C APÍTULO 1| I NTRODUÇÃO
1.2 As peroxidases do citocromo c bacterianas dihémicas
As peroxidases do citocromo c (PCc) dihémicas foram isoladas de diversos organismos, tais como Pseudomonas (Ps.) aeruginosa [40- 44], Paracoccus (Pa.) pantotrophus [45- 53], Ps. stutzeri [54- 58], Nitrosomonas (Ni.) europaea [59- 62], Rhodobacter (Rb.) capsulatus [63- 67], Methylococcus (Me.) capsulatus [68, 69], Marinobacter (Ma.) hydrocarbonoclasticus [70, 71], Neisseria (Ne.) gonorrhoeae [72, 73], Methylomicrobium (Mm.) álbum. BG8 [74], Geobacter (Ge.) sulfurreducens [75- 76] e Shewanella (Sw.) oneidensis [77- 80]. As enzimas mais estudadas são as que foram isoladas das bactérias Ps. aeruginosa e Pa. pantotrophus.
Estas enzimas são na sua maioria periplásmicas, sendo que em alguns casos podem estar ligadas à membrana celular, como acontece no caso da lipocitocromo c peroxidase de Ne. gonorrhoeae [72] e de Herbaspirillum (He.) seropediceae [81], ou podem estar associadas à parede celular exposta ao periplasma, como no caso das bactérias metanotróficas Me. capsulatus [68] e Mm. álbum BG8 [69]. Em Mm. álbum BG8 a PCc apresenta como característica particular, a sua dependência da biodisponibilidade de ião cobre (II).
Em alguns estudos verificou-se um aumento da sua expressão quando as bactérias estão expostas a peroxinitrito, o que levou há hipótese das PCc estarem também envolvidas na eliminação deste composto [76]. Foi também proposto por alguns autores que a PCc interfira na oxidação de metilaminas [69].
1.2.1 Regulação da expressão génica das peroxidases do citocromo c bacterianas
Em condições aeróbias, as bactérias anaeróbias facultativas, como bactéria Ma. hydrocarbonoclasticus, utilizam o oxigénio molecular como aceitador final de electrões devido ao seu elevado potencial redox [7]. A alteração do metabolismo aeróbio para anaeróbio ocorre quando a quantidade de oxigénio no meio diminui e há um aceitador de electrões alternativo, como o ião nitrato, sendo este processo acompanhado por repressão dos genes ligados à respiração aeróbia, enquanto os genes ligados à respiração anaeróbia são induzidos [82- 84].
Os genes fnr e anr codificam para os reguladores da transcrição FNR (regulador da redução do fumarato e nitrato) e ANR (regulador transcripcional anaeróbio), respectivamente. Estas proteínas reguladoras estão envolvidas na mudança de metabolismo aeróbio para o anaeróbio, controlam a expressão do gene ccp (que codifica para a peroxidase do citocromo c) e dos genes nar e nir respectivamente. Estes últimos codificam para proteínas que estão envolvidas na via de desnitrificação, como a NaR (reductase do nitrato) e a NiR (reductase do nitrito) em condições de baixa tensão de dioxigénio (condições de microaerofilia) [54, 68, 84- 98].
O gene da PCc é expresso em condições aeróbias e de microaerofilia e está presente tanto em bactérias aeróbias como estritamente anaeróbias como a Ge. sulfurreducens [75, 82, 95 e 97]. Este gene está sob a acção de dois reguladores transcripcionais o FNR e o OxyR [99]. O primeiro é um regulador da activação induzido pelo oxigénio e o segundo pelo peróxido de hidrogénio [82, 85- 88].
i) O regulador da activação transcripcional FNR
O FNR é um regulador transcripcional, produto do gene fnr, que regula um grande número de genes em resposta a mudanças dos níveis de oxigénio molecular. Este regulador na forma activa e dimérica tem um domínio N-terminal com resíduos cisteína que coordena um cluster do tipo [4Fe-4S]2+, sensível ao oxigénio que se liga entre dois monómeros. Na presença de elevadas concentrações de oxigénio, o centro [4Fe-4S]2+ (forma activa) sofre alterações estruturais e transforma-se num centro [2Fe-2S]2+ (forma inactiva) [84- 92].
A sequência palindrómica de ADN reconhecida pelo FNR encontra-se na zona a montante do local de início da transcrição do gene ccp, sendo a sequência de ADN do tipo TTGAT-N4-ATCAA [82, 95, 96 e 98].
Em Ma. hydrocarbonoclasticus a sequência palindrómica encontra-se, tal como anteriormente referido, na zona a montante do local de início da transcrição do gene ccp da PCc, PCC-MauG (Figura 1.1) [100]. tttcttctgagcataactttataacctaaataaaagcgggagagcacggcttttctgcgc gacgaaatgccgcagaaagatccacaaattgcagaccggaaccaaacttgatgaacatca agttcagaaccaactctcgcgtttttgcgatgaaccacgctgccactctgttacgttgga accagatggataccgagttgttctcaaaggagaaagcgacATGATCAAGCATCCACTGGC AAAAGCACTCACCCTGAGCCTGGGCGTGGCAGCAGGTTCCGCCATGGCGGACAACCTGAT GGAACGGGCCAACAGCATGTTCGAGCCCATTCCAAAATACCCACCGGTGATTGATGGCAA TGAACTCACCCAGGCCAAGGTTGAACTGGGCAAGATGTTGTTCTTTGAACCGCGCCTGTC TTCCAGCCACCTGATCAGCTGCAACACCTGCCACAACGTCGGGCTGGGCGGTGATGACGA GCTGCCTACCTCTATCGGCCATGGCTGGCAGAAGGGTCCCCGGAACTCGCCGACGGTGTT CAACGCCGTGTTTAACGCAGCCCAGTTCTGGGATGGCCGTGCCGCCGACCTGGCCGAACA GGCCAAAGGGCCGGTACAGGCGGGTGTCGAGATGAGCAGTACGCCGGACCGGGTGGTGGC TACCCTGAAGAGTATGCCGGAGTATATCGAGCGCTTTGAGGACGCATTCCCGGGCCAGGA AAATCCGGTCACCTTCGACAATATGGCTGTTGCCATTGAAGCCTATGAAGCAACACTGAT CACCCCGGAAGCACCTTTCGACAAATATCTGCGCGGAGACACCTCAGCGCTGAACGAGAG TGAGAAAGAAGGTCTGGCGCTGTTCATGGACCGCGGCTGTACCGCCTGCCACAGTGGTGT GAACCTCGGCGGTCAGAGCTACCATCCATTCGGGCTGGTTGCCAAGCCGGGTGCCGAGAT CCTGCCAGAGGGCGATAAAGGCCGCTTCTCTGTCACCGAAACCGCGTCTGACGAGTATGT GTTCCGCGCCTCTCCGCTGCGTAACATCGAGCTGACCGCGCCCTATTTCCACTCTGGCGC CGTCTGGAGCCTGGAAGAAGCCGTTGCGGTGATGGGTACGGCCCAGCTGGGTACCGAGTT GAACGACGATGAAGTGAAATCCATCGTCGCGTTCCTCAAGACGCTTACCGGCAATGTTCC GGAAGTAACTTATCCGGTACTGCCACCAAGCACCGCCAATACGCCCAAGCCGGTGGACAT GATCCCGTAAgtcacgggctctgcattcaccctcgaaggcgcgctttcccggcgcgcctt
Figura 1.1 Sequência de ADN (NCBI Referência da sequencia: NC-017067.1) do gene ccp-MauG (VIMSS3521861: Maqu-0372 citocromo c peroxidase 349 a.a.) da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus (140 bases a montante, 1050 pares de base (gene ccp a negrito), 50 bases a jusante do gene ccp-Maug), onde se destaca a sequência de bases nucleícas reconhecida pelo regulador da transcripção FNR(dados retirados de www.microbesonline.org, acedido a 1 de Fevereiro 2013).
Em Pa. pantotrophus [83, 84 e 96], Ps. aeruginosa [93, 94], Ne. gonorrhoeae [91, 92] e Ps. stutzeri [54] verificou-se que o FNR regula não só a expressão do gene ccp [29, 95 e 97] em resposta à privação de dioxigénio [54, 95] mas também de vários genes envolvidos na desnitrificação. Em estudos com mutantes no gene fnrP em Pa. denitrificans, verificou-se que a expressão da peroxidase do citocromo c (PCc) é muito reduzida pelo que se propôs que, o FNRP controle a expressão desta proteína [96].
ii) O regulador da activação transcripcional OxyR
Em Ps. aeruginosa, Salmonella (Sa) typhimurium e Escherichia (Ec.) coli, o OxyR também é um regulador da transcrição do gene ccp, que codifica para a PCc e para a catalase, na presença de peróxido de hidrogénio [101- 106]. Em Ps. aeruginosa o gene oxyR que codifica para o regulador OxyR, localiza-se no operão com o gene recG [107]. Este gene em resposta a alterações dos níveis de peróxido de oxigénio, induz a transcrição de OxyR.
Cada molécula de OxyR apresenta dois domínios que contêm duas cisteínas, que se localizam na interface dos dois dímeros que formam um tetrâmero [108- 110
]
. A sequência palindrómica reconhecida pelo OxyR, e à qual se liga no ADN, consiste em quatro grupos de 4 bases (ATAG) espaçados por 10 pares de bases em Ps. aeruginosa [111, 112]. As formas oxidada e reduzida deste factor transcripcional contactam em diferentes locais no ADN, uma vez que nos dois locais activos de redução e oxidação as cisteínas estão em posições diferentes, resultando em alteração estrutural no domínio regulador [102, 109].1.2.2 Regulação genética de peroxidases do citocromo c nas bactérias gram-negativas
As proteínas periplásmicas bacterianas, como a PCc, são sintetizadas no citoplasma e depois transportadas para o periplasma, através da membrana citoplasmática [113, 114]. Em bactérias gram-negativas com a Pa. denitrificans [115, 116] e Rb. capsulatus [117] a translocação do apo-citocromo linear faz-se através do sistema secretor SecYEG (sistema de secreção constituído por proteínas translocadoras), já o hemo é transportado pelo sistema CcmABCDGEF (sistema de maturação de citocromos c) [118, 119].
Para a translocação através da membrana citoplasmática, a pré-apo-proteína utiliza o sistema de sinalização constituído por um peptídeo-sinal adjacente ao N-terminal da cadeia polipeptídica, que permite ao sistema de transporte membranar (SecYEG) reconhecer e translocar para o periplasma a pré-apo-proteína. Após o transporte da pré-apo-proteína para o periplasma, o péptideo-sinal é removido por clivagem por acção de uma peptidase-sinal, formando a apo-proteína (Figura 1.2) [115- 119].
Figura 1.2 Esquema da organização do sistema de maturação de citocromos tipo c (Ccm) na membrana citoplasmática e da translocação do hemos em bactérias Gram-negativas [112, 113]. O pré-apo-citocromo é transferido do citoplasma para o periplasma translocador SecYEG (sistema de transporte secretor) e o grupo hemo pelo sistema de transporte complexo CcmABC, CcmD e CcmE. A incorporação do hemo no apo-citocromo ocorre em CcmF, usando electrões transferidos pela proteína transmembranar DsbD (oxidoreductase dissulfureto). Os sistemas CcmG e CcmH libertam o citocromo para o periplasma [112, 113 e 119]. O sistema de maturação de citocromo tipo c, Ccm, é constituído por proteínas membranares ou que estão ligadas á membrana (CcmABCDEFGH e DsbD). As setas são caminhos do sistema de maturação (Figura adaptada da referência 113, 114 e 119).
Na PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus, o peptídeo-sinal é composto pelos primeiros resíduos que apresentam características de peptídeo-sinal (peptídeo hidrofóbico localizado no extremo N da cadeia polipetídica) e são reconhecidos pelo sistema secretor SecYEG. Este peptídeo sinal inicia-se no primeiro aminoácido (metionina) terminando no aminoácido 23, sendo o domínio da apo-proteína PCc do aminoácido 24 ao 289 (previsão obtida em http//www.signalP.4.1) (Figura 1.3) [120]. MIKHPLAKALTLSLGVAAGSAMADNLMERANSMFEPIPKYPPVIDGNELTQAKVELGKML FFEPRLSSSHLISCNTCHNVGLGGDDELPTSIGHGWQKGPRNSPTVFNAVFNAAQFWDGR AADLAEQAKGPVQAGVEMSSTPDRVVATLKSMPEYIERFEDAFPGQENPVTFDNMAVAIE AYEATLITPEAPFDKYLRGDTSALNESEKEGLALFMDRGCTACHSGVNLGGQSYHPFGLV AKPGAEILPEGDKGRFSVTETASDEYVFRASPLRNIELTAPYFHSGAVWSLEEAVAVMGT AQLGTELNDDEVKSIVAFLKTLTGNVPEVTYPVLPPSTANTPKPVDMIP
Figura 1.3 Sequência de aminoácidos da PCc de Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 49840, onde se destaca o peptídeo-sinal (caixa cinzenta). Previsão obtida em http//www.signalP.4.1 [120].
1.2.3 Alinhamento da sequência primária de peroxidases do citocromo c dihémicas
O alinhamento da sequência primária das PCc cuja estrutura terciária é conhecida, evidência uma grande homologia estrutural entre estas enzimas. Na Figura 1.4 apresenta-se o alinhamento da sequência primária de algumas PCc bacterianas, onde se destacam a cinzento os aminoácidos conservados e a vermelho os semi-conservados, bem como os hemos e os Loop, que serão seguidamente descritos.
Hemo P Loop 1
Pp 56 LGKVLFFDPRMSSSGLI SCQTCH NVGLGGVDGL PTSIGHGWQKGPRN EPTMLNA 104