RESULTADOS ESTATÍSTICOS

A análise da imunoexpressão de VEGF revelou, para os casos de periodontite, percentuais de imunopositividade que variaram de 0,00% a 94,80%, com mediana de 68,72% (Figura 10). Nas lesões de gengivite estes percentuais variaram de 19,70% a 94,60%, com mediana de 66,06% (Figura 11). Para o grupo das gengivas saudáveis, os percentuais de imunopositividade para VEGF variaram de 0,00% a 92,10%, com mediana de 46,79% (Figura 12). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis não revelou diferença estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão de VEGF entre espécimes de gengivite, periodontite e gengiva saudável (p = 0,111) (Tabela 4) (Gráfico 2).

Tabela 4. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para o percentual de imunopositividade para VEGF em relação à condição clínico-histopatológica. Natal, RN – 2012.

Condição clínico- histopatológica n % Mediana Q25-Q75 Média dos postos KW p Periodontite 30 94,6 68,72 37,27 – 80,68 39,75 4,391 0,111 Gengivite 30 94,8 66,06 50,48 – 80,81 41,47 Gengiva saudável 15 92 46,79 18,44 – 70,34 27,57

Gráfico 1. Box-plot relativo aos percentuais de imunopositividade para VEGF de acordo com a condição clínico-histopatológica. Natal – RN, 2012.

A análise da imunoexpressão de HIF-1α revelou, para os casos de periodontite, percentuais de imunopositividade que variaram de 0,00% a 93,60%, com mediana de 39,59% (Figura 13). Nas lesões de gengivite, esses percentuais variaram de 0,0% a 95,50%, com mediana de 22,01% (Figura 14). Para o grupo das gengivas saudáveis, os percentuais de imunopositividade para HIF-1α variaram de 1,70% a 66,60%, com mediana de 32,26% (Figura 15). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis não revelou diferença estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão de HIF-1α entre espécimes de gengivite, periodontite e gengiva saudável (p = 0,519) (Tabela 5) (Gráfico 1).

Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para o percentual de imunopositividade para HIF-1α em relação à condição clínico-histopatológica. Natal, RN – 2012.

Condição clínico- histopatológica n % Mediana Q25-Q75 Média dos postos KW p Periodontite 30 93,6 39,59 6,37 – 77,02 41,48 1,313 0,519 Gengivite 30 95,5 22,01 6,45 – 59,03 35,25 Gengiva saudável 15 66,6 32,26 11,30 – 45,83 36,53 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Gráfico 2. Box-plot relativo aos percentuais de imunopositividade para HIF-1α de acordo com a condição clínico-histopatológica. Natal – RN, 2012.

Foram analisadas possíveis correlações entre os percentuais de imunopositividade para HIF-1α e VEGF. O teste de correlação de Spearman demonstrou não existir correlação estatisticamente significativa entre as imunoexpressões de HIF-1α e VEGF, tanto nos casos de periodontites (r = 0,252; p = 0,179) quanto nas gengivites (r = 0,215; p = 0,253). Nas gengivas saudáveis, o teste de correlação de Spearman revelou existir moderada correlação positiva entre os percentuais de imunoexpressão para HIF-1α e VEGF (r = 0,529; p = 0,043) (Tabela 6).

Tabela 6. Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) de células imunorreativas para HIF-1 α e VEGF de acordo com a condição clínico-histopatológica. Natal, RN-2012.

Tipo de lesão n r p Periodontite crônica HIF-1 α x VEGF 30 0,252 0,179 Gengivite crônica HIF-1 α x VEGF 30 0,215 0,253 Gengiva saudável HIF-1 α x VEGF 15 0,529 0,043

Figura 10. Fotomicrografia demonstrando imunomarcação para VEGF, nas células inflamatórias, em periodontite crônica. (LSAB, 400×).

Figura 11. Fotomicrografia demonstrando imunomarcação para VEGF, nas células inflamatórias (seta vermelha) e endoteliais na parede dos vasos (seta verde); em gengivite crônica. (LSAB, 400×).

Figura 12. Fotomicrografia demonstrando imunomarcação para VEGF, nas células inflamatórias (seta vermelha) e endoteliais (seta verde); em gengiva saudável (LSAB, 400×).

Figura 13. Fotomicrografia demonstrando imunomarcação para HIF-1 α, nas células inflamatórias, em periodontite crônica (ADVANCE, 400×).

Figura 14. Fotomicrografia demonstrando imunomarcação para HIF-1 α, nas células inflamatórias, em gengivite crônica (ADVANCE, 400×).

Figura 15. Fotomicrografia demonstrando imunomarcação para HIF-1 α, nas células inflamatórias (seta vermelha) e endoteliais (seta verde); em gengiva saudável (ADVANCE, 400×).

Figura 16. Fotomicrografia demonstrando imunomarcação para VEGF, em células endoteliais de brotos vasculares, em gengivite crônica (ADVANCE, 400×).

DISCUSSÃO

Como característica comum a todos os estágios da doença periodontal, temos a presença de um infiltrado inflamatório composto por diversos tipos celulares, tais como neutrófilos, macrófagos, linfócitos, plasmócitos. A intensidade do infiltrado inflamatório e sua disposição no tecido conjuntivo foram critérios utilizados por Page e Schroeder em 1976, para classificar a doença periodontal, com base nos aspectos clínicos e histopatológicos. Nesta classificação, em que a doença periodontal foi dividida em lesão inicial, lesão precoce, lesão estabelecida e lesão avançada; o infiltrado inflamatório representou um importante fator para a progressão da doença.

Histopatologicamente, todos os casos avaliados na presente pesquisa, apresentaram um epitélio de revestimento, pavimentoso estratificado ceratinizado, com fragmentos de epitélio sulcular pavimentoso não ceratinizado. Na lâmina própria foi possível observar, que, todos os casos apresentaram de leve a intenso infiltrado inflamatório, dependendo do tipo de condição clínica. Os casos de periodontite apresentaram em sua maioria, um intenso infiltrado inflamatório com distribuição difusa pelo espécime (83,33%). Dentre os casos de gengivite, 46,67% apresentaram infiltrado intenso; 40% moderado e 13,33% um leve infiltrado inflamatório. Os casos com gengivas saudáveis apresentaram infiltrado inflamatório de leve (66,67%) a moderado (33,33%).

Esses achados estão de acordo com Kinane;Berglundh; Lindhe (2010) quando referem que mesmo os achados clínicos sendo ainda sutis, as alterações histopatológicas fundamentais já se fazem presentes. Mesmo em tecidos gengivais saudáveis, focos de células inflamatórias, como linfócitos e plasmócitos, podem ser encontrados e que essas células são praticamente constantes na gengiva saudável (FIORELLINI; KIM; ISHIKAWA, 2007). Ainda em concordância com os achados histomorfológicos deste estudo, Bezerra (2011), observou um infiltrado inflamatório intenso e difusamente distribuído pelo espécime em 82,8% dos casos estudados em sua pesquisa, com tecidos periodontais doentes e saudáveis em humanos. Da mesma forma, Seabra (2006), observou esta mesma característica quanto ao infiltrado, em 69% dos casos de periodontite, analisados em sua pesquisa, também em tecidos humanos.

O aumento da intensidade do infiltrado inflamatório, com a predominância de células mononucleares, a dilatação e o aumento da permeabilidade vascular, a estase sanguínea, bem como o processo de angiogênese, que favorece o recrutamento celular e a liberação de

mediadores químicos, são eventos responsáveis pelo quadro clínico da gengivite; caracterizado por edema e hiperemia gengival (BEZERRA, 2011; SEABRA, 2006; LINS et al, 2004).

Mesmo em condições clínicas de saúde, há um constante desafio microbiano potencialmente patogênico, nos tecidos periodontais; e a resposta inicial à infecção bacteriana e seus produtos de virulência, corresponde a uma resposta inflamatória local, que ativa o sistema imune inato. Isto pode ser observado nos resultados deste estudo, visto que nos casos de gengivas saudáveis havia presença de infiltrado leve a moderado. A amplificação desta resposta resultará na liberação de uma variedade de citocinas, e outros mediadores inflamatórios; que na tentativa de conter os agentes agressores, também podem provocar a destruição tecidual (COCHRAN, 2008). Dessa forma, pode-se considerar, que, a doença periodontal se desenvolve, a partir de um desequilíbrio, na interação entre o hospedeiro e os microorganismos patogênicos (REPEKE, 2009; SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2005).

É reconhecido na literatura, o caráter altamente vascular das doenças periodontais. No entanto, essa angiogênese periodontal está presente fisiologicamente, e em condições inflamatórias crônicas. O VEGF, considerado como um potente fator pró angiogênico, tem sido detectado em vários tecidos periodontais e na saliva, tendo suas funções, associadas com a regulação da microcirculação nos processos patológicos, e também, desempenhando papéis na homeostase e cicatrização de feridas (GYURKOVICS et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2008; CETINKAYA et al., 2007). Nos resultados do presente estudo, foi observado para os casos de periodontite, que o percentual de imunopositividade para o VEGF atingiu 94,80%. Nos casos de gengivite crônica, este percentual atingiu 94,60% e em gengivas saudáveis 92%. Não apresentando diferença estatisticamente significativa entre os grupos.

Com esses dados, podemos observar que houve níveis elevados, na imunoexpressão desta proteína, nos tecidos periodontais; tanto para sítios considerados doentes, quanto nos saudáveis. Este achado pode ser justificado pela presença de um infiltrado inflamatório, observado em todos os espécimes da amostra; sendo este infiltrado moderado a intenso na maioria dos casos. Deve ser considerado ainda, que a natureza vascular dos tecidos periodontais, e a presença de infiltrado inflamatório de leve a moderado, nos casos de gengivas saudáveis, deste estudo; também justificam o alto percentual de imunopositividade para o VEGF, encontrado nestes casos.

Apesar de muitos estudos (PRADEEP et al., 2010; TREBEC-REYNOLDS et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2008; JOHNSON; SERIO; DAI, 1999 e GUNERI et al., 2004) relacionarem este fator de crescimento como participante da progressão da doença, alguns

autores referem que o papel do VEGF nos tecidos periodontais não é totalmente compreendido (PRADEEP et al., 2010).

Pradeep et al.(2011) observaram maiores concentrações do VEGF, em fluido crevicular de pacientes com periodontite crônica. Por outro lado, Cetinkaya et al. (2007) observaram uma maior expressão de VEGF, durante a fase de cicatrização da doença periodontal, quando comparada com periodontite. Booth et al. (1998) encontraram maiores concentrações do VEGF, em fluido gengival de sítios saudáveis, concordando com os achados de Chapple et al.(2000), que identificaram uma maior expressão imuno-histoquímica do VEGF, também em sítios saudáveis; enquanto Unlü et al. (2003), ao realizar um estudo com pacientes diabéticos e sistemicamente saudáveis, observaram que a imunoexpressão para o VEGF, não apresentava diferença estatisticamente significativa entre os casos de gengivas saudáveis e com periodontite, do grupo de pacientes sem doenças sistêmicas. Através desses resultados e tomando como base os trabalhos de Pradeep et al.(2011); Oliveira et al. (2008) e Cetinkaya et al. (2007), pode-se observar, que, a participação do VEGF, na patogênese das doenças periodontais, mostraram resultados conflitantes; sugerindo que este fator, possa ter uma dupla função, atuando tanto na progressão como na homeostase tecidual.

Os tecidos inflamados podem ser privados de oxigênio devido a danos vasculares, atividade metabólica bacteriana intensa, e grande número de células (IMTIYAZ; SIMON, 2010). Lesões inflamadas e infectadas, muitas vezes se tornam severamente hipóxicas, onde a multiplicação de patógenos podem privar as células de oxigênio (ELTZSCHIG; CARMELIET, 2011). A resposta adaptativa das células dos mamíferos, ao estresse da depleção de oxigênio, é coordenada pela ação do HIF-1α. Este potente fator de transcrição, tem sua ativação regulada por via oxigênio dependente, porém também pode ser induzido por citocinas inflamatórias, fatores de crescimento e produtos bacterianos, mesmo em condições de normóxia (IMTIYAZ; SIMON, 2010).

O HIF-1α tem papel reconhecido na patogênese de diversos processos inflamatórios, devido a sua capacidade, de desencadear a transcrição de diversos outros genes, como por exemplo, o VEGF. Neste estudo, observou-se a expressão do HIF-1α, nos tecidos periodontais doentes, por serem sítios reconhecidos como ambiente inflamado, infectado e potencialmente hipóxicos. Foi analisado, se a expressão do HIF-1α, está relacionada com a expressão do VEGF, e se a ativação dessas proteínas influencia na progressão da doença periodontal.

Nos resultados, observou-se que não houve diferença estatisticamente significativa quanto a expressão do HIF-1α entre os casos da amostra. Entretanto, foi observado, que houve uma expressão mais elevada do HIF-1 α nos sítios doentes, atingindo 93,6% nos casos de

periodontite; e 95,5% em gengivite. Por outro lado, em sítios considerados saudáveis, essa expressão foi aproximadamente 30% menor; atingindo um percentual de 66,6%.

Ng et al. (2011) analisaram por meio de imuno-histoquímica e PCR, a participação do HIF-1 α e VEGF, no desenvolvimento da doença periodontal. Estes autores observaram em seu estudo imuno-histoquímico, imunorreatividade significativamente maior para HIF-1 α, em células inflamatórias e endoteliais, dos tecidos periodontais doentes que nos tecidos saudáveis. No entanto, ao avaliarem os níveis de mRNA por PCR, observaram haver similaridade, entre os sítios saudáveis e doentes; sugerindo que eventos pós-transcricionais sejam responsáveis pela elevada expressão do HIF-1α em tecidos periodontais. Os resultados deste estudo estão de acordo com os achados desses autores, no que diz respeito a uma maior expressão imuno-histoquímica do HIF-1α, em periodontite e gengivite do que em gengivas saudáveis.

Dandajena et al. (2012), estudaram processos de agressão as estruturas do periodonto ocasionadas por movimentação ortodôntica, onde a reabsorção óssea alveolar estaria envolvida. Utilizando células mononucleares, do sangue periférico humano, analisaram por meio de cultura, ELISA e Western Blot, a participação do HIF-1α e VEGF, na diferenciação de osteoclastos. Através dos resultados, observaram que os níveis de HIF-1 α e VEGF estavam elevados em situações de hipóxia; que o HIF-1α induziu um aumento, nos níveis de RANKL, também em condições de hipóxia, e observaram ainda, que em co-culturas de células mononucleares, juntamente com osteoblastos, foi possível verificar uma diferenciação osteoclástica, através da detecção da fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP), por meio de imunofluorescência. Porém, esta diferenciação só estava presente em condições de hipóxia. E por fim, os autores referiram não haver diferenças, no índice proliferativo de osteoblastos e osteoclastos, entre situações de hipóxia e normóxia.

A detecção do HIF-1α em nosso estudo, em gengivas saudáveis, pode ser justificada, pelo fato de que mesmo em condições de normalidade, é característica a presença de células inflamatórias dispersas pelo tecido conjuntivo gengival. E embora a maioria das informações sobre a regulação de HIF-1α seja a respeito de sua ativação pela hipóxia, Hellwig-Burgel et al. (1999), sugerem que a ativação do HIF-1 pode ser induzida não só por hipóxia, mas também, por citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1β e TNF-α. Sendo assim, o HIF-1α, pode desempenhar um papel importante, não só na homeostase do oxigênio, mas também nas respostas imunes.

Quanto a possíveis correlações entre a expressão do VEGF e HIF-1α, foi observado no presente estudo, que não houve correlação entre o HIF-1α e o VEGF nos casos de periodontite e gengivite. No entanto, os testes estatísticos, demonstraram uma correlação moderadamente positiva (p=0,043) entre essas duas proteínas, nos casos de gengivas saudáveis.

Este achado, não está plenamente de acordo com os estudos de Pradeep et al. (2011), Ng. (2011) e Oliveira et al. (2008); onde se observa uma maior correlação destas proteínas com o avançar da doença. Porém deve ser ressaltado, que nos tecidos periodontais; os sítios saudáveis, considerados ambientes com concentração normal de oxigênio, constantemente são desafiados pela microbiota periodontopatogênica; o que pode propiciar um infiltrado de células inflamatórias locais, assim como também liberação de mediadores pró-inflamatórios como a IL-1β e o TNFα; fatores passíveis de induzir a transcrição do HIF-1 α, mesmo em condições equilibradas quanto a concentração de oxigênio.

Albina et al.(2001) demonstraram haver expressão de HIF-1α em células inflamatórias, de lesões subcutâneas precoces, induzidas em ratos, em um momento que precede o estabelecimento de hipóxia. Eles também demonstraram que o TNF-α, uma citocina com destaque no inicio das lesões, pode induzir a uma elevação da expressão de HIF-1α, em células inflamatórias, e que este fator nuclear por sua vez, estaria diretamente envolvido, na regulação da expressão do VEGF, em sítios inflamatórios (IMTIYAZ; SIMON, 2010; ALBINA et al., 2001).

Blouin et al.(2004) utilizando macrófagos, derivados de medula óssea de ratos, pesquisaram por meio de cultura de células, Northern Blot e ELISA a participação do LPS bacteriano na expressão do HIF-1 α e através dos seus resultados, concluíram que o LPS pode aumentar fortemente a expressão do HIF-1α, nessas células. E que especialmente em macrófagos, o LPS, através da sua ligação a receptores celulares específicos de superfície, seria um excelente estimulador não-hipoxêmico, da ativação do fator de transcrição HIF-1.

Jin-Ping et al. (2011), também pesquisaram, se o LPS poderia exercer um efeito adicional, em tecidos gengivais humanos, quanto a transcrição de HIF-1 α. Através de cultivo de fibroblastos gengivais humanos desafiados por LPS de E.coli, em condições de hipóxia (1% O2), analisaram o HIF-1 α, usando imunoprecipitação e immunoblot. Foi observado, que em condições de hipóxia, houve aumento de HIF-1α, mas ao combinar com LPS de E. coli este aumento foi duas vezes maior. A função biológica do VEGF, induzido por LPS, em normóxia e hipóxia, foi também avaliado por PCR; e os resultados mostraram, que os níveis

de expressão do mRNA VEGF-A foram mais elevados, em baixas concentrações de oxigênio em comparação com condições de normóxia.

Em outro estudo, realizado em 2008, os mesmos autores, através da imuno- histoquímica, observaram que o HIF-1α era mais expresso na periodontite que em tecidos saudáveis; especialmente nas áreas de infiltrado intenso. E que HIF-1α e um de seus produtos, o VEGF, poderia ser induzido por LPS bacteriano, em fibroblastos gengivais humanos, em ambos os ambientes de normóxia e hipóxia.

Uma característica comum em infecção bacteriana é a hipóxia, causada pela inflamação do tecido, o que resulta em dano endotelial e edema, levando a fracasso na microcirculação e uma redução no fornecimento de oxigênio. Isto é particularmente relevante na periodontite, causada por bactérias anaeróbias gram-negativas. Para avaliar a função biológica do HIF-1 α, Jing-Ping et al. (2011), mediram os níveis de transcrição de VEGF-A, gene com transcrição dependente do HIF-1α, e conhecido por estar envolvido em alterações vasculares na inflamação periodontal. Os resultados do PCR mostraram, que sob influencia do LPS, a expressão do RNAm VEGF-A estava aumentada, em normóxia e hipóxia, e que esse efeito poderia ser dependente de TLR4.

Portanto HIF-1α e VEGF podem ser considerados como componentes chaves, que desempenham papéis fundamentais, em muitos aspectos das funções celulares; tais como angiogênese, metabolismo energético, transporte de nutrientes e apoptose. A ativação desses fatores de transcrição tem sido estabelecida, como uma resposta crítica, dos tecidos expostos à inflamação, com implicação na fisiopatologia de diversas doenças isquêmicas, infecciosas, inflamatórias e neoplásicas. Entretanto, mais estudos que demonstrem a participação de eventos, além da hipóxia, capazes de induzir a ativação destes, como por exemplo, polimorfismos gênicos e ação das endotoxinas bacterianas, podem ser realizados com o objetivo de melhor compreender o papel dessas moléculas no desenvolvimento das doenças periodontais.

CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:

- A periodontite crônica, gengivite crônica e gengivas saudáveis, apresentam similaridade na imunoexpressão do VEGF, sugerindo que os processos biológicos envolvidos na progressão dessas lesões, podem não estar relacionados à expressão dessa proteína.

- As periodontites e gengivites crônicas, apresentaram elevada imunoexpressão para o HIF-1 α, em relação às gengivas saudáveis, sugerindo que a via do HIF-1 α, está ativada na doença periodontal; podendo haver participação desta proteína, na patogênese e progressão da doença.

- Houve correlação significativa entre o VEGF e HIF-1 α nas gengivas saudáveis, e não houve correlação significativa, entre as expressões de VEGF e HIF-1 α, nas periodontites e gengivites; sugerindo que a ativação do VEGF, além de ser desencadeada via transcrição através do HIF-1 α, pode ser também, influenciada por outros fatores adicionais, como por exemplo, ação das endotoxinas, da microbiota periodontopatogênica.

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