Crescimento da bactéria Marinobacter hydrocarbonoclasticus 617 1 O microrganismo

As proteínas estudadas neste trabalho (peroxidase do citocromo c e citocromo c552) foram isoladas de uma cultura pura da bactéria Ma. hydrocarbonoclasticus da colecção do Instituto Pasteur com a referência nº 617/1.85 (estirpe 617), fornecida pelo laboratório CNRS de Marselha. Esta bactéria halofílica foi isolada em 1985 num sedimento marinho no golfo de Fos (Marselha) e depositada no Instituto Pasteur com o nome de Pseudomonas nautica e o número 617/1.85 [212- 214]. Após um estudo baseado em análises comparativas entre morfologia, fenótipo e genótipo Spröer e colaboradores reclassificaram esta espécie como Marinobacter hydrocarbonoclasticus [215].

Em 2012 foi publicado o genoma da bactéria Ma. hydrocabonoclasticus ATCC 49840 [100]. Este apresenta um único cromossoma com uma percentagem de G+C de 57,43 % e um tamanho de 3989480 bases nucleicas, que codifica para 39 a 42 citocromos com um ou mais grupos hémicos [100].

2.1.2 Preparação do meio de cultura líquido e sólido

O meio de cultura líquido utilizado nos crescimentos de Ma. hydrocarbonoclasticus teve a composição indicada na Tabela 2.1 e foi suplementado com as soluções indicadas na Tabela 2.2. A solução de oligoelementos de Starkey [216] usada teve a composição indicada na Tabela 2.3. Todas assoluções foram preparadas com reagentes de grau analítico.

Tabela 2.1 Composição do meio de cultura líquido, para o crescimento da bactéria Ma.

hydrocarbonoclasticus. O pH do meio foi ajustado a 7,5 e o meio foi esterilizado numa autoclave [70].

Composto Quantidade por litro

NaCl MgSO4.7H20 KCl Tris-base NH4Cl CaCl2. 2 H20 Extracto de levedura Na-Lactato 60% (m/m)* 11,7 g 12,3 g 0,75 g 6,05 g 3,00 g 1,47 g 1,00 g 12,5 ml

*Correspondendo a uma concentração final de 0,8 % (m/V)

Tabela 2.2 Soluções adicionadas ao meio de cultura líquido para o crescimento da bactéria Ma.

hydrocarbonoclasticus. Estas soluções foram preparadas e autoclavadas separadamente [70].

*Adicionar 2 a 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado a esta solução.

Solução Quantidade por litro

FeSO4.7H2O (1 mg/mL)*

K2PO4.3H20 (18,6 mg/mL)

Solução de oligoelementos de Starkey

2,0 mL 4,0 mL 1,0 mL

Tabela 2.3 Composição da solução de oligoelementos de Starkey [216]. Esta solução foi esterilizada numa autoclave.

Reagente Quantidade por litro

FeSO4.7H2O ZnSO4.7H2O MgSO4.4H2O CuSO4.5H2O CoSO4.7H2O BO3H3 Mo7(NH4)6O24.4H2O Ni(NO3)3.6H2O Na2SeO3 HCl concentrado (~12M) 6,20 g 1,44 g 1,12 g 0,25 g 0,90 g 0,06 g 1,00 g 0,04 g 0,02 g 51,4 mL

O meio de cultura sólido, preparado por mistura de meio de cultura líquido com solução de agar, teve a mesma composição que o meio de cultura líquido. No entanto, a solução de meio de cultura e a solução de agar foram preparadas separadamente, sendo que o meio de cultura líquido foi preparado com o dobro da concentração tal como a solução de agar, para que a concentração final de agar seja 15 g/L de meio de cultura. Após aquecer o agar a 50.ºC, estas duas soluções foram adicionadas uma á outra e colocadas em placas de Petri. As placas foram mantidas a 4.ºC (no máximo durante 2 semanas) até serem usadas.

2.1.3 Condições de crescimento

A cultura pura de Ma. hydrocarbonoclasticus foi mantida através de crescimentos em meio sólido. Após inoculação, as placas foram incubadas a 30 ºC, durante 24 horas. A cultura foi repicada de duas em duas semanas.

A massa celular de Ma. hydrocarbonoclasticus, necessária para o isolamento das proteínas em estudo, foi obtida através de crescimentos num microfermentador de 10 L (Sartorius- (BiostalB plus)). Para tal, foi necessário realizar uma série de pré-inóculos, os quais se iniciaram com a inoculação de 5 mL de meio de cultura num erlenmeyer de 50 mL, a partir do crescimento em placa. Este pré-inóculo foi incubado durante 24 horas, sob agitação orbital a 230 rpm à temperatura de 30 ºC, e usados para inocular 20 mL de meio de cultura (num erlenmeyer de 100 mL), incubados como descrito anteriormente. Deste último crescimento, foram usados 25 mL para inocular 225 mL de meio (num erlenmeyer de 1 L), incubados nas condições referidas. Um litro deste inóculo foi usado para inocular 9 L de meio de cultura num microfermentador.

Em cada um destes passos foi feita a leitura da densidade óptica a 600 nm, assim como a verificação da pureza da cultura num microscópio óptico (Olympus BX 51) (Figura 2.1).

Figura 2.1 Cultura da bactéria Gram-negativa Ma. hydrocarbonoclasticus em meio de cultura líquido, recolhido de um microfermentador de 10 L, após 3 horas de incubação. A morfologia típica desta bactéria (bastonetes) pode ser observada nesta imagem obtida com um microscópio óptico (ampliação de 1000 x/1.3 oil Ph3).

No microfermentador, o meio de cultura esterilizado foi suplementado com a solução de oligoelementos anteriormente descrita (Tabela 2.3) e com as soluções de sulfato de ferro e de hidrogenofosfato de potássio, nas proporções indicadas na Tabela 2.2.

Todos os crescimentos foram termostatizados a 30 ºC, com um arejamento de 0,2 vvm e o pH do meio foi mantido a 7,5, através da adição automática de ácido clorídrico 1 M (esterilizada por autoclavagem) e hidróxido de sódio 1 M (esterilizada por autoclavagem). A fonte de carbono e energia foi o lactato, numa concentração final de 0,8 % (m/V). Todos os crescimentos no microfermentador tiveram a duração de 42 horas.

As condições testadas nos diferentes crescimentos efectuados no microfermentador, de forma a optimizar a quantidade de peroxidase de citocromo c foram: a velocidade de agitação e a quantidade de nitrato de sódio adicionado ao meio de cultura (Tabela 2.4)

Tabela 2.4 Quantidade de nitrato de sódio e velocidade de agitação utilizadas em cada um dos crescimentos realizados no microfermentador. Crescimento [NaNO3] (µM) Agitação (rpm) 1 - 150 2 Vestigial 150 3 15 150 4 30 150 5 120 150 → 50

A monitorização da temperatura, pH e oxigénio dissolvido no meio foi realizada com um sensor de temperatura (Radiometer) e eléctrodos específicos, que se encontravam imersos

no meio de cultura e que foram previamente calibrados (Figura 2.2). O eléctrodo de pH (Mettler Toledo) foi calibrado de acordo com o protocolo de calibração de eléctrodos CRISON, utilizando soluções padrão de pH 4,0, 7,0 e 9,0. No caso do eléctrodo de oxigénio (Hamilton), o 100 % de oxigénio dissolvido foi estabelecido após a saturação do meio com ar.

Figura 2.2 Esquema do microfermentador de 10 litros onde se efectuaram os crescimentos da bactéria

Ma. hydrocarbonoclasticus.

Na Figura 2.3 apresenta-se a curva de crescimento obtida no crescimento 5 (Tabela 2.4) evidenciando a percentagem de dioxigénio dissolvido ao longo do crescimento.

Figura 2.3 Curva de crescimento da bactéria Ma. hydrocarbonoclasticus, obtida num fermentador de 10 L em que (─) representa a percentagem de oxigénio dissolvido registada ao longo do crescimento e ()

representa o logaritmo da densidade óptica a 600 nm ao longo do tempo. Condições de crescimento: lactato 0,8 % (m/V), NaNO3 120 µM, pH 7,5, velocidade de arejamento 0,2 vvm. A velocidade de

Após 42 horas as células foram recolhidas por centrifugação a 14000 g ressuspendidas em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) (1 mL/g de massa celular húmida) e mantidas a -80 ºC até serem usadas. A massa de células resuspendidas variou entre 96 e 111 g nos vários crescimentos (Capítulo 3| ).

2.2 Purificação das proteínas de Ma. hydrocarbonoclasticus