HIF-1
α
NA DOENÇA PERIODONTAL
ROSEANE CARVALHO VASCONCELOS
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS VEGF E HIF-1 α NA
DOENÇA PERIODONTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel
Vasconcelos, Roseane Carvalho.
Análise imuno-histoquímica das proteínas VEGF e HIF-1α na doença periodontal / Roseane Carvalho Vasconcelos. – Natal, RN, 2012.
91 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel.
Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1. Doenças Periodontais – Dissertação. 2. Imuno-histoquímica – Dissertação. 3. Inflamação – Dissertação. 4. Fator de crescimento endotelial vascular – Dissertação. I. Gurgel, Bruno César de Vasconcelos. II. Título.
Aos meus filhos queridos, Sarah e Julius
Sarah e Julius
Sarah e Julius, razão da minha felicidade; por
Sarah e Julius
todo amor e alegria, que preenchem a minha vida.
À minha querida mãe, Ana Maria
Ana Maria
Ana Maria
Ana Maria, minha melhor e mais fiel amiga; pelo
amor e por sempre participar ativamente da minha vida. O meu primeiro e
maior exemplo, o meu alicerce, fonte da minha força e coragem.
A Deus, por me dar tanto, saúde, amor e paz. Por me guiar durante toda a vida. Por conceder discernimento nestes anos de estudo, e permitir que eu chegasse até aqui.
Ao meu orientador, Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel, pelo desafio de ter me aceitado como sua primeira orientanda de mestrado. Por todas as correções deste trabalho, pela atenção, dedicação, paciência e contribuição para meu aprimoramento profissional.
À Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, por quem tenho grande admiração e respeito, agradeço pelo apoio e por me ajudar desde a graduação. É um privilégio e uma honra ser sua aluna.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Dra. Roseana de Almeida Freitas, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Ericka Janine da Silveira, Dra. Ana Miryam de Medeiros, Dra. Hébel Cavalcante Galvão, Dra. Márcia Costa Miguel, Dra. Lélia Batista de Souza, Dr. LeãoPereira Pinto e Dr. Manuel Gordón. Agradeço a todos, pelos conselhos e ensinamentos, que contribuíram para o meu crescimento acadêmico e profissional.
Aos meus queridos colegas do mestrado, Pedro Carlos, por sua amizade despretensiosa e sincera; Dmitry, que tanto me auxiliou nas dificuldades bioestatísticas; e também a Lucileide e Edilmar, pela amizade, e por todos os momentos que passamos juntos, e em especial às queridas “xx’s”; com quem irei conviver mais alguns anos no doutorado,
Clarissa, Ana Luiza, Bárbara, Natália e Denise. Quando Deus criou as amigas, fez pensando em termos pessoas queridas, em quem pudéssemos confiar. Alguém, com nobres sentimentos, com quem pudéssemos compartilhar nossas vitórias e fracassos. E que ao final de cada trecho percorrido, não houvesse rivalidade, mas, um sentimento de carinho, que impulsionasse a caminhar juntas, sempre.
À Dra. Bruna Amaral e a Dra. Bruna Rafaela, que gentilmente forneceram materiais necessários para a realização deste trabalho.
Ao Dr. Cassiano, pela atenciosa contribuição com as análises estatísticas.
Ao Dr. Kenio, pelos ensinamentos que me foram transmitidos desde a graduação. Aos demais colegas do Programa de Pós-Graduação, Adriana Gomes, Adriana Costa, Águida, Alessandra, Ana Rafaela, Aparecida, Cyntia, Emília, Felipe, Fernando, Joabe, Keila, Maiara, Nazareno, Pedro Paulo, Rodrigo e Stefânia. E especialmente a
Emeline, uma das pessoas mais doces e solícitas que já conheci, com quem convivo desde a graduação. A todos vocês, muito obrigada pelos momentos agradáveis de descontração, e oportunidades de crescimento profissional.
Aos funcionários da Pós Graduação, Sandrinha, Hévio, Ricardo e Canindé, que muito contribuíram com a parte laboratorial deste trabalho.
À Patrícia pela receptividade, pela forma organizada de trabalhar e pela atenção com que sempre nos recebe na clínica de diagnóstico oral. E ao Lauro, por ajudar em nossos atendimentos, realizando nossos exames de imagem.
À Gracinha, sempre simpática e atenciosa; Lourdinha, que com seu bom humor torna os dias mais alegres e Idelzuíte pela solicitude.
À Severa, que desde a graduação, diariamente me recebe com simpatia e gentileza, compreende a minha pressa, e zela por minha alimentação fora de casa.
Ao Dr. Euler, por suas orientações coerentes, em minha banca de qualificação.
À Cecília, Ossian, Marcone, Priscila e demais funcionários da biblioteca, que sempre me atenderam com atenção e competência.
Ao meu irmão Robson, pela serenidade com que escuta as minhas dúvidas, e pela paciência em atender as minhas apressadas solicitações.
Ao meu querido tio Prof. Annecildo Batista de Carvalho, pelas correções deste trabalho, pelos conselhos, e pelas palavras de estímulo e carinho. Tenho orgulho de ser sua sobrinha. Obrigada por estar sempre comigo.
À minha amiga, Suzete Rovira, quem compartilha comigo, momentos especiais da minha vida profissional e pessoal. Obrigada por sua presença, seu apoio e acolhimento, na sua casa e em sua família. Guardarei nossa amizade, sempre de uma forma muito especial.
Às minhas queridas amigas, Ana Flávia e Caroline, pelas conversas, pelas horas divertidas que passamos juntas, e pela presença de vocês em minha casa. Nossa amizade tornou minha caminhada mais leve e fácil.
A Olívio Jorge, pelos momentos alegres que eu tenho em sua companhia.
À Ivone Jales, professora da minha primeira graduação, e hoje minha amiga de profissão. Exemplo de dedicação e competência profissional. Obrigada por compreender os motivos da minha ausência.
À Secretaria de Saúde e a Prefeitura Municipal de Santo Antônio, pela licença concedida. E a todos os colegas, funcionários dessas instituições, que me ajudaram e entenderam as razões do meu afastamento.
Ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN e à CAPES, pelo incentivo financeiro, que possibilitou a realização deste trabalho.
“As pessoas mais felizes não têm as
melhores coisas. Elas sabem fazer o
melhor das oportunidades que aparecem
em seus caminhos.”
RESUMO
A doença periodontal é uma condição infecciosa e inflamatória complexa em que a resposta imune do hospedeiro, frente aos produtos microbianos, pode conduzir à progressão da doença. A agressão tecidual induz a liberação de moléculas reguladoras, que desempenham papéis protetores e/ou destrutivos, incluindo as proteínas VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular) e o HIF-1 α (Fator induzido por hipóxia -1 α). Diante disso, este estudo buscou analisar, de forma quantitativa e comparativa, a expressão imuno-histoquímica destas proteínas, envolvidas nos processos de angiogênese e hipóxia, observadas em condições inflamatórias. Para tanto, 75 amostras de tecidos gengivais foram examinadas. Destas, 30 foram de periodontite crônica, 30 de gengivite crônica e 15 de gengivais saudáveis. Foram contadas, as células inflamatórias e endoteliais, positivas e negativas, no tecido conjuntivo fibroso, e posteriormente, convertidas em porcentagem. Os dados foram analisados estatisticamente por meio do teste de Kruskal-Wallis e Correlação de Spearman. Os resultados mostraram imunoexpressão para ambas as proteínas. Foi observada, uma elevada imunoexpressão para HIF-1 α, nos espécimes de periodontite e gengivites crônicas, em relação aos sítios saudáveis, porém, sem diferenças estatísticas entre elas (p>0,05). A imunoexpressão do VEGF demonstrou similaridade, entre os casos de periodontite, gengivite e gengiva saudável. Correlação positiva moderada e diferença estatisticamente significativa foram verificadas para as expressões do VEGF e HIF-1α, em gengivais saudáveis (r=0.529; p = 0.04). Desta forma, pode-se concluir que, possivelmente a via de ativação do HIF-1 α, está ativada na doença periodontal, podendo haver participação desta proteína, na patogênese e progressão da doença periodontal e que a ativação do VEGF, além de ser desencadeada via transcrição do HIF-1 α, pode ser também, influenciada por outros fatores adicionais, como, por exemplo, ação das endotoxinas bacterianas periodontopatogênicas.
ABSTRACT
Periodontal disease is a complex inflammatory and infectious condition that immune host, front of the microbial aggressions, can lead to disease progression, resulting in tissue destruction. The tissue damage induces the release of regulatory molecules, which protective roles and / or destructive, including proteins VEGF (vascular endothelial growth factor vascular) and HIF-1 α (hypoxia-induced factor α -1). Thus, this study investigated, quantitatively and comparatively, the immunohistochemical expression of VEGF (vascular endothelial growth factor) and HIF-1 α (hypoxia induced factor 1-α), proteins involved in inflammation, angiogenesis and hypoxia, in human gingival tissues. Therefore, 75 samples of gingival tissues were examined. Thirty samples were chronic periodontitis, 30 with chronic gingivitis and 15 healthy gingival. After sections analysis, positives and negatives inflammatory and endothelial cells in the connective tissue were counted and converted into percentage. Data were statistically analyzed using Kruskal-Wallis test and Spearman correlation. The results showed that both proteins marked. It was observed higher immunoreactivity for HIF-1 α at chronic gingivitis and periodontitis specimens compared to healthy sites, however, no statistically significant differences were observed among them (p>0.05). The VEGF immunostaining showed similarity among the cases of periodontitis, gingivitis and healthy gingiva. Moderate and positive correlation statistically significant differences were verified for the expressions of VEGF and HIF-1α in gingival health (r = 0,529, p = 0.04). Thus, it can be conclude that possibly the route of HIF-1 α, is activated in periodontal disease may have involvement of the protein in pathogenesis and progression of disease, and that activation of VEGF, can be in addition to being triggered transcription by HIF-1 α may be also influenced by other additional factors such as the action of periodontal microorganisms endotoxins.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES Página
Quadro 1. Especificidade, nº do catálogo, fabricante, diluição, recuperação
antigênica e tempo de incubação dos anticorpos usados... 52
Figura 1. Estrutura esquemática do HIF -1α... 41
Figura 2. Produtos proteicos com evidências de ativação pelo HIF-1 α... 41
Figura 3. Atividade do HIF em condições de hipóxia e normóxia... 42
Figura 4. Fotomicrografia de periodontite crônica, demonstrando intenso infiltrado inflamatório, em toda profundidade do espécime (H/E, 100×)... 57
Figura 5. Fotomicrografia de periodontite crônica, demonstrando intenso infiltrado inflamatório linfoplasmocitário (H/E,400×)... 57
Figura 6. Fotomicrografia de gengivite crônica, demonstrando moderado infiltrado inflamatório e vascularização (H/E, 100×)... 58
Figura 7. Fotomicrografia de gengivite crônica, demonstrando infiltrado inflamatório linfoplasmocitário, e vascularização (H/E, 400×)... 58
Figura 8. Fotomicrografia de gengiva saudável, demonstrando leve infiltrado inflamatório (H/E, 100×)... 59
Figura 9. Fotomicrografia de gengiva saudável, demonstrando leve infiltrado inflamatório (H/E, 400×)... 59
Figura 10. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcação para VEGF, nas células inflamatórias em periodontite crônica (LSAB, 400×).. 63
Figura 11. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcação para VEGF, nas células inflamatórias e endoteliais em gengivite crônica (LSAB, 400×)... 63
Figura 12. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcação para VEGF, nas células inflamatórias e endoteliais, em gengiva saudável (LSAB, 400×)... 64
Figura 15. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcação para o HIF-1 α nas células inflamatórias e endoteliais em gengiva saudável (ADVANCE, 400×)... 65 Figura 16. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcação para o VEGF, nas
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS
Página
Tabela 1. Tamanho da amostra e percentual, em relação ao gênero, cor da pele e condição clínico-histopatológica...
Tabela 2. Condição clínico-histopatológica, de acordo com a faixa etária e medidas de tendência central e dispersão para a
idade... 49
Tabela 3. Tamanho da amostra e percentual do infiltrado inflamatório em
relação a condição clínico-histopatológica... 55
Tabela 4. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para o percentual de imunopositividade para
VEGF em relação à condição clínico-histopatológica... 60
Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para o percentual de imunopositividade para
HIF-1α em relação à condição clínica... 61
Tabela 6. Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) de células imunorreativas para HIF-1 α e VEGF de acordo com o
tipo de lesão... 62
Gráfico 1. Box-plot relativo aos percentuais de imunopositividade do
VEGF de acordo com a condição clínico/histopatológica... 61
Gráfico 2. Box-plot relativo aos percentuais de imunopositividade do
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
bFGF - Do inglês Fibroblastic growth factor basic, traduzido como Fator básico de crescimento de fibroblastos.
bHLH -Do inglês basic helix-loop-helix traduzido como básico hélice-alça-hélice. CAD - Domínio de ativação Carboxi terminal.
CODDD – Domínio de degradação dependente do oxigênio.
EGF - Do inglês factor growth epidermic, traduzido como Fator de crescimento epidérmico. IPC - Indice Periodontal Comunitário.
HIF-1α- Do inglês Hypoxia-inducible Factor-1 α (Fator induzido por hipóxia-1 α).
HRE - Do inglês hypoxia response element, traduzido como elemento de resposta a hipóxia. IL – Interleucina.
INF-β - Interferon beta. INF-γ - Interferon gama. kDa - Quilodalton.
FLK-1 e FLT-1 - Receptores para VEGF
LPS - Do inglês Lipopolysaccharide, traduzido como Lipopolissacarídeos
LSAB - Do inglês labeled streptavidin biotin,, traduzido como conjugado streptoavidina-biotina.
MEC -Matriz extracelular.
NODDD – Domínio de degradação dependente do oxigênio. NAD – Domínio de ativação NH2 terminal.
PAS – Do inglês Period aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator single-minded, traduzido como domínio comum encontrado nos genes Per1, Arnt, e sim.
PDGF - Do inglês plateled derived growth factor, traduzido como fator de crescimento derivado de plaquetas.
RANKL - Do inglês receptor activador of nuclear factor kB ligand, traduzido como ligante do receptor ativador do fator nuclear kB.
Tie - Receptores de angiopoietinas.
TGF-α − α − α − α − Do inglês transforming growth factor-α, traduzido como fator transformador do
crescimento α.
TGF-ββββ - Do inglês transforming growth fator-β, traduzido como fator transformador do
TNF αααα–Do inglês tumor necrosis factor – α, traduzido como fator de necrose tumoral-α. TLR4 – Do inglês Toll‐like receptor, traduzido como receptores Toll-like 4.
TRAP- Do inglês tartrate-resistant acid phosphatase, traduzido como fosfatase ácida tartarato resistente
TRIS-HCL – Tris-hidroximetil-aminometano.
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO... 26 2 REVISÃO DA LITERATURA... 29 2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS... 29 2.2 ANGIOGÊNESE E VEGF ... 36 2.3 HIPÓXIA E O HIF-1 α... 40 3 PROPOSIÇÃO... 45 4 MATERIAL E MÉTODOS... 47 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS... 47 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO... 47 4.3 POPULAÇÃO... 47 4.4 AMOSTRA... 47 4.4.1 Caracterização da amostra... 48 4.4.2 Critérios de inclusão da amostra... 49 4.4.3 Critérios de exclusão da amostra... 49 4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO... 50 4.6 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO... 50 4.6.1 Análise imuno-histoquímica do HIF-1 α e VEGF... 52 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 53
5 RESULTADOS... 55 5.1 REULTADOS HISTOMORFOLÓGICOS... 55
1 INTRODUÇÃO
A doença periodontal é uma condição inflamatória crônica, com caráter destrutivo, que apresenta alta prevalência na população mundial, representando uma das principais causas, de perda dentária em adultos, afetando significativamente, a qualidade de vida das pessoas (NANCI; BOSSHARDT, 2006; PETERSEN, 2003; GJERMO et al., 2002).
O acúmulo de biofilme bacteriano sobre a superfície dental, associado ao crescimento subgengival de certas espécies de bactérias Gram-negativas anaeróbias estão relacionados ao desenvolvimento da doença periodontal (MEYER et al., 2008; BAKER et al., 2000), no entanto a progressão da doença depende da resposta do hospedeiro frente aos microrganismos (VAN DYKE; SEHRAN, 2003; LINS et al., 2004). Outros fatores, também, podem contribuir para o início e progressão da doença, como sexo, idade, escolaridade, tipo de trabalho, condição social, hábitos de higiene bucal, realização de tratamento odontológico mal conduzido, diabetes, tabagismo, consumo de álcool, entre outros (SANTOS et al., 2010; MEYER et al., 2008).
A doença periodontal pode se apresentar sob a forma de gengivite e periodontite. A gengivite inicia-se, frequentemente, pela inadequada higiene bucal, que leva à inflamação gengival pelo acúmulo do biofilme bacteriano na superfície dentária, o que torna a gengiva hiperemiada, edemaciada e com sangramento. Neste estágio, a doença é reversível com correta higienização e tratamento. Quando não tratada, a gengivite pode evoluir e o tecido de suporte será destruído, formando a bolsa periodontal, característica da periodontite (AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY, 2008).
As respostas imunes do hospedeiro têm sido implicadas na progressão das doenças periodontais. No momento em que há uma agressão tecidual, o sistema de defesa inato é deflagrado, várias substâncias, denominadas mediadores químicos, são liberados no local afetado. Eles irão modular uma série de eventos no transcorrer da resposta inflamatória/imunológica (SANTOS et al., 2010).
enzimas proteolíticas, além de estimular a proliferação e migração das células endoteliais, as quais são fundamentais para a angiogênese (NG et al, 2011).
Na maioria dos tecidos saudáveis, mecanismos homeostáticos, mantêm os níveis de oxigênio entre 2,5% a 9%. No entanto, como consequência dos danos vasculares, do aumento na demanda metabólica das células e da multiplicação de patógenos, presentes nos processos infecciosos e inflamatórios periodontais; esses níveis podem ser considerados críticos, correspondendo a concentrações inferiores a 1%. Neste ambiente hipóxico, na tentativa de restabelecer a homeostase tecidual, uma resposta adaptativa celular, será desencadeada pelo HIF-1 α; fator responsável pela transcrição de diversos genes reguladores, incluindo o VEGF (ELTZSCHIG; CARMELIET, 2011; IMTIYAZ; SIMON, 2010).
Apesar de ser estabelecida, a natureza imuno-inflamatória e altamente vascular da doença periodontal; poucos estudos foram realizados, com o intuito de observar, de forma isolada ou correlacionada, a expressão do HIF-1 α e do VEGF, em tecidos periodontais humanos (NG, 2007). Nesse sentido, esta pesquisa teve como finalidade, analisar a expressão do VEGF e HIF-1 α, através da técnica de imuno-histoquímica, em tecidos gengivais
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS:
A doença periodontal tem sido descrita como uma condição inflamatória complexa, de caráter infeccioso, associada à presença de bactérias Gram-negativas anaeróbicas, que acomete os tecidos de proteção e/ou sustentação dos elementos dentários. A resposta imune do hospedeiro a estas bactérias pode conduzir a progressão da doença, resultando em destruição de tecidos moles e reabsorção óssea periodontal. (NG et al., 2011; BEZERRA, 2011; HOSOKAWA et al., 2008).
O agente etiológico primário desta doença é o biofilme dentário, composto, principalmente, por bactérias que colonizam a superfície dentária e liberam componentes patogênicos, como os lipopolissacarídeos, que interagem com receptores de superfície do epitélio sulcular, atingindo o tecido conjuntivo, entrando em contato com fibroblastos, células endoteliais e leucócitos. (OLIVEIRA, 2007).
Um grande número de espécies bacterianas foi identificado no ambiente do sulco gengival e/ou bolsa periodontal, como, por exemplo: Porphyromonas gingivallis (P. gingivalis), Tannerella forsythensis e Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Estas bactérias expressam potentes fatores de virulência, tais como os lipopolissacarídeos (LPS), fímbrias, cápsulas, vesícula extracelular e proteína de membrana externa, que induzem a liberação de inúmeros mediadores inflamatórios no hospedeiro, como prostaglandinas, IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α, os quais estão envolvidos no processo de destruição do periodonto (WARA- ASWAPATI et al, 2007; SUTHIN et al, 2003).
Embora as bactérias sejam essenciais para o desenvolvimento da periodontite, o fato de que ela se desenvolve em graus variáveis, em diferentes indivíduos, sugere uma etiologia multifatorial, influenciada por alterações locais, condições adquiridas ou fatores genéticos (SANTOS, 2009; MARCONCINI et al., 2011). No entanto, todas as formas de periodontite parecem ter uma série de eventos comuns subjacentes que levam à degradação dos tecidos (SANTOS, 2009; MARCONCINI et al., 2011).
ligamento e osso alveolar), representando uma das grandes responsáveis pela perda dentária na população adulta (LINDHE; KARRING; LANG, 2005; MILLER et al., 2006).
As alterações inflamatórias podem permanecer confinadas a área gengival por vários anos. Porém, em algumas áreas, com a presença contínua do biofilme periodontopatogênico, a gengivite pode evoluir para uma doença periodontal mais destrutiva, resultando em perda do ligamento periodontal e osso alveolar (LÖE et al., 1965; LINDHE; KARRING; LANG; 2005).
Löe et al. (1965) realizaram um estudo em que ficou demonstrado a reversibilidade da condição de doença. Neste estudo, foi evidenciado o efeito do biofilme dentário no desenvolvimento da gengivite, em que 100% dos indivíduos apresentaram inflamação gengival em até 21 dias de acúmulo de biofilme dentário. Os sinais clínicos de gengivite observados foram hiperemia, edema, maior tendência ao sangramento dos tecidos moles à sondagem e perda parcial do pontilhado. Porém, nesta fase, se o biofilme dentário for removido e forem instituídas medidas eficazes de controle do mesmo, os sinais clínicos são reversíveis (LINDHE; KARRING; LANG, 2005).
Uma das primeiras mudanças que ocorrem na periodontite é a migração apical do epitélio juncional ao longo da superfície radicular, resultando na formação de um epitélio juncional longo e uma bolsa periodontal. Esta alteração estrutural é acompanhada por uma série de alterações funcionais, em que a migração de neutrófilos e do fluxo de fluido crevicular, em todo o epitélio, muda em virtude da superfície livre do epitélio. Além disso, essa superfície livre está mais exposta ao acúmulo de biofilme (NANCI; BOSSHARDT, 2006).
Alguns estudos que avaliaram a progressão da doença periodontal mostraram que a periodontite é sempre precedida de uma gengivite. No entanto, alguns indivíduos podem ser acometidos por gengivite durante toda a vida e nunca sofrerem alterações no periodonto de sustentação, ou seja, não desenvolverem a periodontite, demonstrando que os mecanismos de defesa do hospedeiro exercem um papel decisivo na patogenia e na susceptibilidade da doença (BEZERRA, 2011; LINDHE; KARRING; LANG, 2005).
realizado no Brasil em 2003, apontou 18,8% de sangramento, 33,4% de cálculo e 1,3% de bolsa periodontal em indivíduos entre 15 e 19 anos de idade; e 9,97%, 46,8% e 10,0% entre 35 e 44 anos, respectivamente, pelo Índice Periodontal Comunitário (BRASIL, 2004).
Através dos dados do Programa SB Brasil, que utilizou o maior escore de IPC (Índice Periodontal Comunitário), foi possível observar a prevalência da doença periodontal na população brasileira, considerando faixa etária e macrorregião. De acordo com esses dados, a porcentagem de indivíduos sem problemas periodontais, nas faixas etárias 15-19, 35-44 e 65-74 anos de idade, foi respectivamente 46,2%, 21,9% e 7,9%; em que as proporções mais favoráveis foram encontradas na Região Centro-Oeste para as faixas etárias de 15 a 19 anos e 35 a 44. Na Região Sul para a faixa etária de 65 a 74 anos de idade. (BRASIL, 2004).
Clinicamente, a periodontite pode ser considerada como periodontite agressiva, a qual é caracterizada por uma destruição rápida do tecido periodontal, que pode afetar crianças, adolescentes e adultos jovens; bem como periodontite crônica, caracterizada pela lenta progressão e perda de inserção periodontal (LIMA et al 2011; KANTARCI; VAN DYKE, 2005). Em ambas as apresentações, os tecidos periodontais são destruídos pela ação do processo inflamatório, em que inúmeros fatores de risco têm sido descritos, incluindo condições sistêmicas, tabagismo, fatores ambientais, socioeconômicos, microbianos e imunológicos (MARCONCINI et al, 2011).
Em fase inicial, a doença periodontal reflete alterações inflamatórias, restritas ao periodonto de proteção, caracterizada como hiperemia e edema da margem gengival, sangramento provocado, alterações no contorno gengival, bem como perda da adesão tecidual e aumento do fluxo do fluido gengival no intuito de eliminar o agressor. Este quadro é característico de gengivite, o que não envolve perda de inserção periodontal e é reversível perante a remoção do biofilme dentário (KANTARCI; VAN DYKE, 2005; VAN DAYKE; SERHAN, 2003).
Porém, a persistência e acúmulo do biofilme, em íntima proximidade com os tecidos periodontais, possibilita um estímulo antigênico contínuo, transformando a resposta inflamatória, inicialmente aguda, na qual predominam alterações vásculo-exsudativas, em lesão crônica, com proliferação do epitélio juncional, bolsa periodontal e reabsorção óssea (KANTARCI; VAN DYKE, 2005; VAN DAYKE; SERHAN, 2003).
provavelmente, participar da patogênese de condições inflamatórias, como a doença periodontal (KANTARCI; VAN DYKE, 2005; VAN DAYKE; SERHAN, 2003).
Histologicamente, o tecido gengival apresenta em sua superfície um epitélio escamoso estratificado que é dividido, segundo aspectos morfológicos e funcionais em epitélio oral, epitélio sulcular e epitélio juncional (NEWMAN et al., 2007; LINDHE; KARRING; LANG, 2005 ; WILSON; KORNMAN, 2001). Em condições normais, o principal tipo celular do epitélio gengival é o ceratinócito, sendo encontradas também células de Langerhans, células de Merkel e melanócitos (NEWMAN et al., 2007; WILSON; KORNMAN, 2001).
O tecido conjuntivo gengival consiste em uma camada papilar e reticular, é composto por fibras colágenas, elásticas e reticulares além de substância fundamental. O elemento celular predominante é o fibroblasto, entretanto, células inflamatórias estão também presentes em pequena quantidade (NEWMAN et al., 2007; LINDHE; KARRING; LANG, 2005; WILSON; KORNMAN, 2001). O suprimento sanguíneo e linfático é feito através das arteríolas, capilares, vênulas e vasos linfáticos que se estendem por todo o conjuntivo (NEWMAN et al., 2007).
Na doença periodontal, a exposição do hospedeiro ao biofilme dental promove um quadro inflamatório com alterações no complexo vascular gengival, na celularidade do tecido conjuntivo e no epitélio juncional. Estas alterações serão responsáveis pelo quadro clínico da doença (LINDHE; KARRING; LANG, 2005; NEVILLE et al, 2009).
Na gengivite, há um infiltrado difuso de células inflamatórias polimorfonucleares, linfócitos e plasmócitos, que se acumulam no tecido conjuntivo subjacente. Esse infiltrado, assim como o aumento da vascularização e dilatação dos vasos sanguíneos, torna-se mais intenso à medida que a doença progride (NEVILLE et al, 2009; WILSON; KORNMAN, 2001).
O aspecto mais característico que distingue a gengivite da periodontite é a formação de uma bolsa, em razão da migração apical do epitélio juncional. Este epitélio será infiltrado por neutrófilos, linfócitos, plasmócitos, macrófagos que, ocasionalmente, estão dispostos em placas. O epitélio juncional pode apresentar ainda ulcerações, o que facilita a entrada de bactérias e seus produtos no tecido conjuntivo, abaixo do epitélio da bolsa. Ao longo da superfície radicular, o processo inflamatório pode resultar em desarranjo das fibras colágenas, expondo o cemento a várias substâncias orgânicas, presentes na bolsa e na cavidade oral (WILSON; KORNMAN, 2001).
teve como base, os aspectos inflamatórios, evidenciados clínico-histopatologicamente. Esse estudo, embora realizado em cães, trouxe uma contribuição fundamental para a compreensão dos fenômenos envolvidos na etiopatogênese da doença periodontal.
Entre os processos inflamatórios que afetam a cavidade oral, as doenças periodontais são comumente observadas. A patogênese dessas doenças inclui diversas alterações inflamatórias que envolvem resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro (COCHRAN 2008; GRAVES et al, 2008; VAN DYKE; SERHAN, 2003).
A inflamação é uma resposta bioquímica celular de defesa natural do organismo, não específica, imediata, que pode surgir em qualquer tecido em resposta a traumas, agentes químicos, distúrbios imunológicos, genéticos, extremos de temperatura, radiação, microrganismos e hipóxia (CURTIS et al. 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; NATHAN,2002). É caracterizada por alterações do sistema vascular, dos componentes líquidos e celulares e adaptações do tecido conjuntivo. As células do tecido agredido sofrem transformações morfológicas e funcionais e passam a liberar enzimas e substâncias químicas, características dos processos inflamatórios, visando a destruir ou isolar o agente agressor (CURTIS et al 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Vários tipos celulares circulantes, como neutrófilos, monócitos, eosinófilos, linfócitos, basófilos e plaquetas, estão envolvidos na inflamação, assim como, também, proteínas plasmáticas e componentes celulares do tecido conjuntivo, como mastócitos, fibroblastos, macrófagos, entre outras (KANTARCI; VAN DYKE, 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). Mediadores químicos, tais como citocinas, quimiocinas, e fatores de crescimento, também foram identificados como participantes do processo inflamatório (NATHAN, 2002).
As reações vasculares e celulares da inflamação são mediadas por fatores químicos, derivados de proteínas ou de células plasmáticas, e são produzidos ou ativados pelo estímulo inflamatório. Esses mediadores agem amplificando a resposta inflamatória e influenciando sua evolução. Células e tecidos necróticos também podem desencadear a formação de mediadores da inflamação (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Na fase inicial da inflamação, o evento mais importante corresponde ao aumento local da permeabilidade vascular, resultando em infiltração celular e exsudação de fluidos ricos em proteínas, desencadeando os sinais clássicos da inflamação: calor, rubor, edema e dor (CURTIS et al., 2005; VAN DYKE, 2008; KUMAR; ABBAS; FAUSTO et al., 2005). Um grande número de produtos celulares, principalmente citocinas, mediadores químicos, fatores de crescimento, liberados no local da lesão, influenciam a manutenção e progressão dos processos inflamatórios (GRAVES et al 2008; WERNER; GROVE, 2003; HANADA et al. ,2002).
No momento em que há agressão tecidual pelos produtos bacterianos, que interagem com o epitélio gengival, vários mediadores químicos são liberados no local afetado, modulando uma série de eventos no transcorrer da resposta inflamatória/imunológica. Esses mediadores podem ter origem plasmática (sistema cinina, sistema complemento, sistema de coagulação e fibrinolítico) como celular (Fator de crescimento endotelial vascular, Fator de crescimento transformador beta) (SANTOS, 2009; KUMAR; ABBAS; FAUSTO et al., 2005). Embora a doença periodontal resulte, primariamente, de uma resposta inflamatória à presença de bactérias no biofilme dentário, é a natureza desta resposta que determina a característica destrutiva da doença (KANTARCI; VAN DYKE, 2005).
Há uma relação estabelecida entre colonização bacteriana e reabsorção óssea periodontal. Em decorrência da invasão bacteriana, com liberação de seus fatores de virulência; o processo inflamatório será desencadeado, havendo infiltração leucocitária local. Quanto mais próximas essas células inflamatórias estiverem do osso, maior será o número de osteoclastos presentes e, consequentemente, ocorrerá a reabsorção óssea (GRAVES et al., 2008).
A resposta inicial à infecção bacteriana é uma reação inflamatória local, que ativa o sistema imune inato. O fracasso desta resposta inicial resulta em uma amplificação do processo inflamatório, com liberação de uma variedade de citocinas e outros mediadores, com propagação através dos tecidos gengivais (COCHRAN, 2008).
Dois fatores críticos contribuem para que ocorra a reabsorção óssea em decorrência da doença periodontal: presença de mediadores inflamatórios nos tecidos periodontais, em concentração suficiente para ativar vias que levam à reabsorção óssea e infiltração desses mediadores no tecido gengival, atingindo uma distância considerada crítica com o osso alveolar (COCHRAN, 2008).
fornecimento de oxigênio. Além disso, o crescimento do biofilme bacteriano pode diminuir ainda mais a tensão de oxigênio nos tecidos periodontais (NG et al, 2011).
A diminuição da oferta de sangue para os tecidos implica na formação de áreas com baixo nível de oxigênio, caracterizando o estado de hipóxia. Esta condição afeta profundamente as propriedades celulares, como: produção de citocinas, adesão, migração e sobrevivência das células. A viabilidade celular pode ser comprometida, levando a perda de função e integridade do organismo (SUPPA, 2009).
As citocinas são proteínas bioativas quimiotáticas, que estimulam o recrutamento de células inflamatórias. Elas são produzidas por diversas células, como fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais, leucócitos polimorfonucleares, monócitos, linfócitos, macrófagos, mastócitos e osteoclastos. Algumas citocinas podem estimular uma ou mais etapas da reabsorção óssea através da sua ação quimiotática para células inflamatórias, como, por exemplo, os neutrófilos, assim como, também, estimulando a diferenciação ou fusão de células precursoras de osteoclastos (GRAVES et al., 2008).
As quimiocinas formam uma grande família de citocinas estruturalmente homólogas, de baixo peso molecular (8-12 kDa). Elas são reconhecidas por seus efeitos de ativação e diferenciação celular, por estimular o movimento dos leucócitos e regular sua migração do sangue para os tecidos. Atualmente, tem sido reconhecido seu papel em muitos processos biológicos, tais como angiogênese, produção de colágeno, hematopoese, organogênese, proliferação celular, apoptose, metástase e defesa (FERREIRA, 2009).
O VEGF é considerado como um dos mais importantes fatores pró-angiogênicos. Possui atividade mitogênica de células endoteliais, com grande afinidade por seus sítios de ligação, os receptores nas células endoteliais flk-1 e flt-1 (FERREIRA, 2009). O VEGF pode ser expresso por diferentes tecidos, incluindo cérebro, rim, fígado e baço, além de muitos tipos celulares. Seus níveis são regulados, principalmente, pela tensão de oxigênio no tecido. Condições geradoras de hipóxia induzem rapidamente um aumento da produção e secreção de VEGF local (FERREIRA, 2009; PRADEEP et al., 2011; CETINKAYA et al., 2007).
Várias outras citocinas são reconhecidas por seus papéis pró-inflamatórios, tais como: IL-1, -6, -11, -17. Algumas outras citocinas e mediadores são reconhecidos por seus efeitos anti-inflamatórios, atuando na tentativa de inibir a reabsorção óssea, como IL-4, -10, -12, -13, -18, interferons beta (IFN-β) e gama (IFN-γ) (COCHRAN, 2008).
As quimiocinas são ainda reconhecidas como mediadores da vascularização em diversos contextos fisiológicos e patológicos e estão envolvidos na patogênese de várias doenças inflamatórias crônicas, distúrbios fibroproliferativos, malignidade, reparo de feridas e, mais recentemente, a aterosclerose (KEELEY; MEHRAD; STRIETER, 2008).
2.2 ANGIOGÊNESE E VEGF
Os vasos sanguíneos são formados durante o desenvolvimento embrionário pela vasculogênese, onde uma rede vascular primitiva é estabelecida a partir de células precursoras, chamadas angioblastos. Estas células se diferenciam em células endoteliais, formam lumens e originam os vasos sanguíneos. No indivíduo adulto, o processo de formação dos vasos sanguíneos é conhecido como angiogênese, onde a neovascularização ocorre a partir de vasos preexistentes (CLAPP et al., 2009; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; CARMELIET, 2003).
A angiogênese está envolvida em importantes processos fisiológicos que demandam maior aporte sanguíneo, como a embriogênese e alterações associadas ao ciclo reprodutivo feminino. Está presente também, em eventos patológicos, como as reações inflamatórias, isquemia e crescimento tumoral; e pode resultar de uma hipertrofia, distensão luminal e colateralização em resposta a situação de estresse, onde o fluxo sanguíneo foi redirecionado, devido à estenose ou obstrução dos vasos distais (CLAPP et al., 2009; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
As etapas da angiogênese envolvem vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular em resposta ao óxido nítrico e VEGF. A partir daí, as células endoteliais migram, impulsionadas pelo VEGF, angiopoietina-1, angiopoietina-2, fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), além de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento transformador β (TGF-β) (ADAMS; ALIKATO, 2007; LAMALICE; LE BOEUF; HUOT, 2007). Proteases serão liberadas pelas células endoteliais, incluindo ativadores do plasminogênio, metaloproteinases da matriz (MMP), heparinase, catepsinas, entre outras, alterando a composição da matriz extracelular, permitindo suporte e orientação para migração das células endoteliais, além da extensão de brotos (SERINI; VALDEMBRI; BUSSOLINO, 2006). Eventualmente, esses brotos irão se unir e se converter em tubos, comandados por uma proteína da matriz extracelular, a estatina vascular endotelial (CLAPP et al., 2009; KAMEI et al., 2006).
Com o restabelecimento do fluxo sanguíneo, os níveis de oxigênio serão elevados, diminuindo a expressão do VEGF local e inibindo a proliferação de células endoteliais. Estes eventos, em conjunto com o recrutamento de pericitos e deposição de membrana basal subendotelial, promovem a maturação dos vasos sanguíneos neoformados (CLAPP et al., 2009; ARMULIK; ABRAMSSON; BETSHOLTZ, 2005).
Os vasos sanguíneos, que se desenvolvem em resposta a estímulos patológicos, como inflamações, infecções, tumores, traumas, são anormais, em relação a sua estrutura e organização. Eles são distribuídos de maneira irregular, formam shunts (comunicação anormal artério-venosa), são estruturalmente e funcionalmente heterogêneos e, em geral, são muito permeáveis ao plasma e suas proteínas (JANICE et al., 2007). Esses vasos neo formados, podem ser observados por microscopia de luz, onde os vasos sanguíneos são evidenciados, a partir do uso de anticorpos com afinidade pelas células endoteliais (MATOS, 2010; DAVEY et al., 2008).
Mecanismos fisiológicos celulares e moleculares asseguram que o sistema de vasos sanguíneos se ramifique nos tecidos em todas as direções, suprindo as necessidades locais durante o desenvolvimento normal e também em circunstâncias patológicas. A hipóxia compreende um importante estímulo para o crescimento de novos vasos sanguíneos, pois uma vez detectada falta de oxigênio em qualquer tipo de célula será desencadeado um mecanismo homeostático, visando assegurar que os vasos sanguíneos penetrem em cada região do corpo (CLAPP et al, 2009; CARMELIET, 2003).
vez, irá estimular a produção de vários fatores envolvidos nas diferentes etapas da angiogênese, incluindo o VEGF, angiopoietina 1 e 2 e óxido nítrico (NG et al, 2011; ALBERTS et al, 2006).
Estudos têm documentado a natureza altamente vascular da periodontite e o VEGF tem sido avaliado no fluido gengival de pacientes com doenças periodontais, onde foi observado aumento de sua expressão (SANTOS, 2009). Em um estudo, realizado por Ng (2007), em que foram examinados espécimes gengivais saudáveis e com periodontite, através de imuno-histoquímica, foi observado, que as expressões do VEGF e HIF-1 α estavam aumentadas em bolsas periodontais, quando comparadas com gengivas saudáveis, demonstrando, assim, um possível envolvimento dessas proteínas na regulação do metabolismo angiogênico, progressão da doença e processo de destruição tecidual.
O VEGF é um potente fator indutor da angiogênese. Atua como regulador da permeabilidade vascular, indutor da proliferação e migração de células endoteliais, além de promover a expressão de proteínas anti-apoptóticas nessas células. É considerado a substância mais importante da neovascularização fisiológica e patológica (OLIVEIRA et al., 2007).
O VEGF é uma glicoproteína homodimérica de 45kDa. Foi mapeado no cromossomo 6p21.3 e compreende uma família de proteínas que incluem o VEGF-A ou VEGF, - B, -C, -D, -E. Possui cinco principais isoformas distintas, denominadas: VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189 e VEGF 206. Onde o VEGF 165 é a isoforma mais frequente e a mais mitogênica (PRADEEP et al., 2011; MITROU et al., 2009).
A expressão do VEGF é estimulada por citocinas, fatores de crescimento, como por exemplo, TGF-α, TGF-β, PDGF, FGF, PGE, IL-1, IL-6 e IL-8, endotoxinas, hormônios e potencializada em resposta à hipóxia tecidual. É secretado por células mesenquimais e possui receptores específicos nas células do endotélio vascular. O VEGF se liga aos seus receptores (VEGF-R2), induzindo a formação e proliferação de células endoteliais e posteriormente induz a formação de tubos, uma característica dos capilares. A maturação e a elaboração de estruturas mais complexas ficam sob a responsabilidade das angiopoietinas, que interagem com receptores Tie-2 das células endoteliais (MITROU et al., 2009; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; FERRARA et al., 2004).
abundante na maioria dos tecidos inflamados, podendo desempenhar um papel crítico na regulação da doença periodontal (OLIVEIRA et al., 2007; CETINKAYA et al.,2007).
O VEGF tem sido detectado em tecidos periodontais, nas células endoteliais, células plasmáticas e macrófagos, além de epitélio sulcular e juncional. A expressão do VEGF pode ser induzida ainda, por patógenos periodontais, que podem aumentar a expressão de VEGF em fibroblastos gengivais além da redução, nos níveis de angiopoietina-1, em gengivas inflamadas, que também podem aumentar a atividade do VEGF (PRADEEP et al., 2011; CETINKAYA et al.,2007).
Embora as células endoteliais sejam o alvo principal do VEGF, seus efeitos sobre o recrutamento dos osteoclastos também tem sido investigados. Evidências demonstraram, crescente ligação entre a angiogênese e a remodelação óssea, uma vez que receptores, fenotipicamente semelhantes para o VEGF, foram identificados nas células endoteliais e nos osteoclastos. Adicionalmente, o VEGF possui atividade sobre linfócitos, granulócitos, monócitos e também interfere na sobrevivência e atividade dos osteoblastos e osteoclastos (MITROU et al., 2009; ALDRIDGE et al., 2005; NAKAGAWA et al., 2000).
Em condições inflamatórias, como a doença periodontal, são expressos diversos mediadores, como IL-1, MMP e catepsinas K, capazes de ativar outros mediadores como o RANK e TNF-α, que estão diretamente ligados a reabsorção óssea. Além disso, pode estar
presente também, o VEGF, que apresenta poder quimiotático, para células mononucleares, que, por sua vez, podem se diferenciar em osteoclastos, intensificando a osteoclastogênese (ALDRIDGE et al., 2005; NAKAGAWA et al., 2000).
2.3 HIPÓXIA E O FATOR INDUZIDO POR HIPÓXIA - 1 ALFA ( HIF - 1 α)
A hipóxia é uma redução no nível normal de tensão de oxigênio nos tecidos e ocorre durante vários processos fisiopatológicos (HONG; LEE; KIM, 2004). A capacidade de perceber e reagir a mudanças na concentração de oxigênio é uma propriedade fundamental de todas as células nucleadas. Várias situações clínicas, como inflamações e infecções, podem ocasionar uma diminuição na luz das artérias, arteríolas, vênulas e capilares, reduzindo o fluxo sanguíneo, levando a um quadro inicial de isquemia resultando em hipóxia tissular (SUPPA, 2009).
Em resposta às modificações de tensão de oxigênio, as células expressam genes específicos que irão sintetizar proteínas responsáveis por manter a homeostase tecidual. Um grupo de proteínas que realiza essa função compreende o complexo HIF-1 α, encontrado em
células de mamíferos, o qual possui um papel central nas respostas celulares e sistêmicas à hipóxia (SEMENZA, 2011; SUPPA, 2009).
O gene HIF-1 está localizado no cromossomo 14q21 e contém 15 éxons. Foi descoberto, em células humanas em 1988, através da identificação de um elemento de resposta à hipóxia (HRE) presente no gene da eritropoietina (EPO), hormônio que controla a produção de eritrócitos e sofre transcrição induzida por hipóxia. Além de ser considerado como um regulador da eritropoietina, o HIF-1 também é responsável pela liberação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o qual estimula a angiogênese e enzimas glicolíticas que adaptam o metabolismo celular à condição de hipóxia (SEMENZA, 2011; FERREIRA, 2009).
Figura 1. Estrutura esquemática do HIF. Proteína básica hélice-alça-hélice (bHLH); constituída de duas subunidades (α e β), domínio Per-Arnt-Sim (PAS); domínios de degradação (NODD e CODD); domínios de transativação (NAD e CAD). (SCHOFIELD; RATCLIFFE,2004).
Em condições de normóxia, o HIF é degradado por uma enzima intracelular, a prolil hidroxilase (PHD), enquanto que, em condições de reduzida concentração de oxigênio, essa enzima é inibida, favorecendo a união entre as subunidade α e β, formando um heterodímero, que se desloca para o núcleo da célula com o intuito de ativar a transcrição de vários genes, cujas proteínas estão envolvidas em mecanismos homeostáticos, fisiológicos e patológicos, como, por exemplo, genes codificadores da eritropoietina, transferrina, endotelina, hemoxigenase e VEGF (figura 2) (FERREIRA, 2009; SCHOFIELD; RATCLIFFE, 2004).
Na presença do oxigênio, a inativação do HIF-1 α ocorre a partir da hidroxilação de aminoácidos específicos (prolina) pela enzima prolil-hidroxilase, dentro de sua subunidade α. Essa hidroxilação promove a interação, com a proteína do gene supressor de tumor, Von Hippel-Lindau (VHL), levando a degradação do HIF-1 α por sistema ubiquitina-proteassoma (figura 3) (SEMENZA, 2011; RATCLIFFE, 2007).
O gene VHL codifica um componente de reconhecimento da ubiquitina ligase, responsável em direcionar o HIF-1 α para a via ubiquitina-proteassoma (figura 3). Quando a proteína Von Rippel-Lindau (pVHL) é inativada, o HIF-1 α será estabilizado, ocorrerá união do heterodímero α e β a um elemento de resposta a hipóxia (HRE) presente no núcleo e a cascata transcricional será ativada (figura 3) (CARROLL; ASHCROFT, 2005).
É reconhecido que, na doença periodontal, a inflamação ocasiona dano endotelial, falha na microcirculação e redução no fornecimento de oxigênio local. Além disso, os lipopolissacarídeos (LPS) e outros fatores de virulência de patógenos periodontais podem, também, aumentar a infiltração das células inflamatórias, o que contribuirá, ainda mais, para o déficit de oxigênio local. Em consequência poderá acontecer uma maior expressão de HIF-1 α, que, por sua vez, conduzirá a liberação de fatores angiogênicos, principalmente do VEGF; na tentativa de restabelecer a homeostase nos tecidos periodontais inflamados (LEE et al., 2004; PAPANDREOU et al, 2005; DEHNE, BRUNE et al, 2009).
Embora pouco estudado em doenças periodontais, alguns autores como Jing-Ping et al. (2011) estudaram a participação do HIF-1 α nessa doença, através de um trabalho, em que utilizaram fibroblastos humanos, obtidos a partir de biópsias gengivais. Esses fibroblastos foram expostos, a condições de normóxia e hipóxia, assim como também ao LPS bacteriano. Foi verificada a expressão do HIF-1 α, por meio de PCR, onde detectaram a expressão deste, em ambas as condições de concentração de oxigênio; porém, essa expressão, era consideravelmente mais elevada, quando os fibroblastos foram expostos ao LPS. Assim, esses autores demonstraram existir, a participação do HIF-1α, nos processos biológicos dos tecidos
3 PROPOSIÇÃO
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A presente pesquisa foi submetida à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN), sob protocolo 134/11 e obteve o parecer aprovado sob o número 332/2011 (ANEXO 1).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O presente estudo caracterizou-se por uma pesquisa observacional, consistindo de análise descritiva e comparativa, quanto a expressão imuno-histoquímica do VEGF e HIF-1 α, em uma série de casos de periodontite crônica, gengivite crônica e gengivas saudáveis.
4.3 POPULAÇÃO
A população foi constituída, por espécimes gengivais, com diagnóstico clínico-histopatológico de periodontite crônica, gengivite crônica e gengiva saudável, registradas durante o período de 2009 a 2010, no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal-RN.
4.4 AMOSTRA
espécimes, provenientes de pacientes com a gengiva saudável, constituindo o grupo controle. Os dados, referentes às informações clínicas (gênero, cor da pele e idade) foram obtidos das respectivas fichas clínicas do serviço supracitado.
4.4.1 Caracterização da amostra
As características descritivas da amostra no que se refere a gênero, cor da pele, faixa etária e condição clínico-histopatológica, podem ser observadas nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1.Tamanho da amostra e percentual, em relação ao gênero, cor da pele e condição clínico-histopatológica. Natal,RN- 2011.
Variável Independente Categoria n %
Gênero
Feminino 62 82,7
Masculino 13 17,3
Cor da pele
Branca 37 36
Parda 40 53,3
Negra 8 10,7
Condição clínico/histopatológica
Periodontite crônica 30 40 Gengivite crônica 30 40
Saudável 15 20
Tabela 2. Condição clínico-histopatológica, de acordo com a faixa etária e medidas de tendência central e dispersão para a idade. Natal,RN- 2011.
Condição clínico-histopatológica
Faixa etária
10-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80
Periodontite crônica
00 01 07 13 05 03 01
Gengivite crônica
08 11 06 04 00 01 00
Gengiva saudável
05 06 03 01 00 00 00
Idade Média± DP Mediana Q25-Q75
35,56 ± 14,96 34 25-58
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
4.4.2 Critérios de inclusão da amostra
Foram incluídos, na amostra, espécimes cujos blocos parafinados ofereceram quantidade suficiente de material biológico, para análise histológica e estudo imuno-histoquímico. Os espécimes eram oriundos de pacientes :
Portadores de periodontite crônica; Portadores de gengivite crônica; Portadores de gengivas saudáveis;
Que não eram portadores de doenças sistêmicas;
Que se submeteram a cirurgias com finalidade estética, restauradora, ortodôntica, protética.
4.4.3 Critérios de exclusão da amostra
4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO
Estudo morfológico foi realizado em microscopia de luz, a partir de cortes histológicos de 5 µm de espessura, corados pela técnica de Hematoxilina e Eosina (H/E). Esta análise avaliou a intensidade e disposição do infiltrado inflamatório, tomando como base, os critérios histopatológicos, adotados por Page; Schroeder (1976) e adaptados por kinane; Lappin (2001), para classificação da doença periodontal. Cada espécime teve o infiltrado graduado, quanto a intensidade e disposição; considerando 3 terços, partindo do epitélio para o tecido conjuntivo. Sendo considerado leve, quando as células inflamatórias apresentavam-se dispersas e dispostas em região sub-epitelial, atingindo o terço superior do campo próximo ao epitélio; moderado, quando o infiltrado ocupava até o terço médio na lâmina própria; e intenso, quando compreendia mais de dois terços em direção a profundidade da lâmina própria.
4.6 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
As amostras selecionadas, fixadas em formol a 10% e incluídas em parafina, foram também submetidas a cortes com 3µm de espessura; foram estendidas em lâminas de vidro devidamente preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao método da imunoperoxidase pela técnica baseada em polímeros de dextrano (ADVANCETM HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), e pela técnica de estreptoavidina-biotina (LSAB), utilizando os anticorpos anti-HIF-1 α e anti-VEGF respectivamente (Quadro 1).
Como controle interno positivo, foram utilizadas as células endoteliais das paredes dos vasos sanguíneos para o VEGF; e para o HIF-1 α, espécimes de adenocarcinoma de cólon. O controle negativo consistiu na substituição do anticorpo primário por albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.
A técnica a ser utilizada seguirá o protocolo descrito abaixo:
Álcool etílico absoluto I (5 minutos); Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); Álcool etílico 95°GL (5 minutos); Álcool etílico 80°GL (5 minutos);
• Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°, à temperatura ambiente (10 minutos);
• Lavagem em água corrente (10 minutos)
• Duas passagens em água destilada (5 minutos cada); • Recuperação antigênica (Quadro 1 );
• Lavagem em água corrente (10 minutos);
• Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
• Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes, em proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (10 minutos cada); passagens em solução tampão TRIS Lavagem em água corrente (10 minutos);
• Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
• Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) pH 7,4 (5 minutos cada);
• Incubação dos cortes com anticorpos primários, em solução diluente (Antibody diluent with background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA);
• Duas passagens em solução Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); • Incubação com anticorpo secundário (ADVANCETM HRP Link, Dako North America
Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);
• Duas passagens em solução Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); • Incubação com anticorpo polimerizado à peroxidase (ADVANCETM HRP Enzyme,
Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);
• Duas passagens em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 (5 minutos cada);
• Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (10 minutos);
• Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (10 minutos); • Lavagem em água corrente (10 minutos)
• Duas passagens por água destilada por 5 minutos cada • Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
Álcool etílico 80°GL (2 minutos); Álcool etílico 95°GL (2 minutos); Álcool etílico absoluto I (5 minutos); Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); • Três passagens em xilol (2 minutos cada);
• Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA).
Quadro 1. Especificidade, nº catálogo, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo.
4.6.1 Análise Imuno-histoquímica do VEGF e HIF-1 α
Foi realizada análise quantitativa, da marcação imuno-histoquímica das proteínas, em todos os espécimes incluídos na amostra. Foram consideradas como positivas, as células que exibiram coloração acastanhada, independentemente da intensidade, em localização citoplasmática e/ou nuclear. Para análise do HIF-1 α e VEGF, foram contadas, as células
inflamatórias e endoteliais, positivas e negativas, no tecido conjuntivo fibroso, de todos os espécimes gengivais analisados; segundo uma adaptação da metodologia, proposta por Ng
Especificidade Nº catálogo Fabricante Diluição Recuperação
Antigênica Incubação
VEGF SC-7269 Santa cruz
Biotechnology 1:500
Tripsina 0,1% pH 7,9, 37°C,
60 min.
Overnight 18 horas
HIF-1 α SC-53546 Santa cruz
Biotechnology 1:150
Citrato, pH 6,0 Pascal, 121ºC,
3 min.
(2007). Em um aumento de 100×, foram identificados 5 campos, considerados representativos para o espécime. Em seguida, esses mesmos campos, foram fotografados em um aumento de 400×, utilizando-se microscópio de luz NIKON® Eclypse 3200, com máquina fotográfica digital acoplada. As imagens obtidas foram transferidas para um computador, através do Sistema Infinity Analyze, e as células foram então contadas, com o auxílio do software IMAGE J®. Em cada campo fotografado, foi realizada a contagem de todas as células inflamatórias e endoteliais (positivas e negativas) e calculado o percentual das células positivas em cada caso.
A avaliação foi realizada por um observador e os achados foram anotados em fichas previamente elaboradas (Apêndice I).
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos com a análise imuno-histoquímica foram digitados em planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2007®) e posteriormente exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA), no qual foram realizadas as análises estatísticas.
Os dados obtidos com a determinação dos percentuais de imunopositividade para VEGF e HIF-1α foram submetidos à análise pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, o qual revelou ausência de distribuição normal. Dessa forma, a comparação dos percentuais de imunopositividade para VEGF e HIF-1α entre espécimes de periodontite, gengivite e gengiva saudável foi realizada por meio do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Em cada um dos grupos, foram analisadas possíveis correlações entre os percentuais de células imunopositivas para VEGF e HIF-1α. Para isso, utilizou-se o teste de correlação de Spearman.
Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de significância (α) foi estabelecido em 5% e adotado o valor de p < 0,05, quando da existência de diferenças
5 RESULTADOS
5.1 RESULTADOS HISTOMORFOLÓGICOS
A análise descritiva quanto a intensidade do infiltrado inflamatório dos espécimes gengivais diagnosticados clínico-histopatologicamente podem ser observadas na tabela 3.
Tabela 3. Tamanho da amostra e percentual do infiltrado inflamatório em relação a condição clínico-histopatológica. Natal – RN, 2012.
Condição
clínico-histopatológica Infiltrado inflamatório
N Leve Moderado Intenso
Periodontite crônica 30 0 16,67 83,33
Gengivite crônica 30 13,33 40 46,67
Gengiva saudável 15 66,67 33,33 0
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
5.1.1 Periodontite crônica
Os espécimes diagnosticados como periodontite crônica, exibiram infiltrado inflamatório composto predominantemente por linfócitos e plasmócitos; com distribuição difusa, por vezes em situação perivascular. A maioria dos casos (83,33%) exibiu um intenso infiltrado, ocupando os três terços da profundidade da lâmina própria. A vascularização apresentou-se mais pronunciada, com vasos sanguíneos dilatados e ingurgitados de hemácias (Figuras 4 e 5).
5.1.2 Gengivite crônica
mais pronunciada, com vasos sanguíneos de diferentes calibres, por vezes ingurgitados de hemácias.
5.1.3 Gengiva saudável
As amostras de tecido gengival saudável apresentaram em 100% dos casos, um infiltrado inflamatório de leve a moderado, com distribuição justaepitelial, por vezes ocupando até o terço médio do espécime. Os tipos celulares predominantes foram linfócitos e plasmócitos (Figura 8 e 9) e a vascularização apresentou-se mais pronunciada, com vasos sanguíneos de diferentes calibres, por vezes ingurgitados de hemácias.
Figura 4. Fotomicrografia de periodontite crônica demonstrando intenso infiltrado inflamatório em toda profundidade do espécime (H/E, 100×).
Figura 6. Fotomicrografia de gengivite crônica demonstrando moderado infiltrado inflamatório e vascularização (H/E 100×).
Figura 8. Fotomicrografia de gengiva saudável, demonstrando leve infiltrado inflamatório (H/E,100×).
5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS
A expressão das proteínas HIF-1 α e VEGF demonstrou imunorreatividade nuclear e citoplasmática em células inflamatórias e endoteliais. As análises estatísticas foram realizadas com base no percentual de células positivas para cada caso.
5.3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS
A análise da imunoexpressão de VEGF revelou, para os casos de periodontite, percentuais de imunopositividade que variaram de 0,00% a 94,80%, com mediana de 68,72% (Figura 10). Nas lesões de gengivite estes percentuais variaram de 19,70% a 94,60%, com mediana de 66,06% (Figura 11). Para o grupo das gengivas saudáveis, os percentuais de imunopositividade para VEGF variaram de 0,00% a 92,10%, com mediana de 46,79% (Figura 12). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis não revelou diferença estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão de VEGF entre espécimes de gengivite, periodontite e gengiva saudável (p = 0,111) (Tabela 4) (Gráfico 2).
Tabela 4. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para o percentual de imunopositividade para VEGF em relação à condição clínico-histopatológica. Natal, RN – 2012.
Condição
clínico-histopatológica
n % Mediana Q25-Q75
Média dos postos
KW p
Periodontite 30 94,6 68,72 37,27 – 80,68 39,75 4,391 0,111
Gengivite 30 94,8 66,06 50,48 – 80,81 41,47
Gengiva
saudável 15 92 46,79 18,44 – 70,34 27,57
