As espécies reactivas de oxigénio e o stress oxidativo in vivo

Ao longo da evolução, os organismos vivos tiveram que se adaptar ao aumento da quantidade de dioxigénio na atmosfera. Uma atmosfera primordial rica em vapor de água, dióxido de carbono e dinitrogénio deu origem a uma atmosfera rica em oxigénio molecular [1]. Actualmente são conhecidos quatro processos biológicos que geram dioxigénio, a fotossíntese, a desintoxicação de espécies reactivas de oxigénio (ERO), o metabolismo de redução de percloratos ou cloratos e a via metabólica que converte óxido nitroso em dinitrogénio e dióxigénio [2, 3]. Estes processos associados a processos químicos contribuíram para a alteração da composição da atmosfera terrestre [1- 3].

A presença de dioxigénio e a sua utilização no metabolismo celular, origina ERO, quando este não é completamente reduzido a água. A acumulação de ERO tem efeitos nocivos nos organismos, quer procarióticos quer eucarióticos [4- 6] (equação 1.1).

ē + 2H _{ē + H}+

O2 → O2-· → H2O2 → OH· → H2O (Eq. 1.1) H2O

As fontes de ERO podem ser tanto de origem endógena como exógena [7- 9]. Isto é, podem ser produzidas pela exposição a condições externas, como o aumento da pressão de dioxigénio, incidência de radiações ionizantes (radiações ), choque térmico, ou ainda pela presença de metais pesados ou de oxidantes químicos [10- 13]. Podem também ser produzidas pelos organismos como resposta imunitária, ou serem sub produtos do metabolismo celular,

como o peróxido de hidrogénio [14, 15]. Algumas ERO podem ser sinalizadores de defesa celular, mas em quantidades elevadas podem também causar a morte celular uma vez que interagem com macromoléculas de ácidos nucleicos (ADN e ARN), proteínas e lípidos [16- 20]. A peroxidação lipídica consiste na captura por um radical hidroxilo, de um átomo de hidrogénio de uma cadeia de um ácido gordo, gerando um radical de ácido gordo. Este radical por sua vez pode reagir com o dioxigénio presente no meio celular formando um novo radical peróxido, que poderá reagir com outro ácido gordo, ou com outras macromoléculas, numa reacção em cadeia. Quando a peroxidação lipídica ocorre nas membranas celulares, as ERO poderão não só atacar os lípidos, como também as proteínas membranares, induzindo ligações cruzadas entre lípidos e entre estes e as proteínas, alterando a rigidez, a fluidez e a permeabilidade membranar bem como a actividade de enzimas ligadas à membrana [12, 14 e 20].

Os açúcares e as bases dos ácidos nucleicos são igualmente atacados pelas ERO originando rupturas nas cadeias de carbono, formando aductos entre as bases e os açúcares ou

ligações cruzadas com outras moléculas, o que impede a replicação e a transcrição [14, 19 e 20]. O radical hidroxilo, em particular, reage com o ADN, retirando um átomo de hidrogénio do grupo metilo da timina formando um radical alilo, ou quebrando as ligações C-H do açúcar formando radicais aductos com duas novas ligações (C-OH). Tanto os radicais alil, como os aductos sofrem reacções em cadeia que levam à degradação da cadeia de ADN [15 ,16 e 20].

Algumas das reacções a que estão sujeitas as proteínas quando interagem com ERO são a oxidação de grupos sufidrilo, a redução de dissulfeto, reacções com aldeídos (produzidos por exemplo durante a peroxidação lipídica) e a fragmentação de peptídeos, o que leva à destruição das proteínas [15, 19 e 20].

Entre as espécies reactivas de oxigénio produzidas intracelularmente, destaca-se, o oxigénio molecular singleto (O2*), o ião superóxido (O2●-), o radical hidroxilo (HO●), os radicais peróxilo (ROO●_{), os radicais alcoóxido (RO}●_{), o peróxido de hidrogénio (H2O2) bem como} outros peróxidos orgânicos (ROOH) [21- 23]. As espécies reactivas de oxigénio têm um poder oxidante superior ao do oxigénio molecular (Tabela 1.1), sendo por isso mais reactivas que este.

Tabela 1.1 Potenciais formais de espécies reactivas de oxigénio produzidas in vivo. Par redox E0 _(V) E sp éc ies R ea ctiv as d e Ox ig én io HO_{, H}+ _{/ H2O} H2O2, 2H+ /2H2O RO_{, H}+ _{/ ROH} ONOO-_/ _NO2 ROO_{, H}+ _{/ ROOH} H2O2, H+ /H2O, HO O2, H+/ H2O2 O2 / O2- + 2,18 + 1,76 + 1,60 + 1,40 + 1,00 + 0,71 + 0,70 - 0,33

O radical hidroxilo, a ERO com maior poder oxidante (Tabela 1.1), tem um tempo de vida curto (tempo de meia-vida de 10-9 _{s) e uma difusão celular limitada, pelo que os seus} efeitos nocivos são reduzidos [7, 24 e 25]. De entre as ERO mais abundantes in vivo destaca-se ainda o ião superóxido, com um tempo de meia-vida de 10-6 _{s, e o peróxido de hidrogénio, com} um tempo de meia-vida de 10-5 _s.

O ião superóxido (O2●-) surge intracelularmente através de reacções como a de Haber- Weiss (equação 1.2), onde ocorre a transferência de um electrão do catião Fe(II) para o molécula de dioxigénio [7- 11, 26 e 27].

Reacção de Haber-Weiss (Fe2+ _{+ O}

2  Fe3+ + O2●-) (Eq. 1.2)

Todos os organismos apresentam, no entanto, mecanismos de defesa das ERO, de forma a proteger os seus componentes celulares de efeitos nocivos provocados por estas espécies, mantendo os seus níveis intracelulares em concentrações baixas [7, 10- 12, 22 e 29]. Estes mecanismos incluem a formação de substâncias antioxidantes, como o ácido ascórbico ou a

glutationa [12, 20] e a síntese de enzimas que catalisam a eliminação de espécies reactivas de oxigénio, como as dismutases do superóxido, as catalases e as peroxidases [7, 16 e 17].

A eliminação do ião superóxido pelas dismutases do superóxido é um dos mecanismos de defesa dos organismos contra as ERO (equação 1.3)

O2●- + O2●- + 2H+⇋ H2O2 + O2 (Eq. 1.3)

O peróxido de hidrogénio é uma espécie reactiva de oxigénio não radicalar com origem exógena e endógena, que se forma intracelularmente em condições de hipoxia, durante a reacção de dismutação do ião superóxido (equação 1.3), pela auto-oxidação do quinol, que produz radicais superóxido que dismutam em peróxido de hidrogénio, ou ainda pela redução do oxigénio por oxidases terminais no caso de bactérias [30-32]. Este composto, mesmo em quantidades baixas, pode provocar o aumento da oxidação de tióis de proteínas, a carbonilação de proteínas e a peroxidação lipídica [6, 23- 25], uma vez que é um forte oxidante que, por interacção com metais como Fe (II) e Cu (II), forma outras espécies reactivas de oxigénio (HO₎ [25- 27] (equação 1.4).

Reacção de Fenton (Fe2+ _{+ H}

2O2  Fe3+ + HO●+ OH-) (Eq. 1.4)

A protecção dos organismos vivos contra a acumulação de peróxido de hidrogénio implica a sua remoção, tendo os organismos sistemas enzimáticos que eliminam este composto. As bactérias, por exemplo, apresentam dois tipos de enzimas capazes de catalisar a redução do peróxido de hidrogénio: as catalases e as peroxidases [28- 31]. As primeiras interagem com substâncias capazes de dispor de dois electrões simultaneamente (equação 1.5), já as peroxidases interagem com doadores de um só electrão (equação 1.6).

2 H2O2⇋ 2 H2O + O2 (Eq. 1.5)

H2O2 + 2 H++ 2 Sred⇋ 2H2O + 2 Sox (Eq. 1.6)

(Sred – substrato no estado reduzido, Sox – substrato no estado oxidado)

As catalases catalisam a disproporcionação de H2O2 a água (equação 1.5). No caso das peroxidases bacterianas, estas reduzem o peróxido de hidrogénio a água, oxidando diversos substratos, que podem ser moléculas orgânicas como o ascorbato ou a lenhina [28, 29], ou proteínas como é o caso dos citocromos e das azurinas (que funcionam como doadores fisiológicos de electrões) [33, 34 e 51], sendo classificadas de acordo com o substrato que usam [35- 39] (equação 1.6).

As células eucarióticas também apresentam estes dois sistemas de defesa. As catalases citoplasmáticas e as peroxidases eucarióticas que estão localizadas no espaço intermembranar das mitocôndrias e contém um único hemo tipo b. A reacção global de redução do peróxido de hidrogénio a água, pelas peroxidases eucarióticas é idêntica à das peroxidases bacterianas, mas o mecanismo catalítico é muito diferente [35].