Embora vários sistemas coloidais tais como nanoemulsões, lipossomas e nanoesferas possam ser utilizados como carreadores para o halofantrino, no presente trabalho, as nanocápsulas foram os vetores de escolha, objetivando obter níveis ótimos de estabilidade e alta taxa de encapsulação. Trabalhos anteriores, utilizando esse mesmo sistema para veicular o Hf mostraram um teor de encapsulação de aproximadamente 99%, enquanto os lipossomas contendo Hf foram instáveis (Mosqueira, 2000 a). Além disso, as NCs são vetores de escolha para a administração intravenosa de fármacos altamente lipofílicos e solúveis na fase oleosa interna, característica marcante do Hf. As NCs são também interessantes vetores em função de sua biodegradabilidade, estabilidade em meio biológico e da baixa toxicidade dos polímeros pré-formados utilizados, como por exemplo, o ácido polilático utilizado previamente, e a poli-- caprolactona, polímero usado no presente estudo. A escolha de um determinado vetor bem como de seus constituintes deve ser bastante criteriosa, pois a retenção de um fármaco dentro do carreador é amplamente determinada por sua lipofilicidade e sua capacidade de se difundir entre o sistema e o meio biológico.
A solubilidade do Hf base livre em óleos foi descrita como sendo consideravelmente maior que o sal Hf.HCl. Segundo Porter et al. (1996), aproximadamente, 1 mg de Hf.HCl foi solúvel em 1 mL de óleo enquanto, a forma amorfa da Hf base livre permitiu solubilizar 200 mg/mL no mesmo óleo. Mosqueira, (2000 a) avaliando a solubilidade do Hf em diferentes óleos, determinou ser esta igual a 180 mg/mL em Miglyol, um triglicerídeo de cadeia média que apresenta como propriedades físico-químicas, baixa viscosidade e baixa tensão interfacial, que favorecem sua utilização para a preparação de NC. Diante disso, a base livre foi preparada, com rendimento de 93%, para se obter maior solubilidade do fármaco na fase oleosa das NCs.
No presente trabalho, a quantificação do Hf nas preparações de nanocápsulas foi realizada por espectofotometria no ultravioleta. Para tanto, inicialmente foi determinado o espectro de UV do Hf em acetonitrila como apresentado na figura 14. Foi observado um pico de absorção máxima em 258 nm, sendo esse, o comprimento de onda escolhido para realização dos ensaios posteriores.
FIGURA 14 – Espectro na região do UV apresentando o pico de absorção máxima do Hf em acetonitrila (20 g/mL).
Além disso, foi construída uma curva de calibração do Hf em acetonitrila (Figura 15) a partir das medidas de absorbância, realizada em 258 nm, apresentadas na tabela 1.
Tabela 1 – Valores de Absorbância utilizados para a construção da curva de calibração da solução de Hf em acetonitrila
a n = 3; DP = desvio padrão; CV= coeficiente de variação, dado por :(DP/média)*100
Hf (g/mL) Absorbância Média (a 258 nm)a DP CV (%) 0,5 0,05 0,001 1,7 1,0 0,09 0,004 2,6 1,25 0,11 0,001 0,6 2,5 0,21 0,002 1,1 5,0 0,41 0,002 0,6 7,5 0,64 0,005 0,8 10,0 0,85 0,003 0,4 20,0 1,60 0,013 0,8 0 0,5 1 1,5 2 2,5 200 220 240 260 280 300 Comprimento de Onda (nm) A b s or b â nc ia
FIGURA 15 – Curva de Calibração do Hf em acetonitrila em comprimento de onda igual a
258 nm; R2 = coeficiente de correlação.
O coeficiente de correlação (R2) demonstra que 99% dos dados estão inseridos na curva, sugerindo, portanto, uma correlação linear entre as concentrações de Hf e as absorbâncias obtidas. Esses resultados permitiram utilizar a curva acima nos ensaios de determinação do teor de Hf encapsulado.
A técnica utilizada para determinar o teor de encapsulação foi a ultrafiltração- centrifugação e indicou que 99,80 0,02% do Hf adicionado na preparação associou-se ao sistema coloidal, ou seja, às nanocápsulas, quando concentrações altas de fármaco (10 mg de Hf/mL de suspensão coloidal) foram utilizadas. De acordo com a revisão feita por Schaffazick et al. (2003), diversos fatores podem influenciar a quantidade de fármaco associada aos sistemas nanoestruturados, tais como as características físico- químicas do fármaco, o pH do meio, as características de superfície das partículas ou a natureza do polímero, a quantidade de fármaco adicionada à formulação, a natureza do óleo utilizado, bem como o tensioativo adsorvido à superfície polimérica.
A tabela 2 apresenta várias formulações de NCs contendo diferentes concentrações de halofantrino e seu efeito no diâmetro médio, índice de polidispersão e
y = 0,0801x + 0,0166 R2 = 0,9987 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 0 5 10 15 20 Concentração (g/mL) A b so rb â nc ia (n m)
composição quali-quantitativa, exceto a concentração do Hf.
Tabela 2 – Características físico-químicas de formulações de NC contendo diferentes concentrações de Halofantrino
Formulações de Nanocápsulas a Hf base (mg/mL) Diâmetro Médio das Partículas + DPb (nm) Índice de Polidispersãoc Potencial + DP (mV)d NC-0 - 245 118,7 0,193 -26,7 0,8 NC-1 1,0 191 56,6 0,250 -25,7 3,0 NC-5 5,0 504 158,0* 0,630 -1,6 1,4* NC-10 10,0 228 140,0 0,008 +10,9 1,2* NC-10# 10,0 268 174,2 0,109 nd NC-12# 12,0 365 211,5 0,457 nd
a Formulações de nanocápsulas constituídas por PCL = poly--caprolactona (6 mg de polímero/mL
de suspensão coloidal); b Desvio Padrão (n=3) das populações definidas pelo equipamento; cAmostras monodispersas (<0.3); d n=3, medidas realizadas após diluição da amostra (1:250) em
NaCl 1mM (condutividade, 120 S/cm); * indica diferença significativa (P < 0,05) quando comparada com a formulação NC-0; # Formulações caracterizadas no equipamento Nanosizer N4
Plus, Coulter Electronics Inc., Hialeah, FL, USA na Université Paris XI, França; nd = não determinado.
Como apresentado na tabela, o diâmetro médio das NCs variou de 191 a 504 nm, e foi observado aumento gradativo no tamanho das partículas a medida que concentrações crescentes de Hf foram associadas ao sistema. O maior diâmetro observado nas diferentes formulações, significativamente diferente da formulação NC-0, correspondeu a NC-5, preparada com 5 mg Hf/mL de solução coloidal. Essa observação coincide com a redução do potencial zeta (-1,6 mV) sugerindo um estado inicial de agregação e desestabilização do sistema, provavelmente devido à neutralização de cargas interfaciais. O aspecto visual (turbidez) da preparação e o
aumento das forças de Van der Waals.
As amostras NC-0, NC-1 e NC-10 apresentaram baixos índices de polidispersão (0,008 a 0,250), caracterizando populações homogêneas de partículas, com distribuição unimodal (Figura 16). Entretanto, NC-5 e NC-12 apresentaram-se como amostras polidispersas, com índices de polidispersão superior a 0,3 impossibilitando sua utilização para a administração intravenosa, devido à provável presença de agregados com tamanho superior a 5 m.
Como apresentado na tabela 2, não existe diferença entre o tamanho das formulações NC-10 (P = 0,57). Apesar das medidas terem sido efetuadas em equipamentos distintos, pôde-se verificar uma reprodutibilidade dos resultados com presença de populações homogêneas em ambas as amostras (Figura 16 D e E). Esses resultados mostraram que existe uma boa correlação entre os diferentes equipamentos utilizados para a realização da técnica de PCS.
FIGURA 16 – Tamanho das diferentes formulações de NCs obtido por equipamentos distintos: A a D: Zetasizer 3000 HS; E e F: Nanosizer N4 plus. A: formulação NC-0, sem o halofantrino; B: formulação NC-1, contendo 1 mg de Hf/mL de suspensão; C: formulação NC-5, contendo 5 mg de Hf/mL de suspensão; D e E: formulações NC-10, contendo de 10 mg de Hf/mL de suspensão; F: formulação NC-12, contendo 12 mg de Hf/mL de suspensão.
C D F Diâmetro (nm) Diâmetro (nm) Diâmetro (nm) Diâmetro (nm) In ten sid ad e Diâmetro (nm) In ten sid ad e Diâmetro (nm) 5 10 50 100 500 1000 Diameter (nm) 5 10 15 5 10 50 100 500 1000 Diameter (nm) 5 10 15 % i n c la ss 5 10 50 100 500 1000 Diameter (nm) 10 20 % in c la ss 5 10 50 100 500 1000 Diameter (nm) 10 20 30 40 E
superficial das partículas devido à adição de Hf ao sistema. Foram observados valores altamente negativos para as formulações NC-0 e NC-1, enquanto NC-10 apresentou valor de positivo (Tabela 2). Os valores de potencial idênticos (P = 0,34), em torno de 26 mV,para NC-0 e NC-1 sugerem que a superfície das nanocápsulas com halofantrino (1 mg/mL) tem a mesma composição das NCs brancas, ou seja, nessa condição parece que a maior parte do fármaco encontra-se encapsulado no núcleo oleoso, sem influenciar a interface. Esse potencial negativo é provavelmente decorrente da ionização de grupos carboxílicos presentes no polímero os quais se dissociam no meio dispersante e também dos fosfolipídios utilizados. Uma variação significativa (P = 0,000) do potencial -26,7 para + 10,9 mV, foi observada quando 10 mg/mL de Hf foram adicionados ao sistema. Esse fato pode ser explicado por uma provável influência do fármaco sobre a carga elétrica superficial da partícula, sugerindo que uma parte do fármaco carregado positivamente esteja adsorvido na superfície do vetor, visto que o Hf base apresenta um grupo amino ionizável que tenderia a aumentar a positividade da interface. Estudos anteriores demonstraram que o Hf interage fortemente com fosfatidilcolina (Lim & Go, 1999) e que o fármaco apresenta uma clara influência na superfície de carreadores que contém lecitina tais como nanocápsulas e nanoemulsões (Mosqueira, 2000 a), sugerindo que o halofantrino interage com fosfolipídios da lecitina e que, em altas concentrações, parte do fármaco se encontra na interface com o meio externo. Do mesmo modo, Calvo et al. (1997) analisaram a interação entre lisozima, uma enzima carregada positivamente, com dois diferentes sistemas carreadores, nanocápsulas e nanoesferas. Os autores observaram uma redução significativa dos valores do potencial das NCs, sugerindo que a enzima se associa mais a sistemas que apresentem carga superficial mais negativa.
Os dados da tabela 2 permitem ainda sugerir que as preparações contendo Hf mais favoráveis para utilização por via i.v. seriam NC-1 e NC-10, uma vez que apresentam populações homogêneas e monodispersas com tamanho inferior a 500 nm. Sabe-se que o tamanho e a carga superficial são importantes fatores que influenciam na distribuição dos sistemas carreadores no organismo, quando administrado pela via i.v.. Partículas grandes são rapidamente reconhecidas pelas células do SFM, assim como
no baço, enquanto partículas negativamente carregadas concentram-se mais no fígado e no baço (Juliano, 1988).
Todas as formulações foram obtidas como suspensões coloidais e apresentaram um aspecto leitoso característico das nanocápsulas como pode ser observado na Figura 17. Essas preparações apresentaram boa estabilidade e nenhuma alteração macroscópica foi observada durante o período de 3 meses, tais como cremagem, sedimentação ou floculação. Entretanto, no presente trabalho, não foi realizado um estudo detalhado da estabilidade das NCs, visto que as formulações foram utilizadas, in
vivo, logo após a preparação. Além disso, estudos anteriores utilizando NC de PLA contendo Hf demonstraram que as mesmas são estáveis por um período de 8 meses (Mosqueira, 2000 a).
FIGURA 17 – Nanocápsulas obtidas como suspensão coloidal de aspecto leitoso, pelo
método de nanoprecipitação. A) NCs sem fármaco, B) NC contendo 1 mg de Hf/mL de suspensão coloidal e C) NC contendo 10 mg de Hf/mL de suspensão coloidal.
A análise morfológica das NCs foi realizada por microscopia de força atômica (MFA). Foram analisadas formulações de nanocápsulas não carregadas (brancas), NCs contendo diferentes concentrações de Hf bem como os constituintes isolados e suas combinações.
Diferentes amostras de NCs brancas foram analisadas em diferentes campos e foi observado uma homogeneidade das mesmas em relação ao formato e estruturas, apresentando partículas com estruturas esféricas e formato regular como pode ser visualizado nas figuras 18 A e 18 B.
FIGURA 18 – Imagens de nanocápsulas não carregadas obtidas por MFA. Em A) vista do
topo e em B) visão tridimensional das partículas.
A
apresentando populações heterogêneas de partículas, enquanto, o diâmetro médio dessa mesma amostra determinado por PCS foi de 245 nm (Tabela 2), podendo-se atribuir a diferença entre as medidas à maneira em que as mesmas são efetuadas por MFA, ou a uma possível agregação das NCs na superfície da mica ou ainda ao achatamento das NCs quando depositadas sobre a superfície da mica. No entanto, resultados contrários eram esperados, uma vez que a técnica de PCS mede o raio hidrodinâmico das partículas, enquanto a MFA produz imagens de um sistema desidratado e também afetadas pelo formato da sonda de varredura utilizada.
Em todos os experimentos realizados por MFA, a amostra foi submetida a um processo de secagem com jato de argônio. Foi observado que, apesar do processo de secagem manter a amostra recoberta com uma camada de água, a secagem levou a uma alteração das “condições naturais” das partículas, resultando num possível fenômeno de agregação ou ruptura. Essa hipótese foi formulada com base nas imagens topográficas (Figura 19 A) e de fase (Figura 19 B) de formulações de NCs brancas apresentadas abaixo. Nessas imagens é possível observar a presença de canalículos irregulares, com altura em torno de 2 nm (indicadas em A pelas setas vermelhas), os quais parecem ser responsáveis por um processo de fusão das partículas. É possível observar ainda a presença de camadas finas e descontínuas de aproximadamente 6-8 nm de altura (indicadas em B pelas setas em negrito), nas quais as NCs estão depositadas em todas as imagens obtidas. Essas camadas provavelmente são formadas por excesso de tensioativo não-iônico utilizado, Poloxamer 188.
FIGURA 19– Imagem topográfica (A) e fase (B) obtidas por MFA e perfil topográfico (C) de nanocápsulas brancas. Área: 2,7m x 2,7m. As setas em negrito mostram camadas de poloxamer com altura entre 6 e 8 nm.
O poloxamer foi então analisado separadamente, e as imagens obtidas mostram estruturas altamente organizadas com camadas entre 5 e 7 nm, ou seja, com altura bastante semelhante à observada na figura anterior, as quais parecem diferir apenas morfologicamente das anteriores, uma vez que essa estrutura é mais arredondada (Figura 20).
A
B
C
A
B
FIGURA 20 – Imagem de altura (A) e fase (B) de poloxamer188 obtidas por MFA. Área: 40 m x 40 m.
Estudos da relação diâmetro/altura dessas partículas foi realizado, demonstrando uma relação de 10 ± 3,2 (Figura 21). Esses dados sugerem a existência de formas mais achatadas ou partículas em forma de disco provavelmente devido a estrutura interna das NCs ser preenchida de óleo envolvida por uma membrana polimérica flexível. Estudos anteriores (Montasser et al., 2002) demostraram uma relação diâmetro/altura de 12 para as nanocápsulas preparadas com um co-polímero, dicloroftaloil-co-dietilenotriamina, estabilizado pelo poloxamer 188. Portanto, nossos dados estão em acordo com esses autores e mostram que as NCs apresentam uma natureza diferente podendo se deformar quando comparadas às nanoesferas cuja estrutura é bastante rígida (Leite et al., 2005). As nanoesferas, como apresentado na figura 22, mostraram uma relação diâmetro/altura próxima de 1. Esta capacidade de deformação é uma importante propriedade das NCs, visto que um dos objetivos desses sistemas é transpor espaços intercelulares, in vivo, como endotélio vascular descontínuo no corpo humano. Além disso, essa propriedade é uma evidência física da presença de um núcleo oleoso fluido envolvido por uma membrana. Recentemente, Rübe et al. (2005) evidenciaram a presença de núcleo oleoso pela técnica de espalhamento de nêutron a baixo ângulo, indicando que a membrana
A
e composição geral do sistema praticamente idêntica ao utilizado no presente trabalho.
FIGURA 21 – Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanocápsulas brancas de PCL, apresentando a relação diâmetro/altura das partículas (~10). Área: 2,5 m x 2,5m.
A
B
C
FIGURA 22 – Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanoesferas brancas de PLA, apresentando a relação diâmetro/altura das partículas (~1). Área: 2,5 m x 2,5m.
Como exemplo da associação dos constituintes das NCs foram analisadas também "nanocápsulas sem membrana polimérica", denominadas nanoemulsões. Nesses experimentos foi detectada grande dificuldade na obtenção das imagens, as quais apresentaram-se normalmente muito ruidosas (Figura 23), sugerindo que o contato com a sonda “arrasta” as nanoestruturas sobre a mica desencadeando um processo de fusão com formação de grandes partículas. Essas análises sugerem que a parede polimérica das NCs confere maior estabilidade ao sistema, possuindo portanto uma estrutura mais rígida e estável, comparada à emulsão submicrométrica, e uma organização mais flexível e permeável comparada às nanoesferas poliméricas.
A
B
C
FIGURA 23 – Imagens topográficas (A e B) de nanoemulsão obtidas em diferentes campos por MFA. Área: 20 m x 20 m.
Podemos, então sugerir algumas hipóteses que possam estar contribuindo para o fenômeno de aumento do diâmetro médio das NCs obtido pela técnica de MFA. O primeiro, estaria relacionado com a desidratação das partículas durante o processo de secagem, que induziria posteriormente à agregação das mesmas. É conhecido da literatura que o processo de desidratação das NCs pela técnica de liofilização, geralmente leva à ruptura da membrana polimérica das NCs (Chasteigner et al., 1995). Esse fenômeno, portanto, pode estar também ocorrendo em amostras submetidas a análise por MFA com maior nível de desidratação. Além disso, em função da espessura e da continuidade da parede polimérica, as NCs podem apresentar maior ou menor estabilidade quando depositadas sobre a superfície da mica, ou seja, diferente capacidade de achatamento em função dessas variações apresentadas pela membrana. O esquema abaixo (Figura 24) representa os possíveis fenômenos de achatamento, que poderiam explicar o aumento do diâmetro observado por MFA em nanoemulsão, nanocápsula e nanoesfera.
A B
FIGURA 24 – Esquema representativo dos possíveis fenômenos que contribuem para o aumento do tamanho das partículas. A: nanoemulsão (NE) que equivalem a
NC “sem membrana polimérica. Essas partículas quando depositadas sobre a superfície da mica tendem a se agregar. B: Nanocápsulas constituídas por
um núcleo oleoso envolvido por membrana polimérica com diferentes espessuras. B 1: parede polimérica descontínua, o que faz com que as estruturas se comportem como NE. B 2: parede polimérica contínua porém de espessura fina. B 3: parede polimérica contínua com membrana espessa; Nas três situações representadas para NC as partículas se deformam, entretanto, B 2: tendem a se achatar mais se comparada a B 3. C: nanoesfera
com presença de matriz polimérica que confere às partículas maior rigidez, ausência de deformação e relação diâmetro/altura próxima de 1.
consistiu na realização de experimentos que permitissem evidenciar diferenças entre o núcleo oleoso e a parede polimérica. A figura 25 (1-4) mostra imagens topográficas (A) e de contraste de fase (B) de nanocápsulas antes (1 e 3) e após serem submetidas à pressão da sonda (2 e 4). As nanocápsulas foram analisadas em detalhes e foi observada uma diferença marcante entre as duas regiões como pode ser visualizado nas figuras. As nanocápsulas são normalmente estruturas muito estáveis quando submetidas à alta pressão ou à variação da força de interação sonda-amostra (set point = 0). Nessas situações, algumas partículas apenas se deformaram (Figura 25-2) curiosamente aquelas que apresentaram parede polimérica mais espessa, enquanto outras, com parede mais fina se romperam liberando o material oleoso para o meio externo (Figura 25-4).
1
2
3
4
FIGURA 25 - Imagens topográficas (A) e de contraste de fase (B) de nanocápsulas brancas
mostrando diferentes formas: antes (1 e 3) e após (2 e 4) variação da força de interação sonda-amostra (set point = 0). Área: 1,5m x 1,5m.
concentrações mostraram que a associação do fármaco não altera a estrutura arredondada das partículas (Figura 26), entretanto, as amostras apresentaram populações de partículas com maior polidispersidade se comparada às NC brancas. O diâmetro médio obtido foi 475 ± 153 nm para as preparações contendo 0,1 mg de Hf e 309 ± 97 nm para as formulações contendo 1,0 mg de Hf/mL de suspensão coloidal. Foi observado que quanto maior a concentração de halofantrino mais difícil se torna a aquisição das imagens, as quais são geralmente mais ruidosas. Portanto, no presente estudo, não foi possível obter imagens de NC contendo 5 ou 10 mg de Hf/mL de suspensão.
FIGURA 26 - Imagem tridimensional de NC contendo 0,1 mg de Hf/mL de suspensão
porém não foi possível afirmar se tais estruturas já estavam presentes na amostra ou se as mesmas foram decorrentes da possível agregação induzida pelo processo de secagem. Além disso, pode-se dizer que a natureza fluida das nanocápsulas, responsável por sua capacidade de deformação, não foi alterada pela presença do Hf, uma vez que NC-Hf também se achatam quando depositadas sobre a superfície da mica apresentando uma relação diâmetro/altura de aproximadamente 10. A maior diferença observada entre NC-Hf e NC brancas foi a presença de um material ao redor das nanoestruturas, formando camadas de aproximadamente 10 nm, o que poderia ser atribuído à formas especiais de organização de Hf ou ao seu excesso na forma de estruturas amorfas (Figuras 27 A e 27 B). Embora as camadas observadas ao redor das NC sejam semelhantes àquelas formadas pelo poloxamer (6-8 nm de altura), pode-se sugerir que, quando misturas complexas dos componentes da formulação (polímero, tensioativo, fármaco, óleo, etc.) estão presentes, o fármaco pode se associar a elas formando camadas com alturas variadas, o que torna a visualização ainda mais complexa. Essa hipótese pode ser ainda suportada por algumas evidências de medidas potencial zeta (Tabela 2) que sugerem uma provável associação do Hf à superfície de NC ( = +10,9 mV para 10,0 mg/mL) quando comparado com potencial zeta de NC branca ( = -26,7 mV), devido a contribuição de moléculas positivamente carregadas de Hf base livre.
FIGURA 27 – Imagens de nanocápsulas contendo halofantrino 0,1 mg/mL (A) e 1,0 mg/mL
(B) mostrando a presença do material ao redor das partículas. Área: 10 m x 10 m.
A