Aspectos da histoarquitetura dos tecidos interpúbicos de camundongos não prenhes, prenhes e no pós-parto

Durante a prenhez, o remodelamento dinâmico do sistema musculoesquelético do camundongo produz modificações da histoarquitetura da SP e Lip em fases que se sobrepõem e são conhecidas como separação, relaxamento e recuperação da forma desses componentes que dão suporte ao canal de parto (Figura 3). A comparação da composição tecidual da SP de animais NP (Figura 3A) com aquela do 12d permite identificar aspectos relacionados ao início da separação dos ossos púbicos durante a prenhez. Essa etapa é marcada pelo remodelamento gradual das porções cartilaginosas e ósseas da sínfise, enquanto a compacta lâmina de fibrocartilagem interposta aos coxins de cartilagem hialina passa por uma série de modificações moleculares que proporcionam o aparecimento de um Lip elástico, observado no 15d. O Lip fixa-se aos ossos por uma entesis osteoligamentosa sendo envolto por tecido conjuntivo denso, que se continua ventral e dorsalmente com o periósteo e pericôndrio da articulação.

Após o 15d (Figura 3C), o Lip sofre grandes modificações com rápido e pronunciado amolecimento nos últimos 2 dias de gestação. O remodelamento acelerado leva ao “relaxamento” do ligamento verificado nos 18d e 19d (Figura 3D), sendo este último o dia do parto. O relaxamento da histoarquitetura do Lip nesse período favorece a observação de características de ligamento, tais como: presença de células alongadas com núcleos de cromatina frouxa, de fenótipo semelhante a fibroblasto, cujos maiores eixos mostram-se alinhados paralelamente ao maior eixo do espaço interpúbico ou direção do afastamento dos ossos. No que diz respeito às características da matriz extracelular do Lip, fica evidente a mudança do arranjo das fibras colágenas com aumento do espaço entre as mesmas, que resulta no aspecto “esgarçado” do tecido conjuntivo, o qual, por sua vez é associado ao acúmulo de substância fundamental da matriz depositada nos espaços interfibrilares e intercelulares, caracterizando o aspecto relaxado do ligamento nessa etapa da prenhez.

No 1dpp, as células alongadas, semelhantes a fibroblastos, ainda apresentam seus maiores eixos orientados paralelamente ao maior eixo do ligamento. No entanto, na matriz extracelular, as fibras readquirem o arranjo compacto semelhante àquele observado durante a “separação”. O remodelamento do ligamento e a reaproximação dos ossos púbicos se

aceleram no 3dpp (Figura 3E), e os tecidos interpúbicos recuperam, gradativamente, o aspecto de tecido conjuntivo denso da histoarquitetura semelhante à da fase de separação dos ossos púbicos. Nessa etapa, as adaptações, que ocorrem tanto no tecido conjuntivo denso do Lip quanto nas entesis e coxins de cartilagem hialina, contribuem para uma significativa redução do espaço e recuperação de histoarquitetura que se assemelha à da SP, a exemplo do que se observa no 10dpp.

Figura 3: Fotomicrografias da SP (A; B e G) e do Lip (C-F) de camundongos não prenhes (A) e prenhes (B-D). Em A; B e G (NP, 12d e 10dpp), observa-se a histoarquitetura característica de sínfise

fibrocartilaginosa (FC) composta por tecido conjuntivo denso e células de fenótipo condrogênico. Na sínfise, a fibrocartilagem se localiza entre coxins de cartilagem hialina (CH), recobrindo a superfície dos ossos púbicos. Em C e D (15d e 19d), a fibrocartilagem é substituída pelo ligamento, e os fibroblastos se posicionam paralelamente em relação ao maior eixo da articulação (seta), juntamente com as fibras de colágeno (cabeça de seta). No detalhe em D, note a orientação dos fibroblastos com as fibras de colágeno. Em (E) a entesis ao 3dpp e a região próxima ao osso com grande densidade celular, em (F) 5dpp e em (G)10dpp observe a presença de fibrocartilagem ocupando o centro do espaço interpúbico. Note em C e D a região de transição (RT). Hematoxilina-Eosina Barras: A, B, C, E, F e G: 50µm. D: 30µm e detalhe: 30µm.

4. 2 Detecção das Proteínas COMP e GAL-3 nos tecidos interpúbicos de fêmeas não prenhes, prenhes e no pós-parto

A detecção imunohistoquímica das proteínas COMP (Figura 4) e GAL-3 (Figura 5) permitiu o reconhecimento de expressões espaciais e temporalmente reguladas dessas

proteínas nos tecidos interpúbicosde camundongos NP; prenhes (15d e 19d) e no pós-parto

(5dpp e 10dpp).

A imunoexpressão da COMP foi detectada em poucas células da zona de transição

entre a fibrocartilagem e coxins de cartilagem hialina da SPde camundongos NP (Figura

4A). Durante a separação dos ossos púbicos na prenhez, particularmente no 15d (Figura 4B), a imunomarcação COMP foi localizada no citoplasma da maioria das células da região de transição fibrocartilaginosa enquanto na região central no ligamento interpúbico em formação apresentou reação difusa na matriz.

Durante o relaxamento, particularmente no 19d (Figura 4C) a ocorrência de células que apresentam marcação para COMP mostra-se reduzida na delgada transição fibrocartilaginosa enquanto, no ligamento relaxado, a marcação da matriz mostra-se igualmente difusa. Na etapa em que ocorre a reaproximação dos ossos púbicos, majoritariamente no 5dpp (Figura 4D), os condrócitos da cartilagem em remodelação se destacam com maior intensidade de marcação, enquanto, no 10dpp (Figura 4E), a expressão da COMP é qualitativamente menor na transição e na porção cartilaginosa, e tem aspecto difuso no tecido conjuntivo denso em remodelamento.

A detecção imunohistoquímica da GAL-3 em camundongos NP mostrou-se positiva em alguns condrócitos e fibrocondrócitos da SP de camundongo. Durante a separação

dos ossos púbicos, a avaliação qualitativa mostrou aumento relativo de células imunomarcadas na transição fibrocartilaginosa e no ligamento interpúbico em formação no 15d. Durante o relaxamento, a ocorrência de células que apresentam marcação para GAL-3 foi detectada tanto no osso subcondral quanto na região de transição correspondente à entesis do Lip relaxado do 19d. Na etapa em que ocorre a reaproximação dos ossos púbicos, a imunoexpressão da GAL-3 mostrou-se presente tanto nas células da transição fibrocartilaginosa do espaço interpúbico no 3dpp quanto nos condrócitos hipertróficos dos coxins de cartilagem hialina que recobrem os ossos púbicos no 10dpp.

Figura 4: Fotomicrografias ilustrativas de reações imunohistoquímicas para detecção de COMP em secções representativas de amostras de tecidos interpúbicos de animais NP (A) e Lip; prenhes 15d (B e F); 19d (C) e no pós-parto; 5dpp (D); 10dpp (E). Em F, controle negativo da reação em tecidos

interpúbicos do 15d. Nessa figura, observam-se células imunomarcadas em menor número na SP (A). Qualitativamente é notada maior marcação nas células da transição fibrocartilaginosa na etapa da separação dos ossos no 15d (B). Durante o relaxamento, no 19d (C), a marcação é qualitativamente menor no compartimento celular da transição fibrocartilaginosa e difusamente distribuída na MEC do ligamento relaxado. No pós-parto, a marcação se mostrou qualitativamente mais intensa no 5dpp (D). No 10dpp (E), observa-se a marcação positiva em células da cartigem hilania (E) e de forma difusa MEC do Lip em involução. Revelação diaminobenzidina e contracoloração por Hematoxilina de Harris. Barras= A, C e F: 30µm; B, D e E: 50µm.

Figura 5: Fotomicrografias ilustrativas de reações imunohistoquímicas para detecção de GAL-3 em secções representativas de amostras de tecidos interpúbicos de animais NP (A) e Lip; prenhes 15d (B e F); 19d (C) e no pós-parto; 3dpp (D); 10dpp (E). Em F, controle negativo da reação em tecidos

interpúbicos do 15d. Observam-se células que expressam a GAL-3 em menor número na SP de animais NP (A). Qualitativamente maior marcação nas células da transição fibrocartilaginosa ocorre na etapa da separação dos ossos no 15d (B). Durante o relaxamento 19d (C), a marcação é evidente em células da entesis fibrocartilaginosa. No pós-parto, a marcação se mostrou presente em células dos coxins de cartilagem no 3dpp. No 10dpp se observam marcação positiva em condrócitos hipertróficos de coxim de cartilagem hialina. Revelação diaminobenzidina e contra coloração por Hematoxilina de Harris (A, B, D, E e F) Verde de Metila (C) Barras: A, C, D e F =30µm; B e E = 50µm.

4.3 Aspectos ultraestruturais da interação entre células e MEC nos tecidos