MONICA MARIA MOREIRA DA SILVA
"ESTUDO DO COMPORTAMENTO BIOMECÂNICO E DA
EXPRESSÃO GALECTINA- 3 E COMP, BIOMARCADORES
DO TURNOVER DE TECIDOS ARTICULARES DA SÍNFISE
PÚBICA DE CAMUNDONGOS DURANTE A PRENHEZ E
POS-PARTO"
ABSTRACT
In mice, the pubic symphysis (PS) is metabolically active during pregnancy. Adaptations orchestrated by hormones and mechanical overload that the symphysis goes through during this period, which gradually gives place to an interpubic ligament (IpL) and the relaxation at the end of pregnancy, allows the passage of offspring through the birth canal. Such changes provide an opportunity to study remodeling of tissues such as those that occur in disorders and dystopias of the female pelvic floor.
We studied morphological, immunohistochemical analysis of galectin-3 (GAL3) and Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP) proteins and the biomechanical behavior in young adult females PS mice during first pregnancy and postpartum (dpp) through conventional histological techniques, immunohistochemistry and light,transmition and scanning electron microscopies.
In analyzes of fibrillar organization we used fast Fourier transform and the biomechanical behavior destructive tensile testing in a universal testing machine with constant speed and progressive force in the PS/IpL C57BL6 mice groups: (NP-control), 12, 15 and 19 days (d)
after checking the vaginal plug and 3th, 5th and 10thpp. In tensile testing the maximum force
required to initiate the rupture of the tissue decreased in the course of pregnancy, with the lowest value measured at day of birth, increasing from this day on and at the 10dpp returned to the NP individual’s value.The total rupture energy (TRE) decreasesat d12 and increased from d15 until 5dpp, decreasing at the 10dpp but remained lower than the NP. Immunolocalization of COMP and GAL3 proteins were detected in all groups, with variations in cell type and location. The bicornuate uterus morphology of the mice and the weight of the uterus with cubs alter the mechanical stimuli in interpubic tissues, contribute to its remodeling. In 3dpp when mechanical stimuli were abruptly removed at birth. It was observed organelles consisting of microtubules that were similar to a solitary cilium quoted as mechanosensory organelle.The biomechanical behavior of interpubic tissues during pregnancy and after delivery was consistent with the histoarchitecture and immunolocalization of COMP and GAL-3 protein, as the biomechanical behavior of the tissue changes are indicative that these proteins are involved in the remodeling of transitions bony and ligamentous elements and fibrocartilaginous during pregnancy and after childbirth. This remodeling that provides removal of pubic bones and a quick postpartum recovery, offers birth canal support of animals that have bicornuate uterus such as the mouse, guinea pig and bat.
RESUMO
Em camundongos, a sínfise púbica (SP) é metabolicamente ativa durante a prenhez. As adaptações orquestradas por hormônios e a sobrecarga mecânica imposta na sínfise, que gradualmente dá lugar ao ligamento interpúbico (Lip) e ao seu "relaxamento" no final da prenhez permitem a passagem da prole pelo canal do parto. Tais modificações oferecem oportunidade para estudo de remodelação de tecidos semelhantes às que ocorrem nas disfunções e distopias do assoalho pélvico feminino. Estudaram-se características morfológicas, imunohistoquímica das proteínas Galectina-3(GAL3) e CartilageOligomericProtein Matrix (COMP) e o comportamento biomecânico, na SP de camundongos fêmeas adultas jovens, durante a primeira prenhez e após o parto por meio de técnicas histológicas convencionais, imunohistoquímica, microscopia de luz, eletrônica de transmissão e varredura. Nas análises da organização fibrilar utilizou-se transformada rápida de Fourier (FFT) e do comportamento biomecânico ensaio destrutivo de tração uniaxial em máquina de testes universal com velocidade constante e força progressiva nas SP/Lip de camundongos C57BL6 grupos: (NP-controle), 12, 15 e 19 dias
(d) após a verificação do plug vaginal e no 30, 50 e 100dias após o parto (dpp). No ensaio
de tração uniaxial, a força máxima necessária para o início da ruptura do tecido diminuiu no decorrer da prenhez, sendo o menor valor medido no dia do parto, aumentou a partir deste dia, e no 10dpp retornou a valores próximos aosdos animais NP. A energia total de ruptura (ETR) diminuiu no 12d e a partir de 15d aumentou até o 5dpp, no 10dpp, diminuiu porém se manteve menor que o NP. Na Imunolocalização das proteínas COMP e GAL3 foram detectadas em todos os grupos, com variações no tipo celular e na localização. A morfologia bicorne do útero de camundongos e o peso do útero com os filhotes alteram os estímulos mecânicos nos tecidos interpúbicos e contribuem para sua remodelação. No 3dpp, quando os estímulos mecânicos foram abruptamente retirados no parto, observaram-se organelas compostas por microtúbulos semelhante a cílio solitário não móvel, citado como organela mecanosensorial. O comportamento biomecânico dos tecidos interpúbicos durante a prenhez e após o parto foi coerente com a histoarquitetura destes e a imunolocalização das proteínas COMP e GAL-3, à medida que o comportamento biomecânico dos tecidos se modifica são indicativos que essas proteínas estão envolvidas no remodelamento de transições de elementos ósseos e ligamentares e fibrocatilaginosas durante a prenhez e após o parto. Este remodelamento que proporciona afastamento de ossos púbicos e a rápida recuperação que se inicia pós-parto, oferece suporte ao canal de parto de animais que possuem útero bicorne a exemplo do camundongo, morcego e cobaia.
SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO... 16 2.OBJETIVOS... 23 3.MATERIAIS E MÉTODOS... 24 4. RESULTADOS... 32 5.DISCUSSÃO... 52 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 66 ANEXOS... 77
AGRADECIMENTOS
Agradeço à UNICAMP e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, pela oportunidade.
À CAPES, pelo financiamento do “Dinter novas fronteiras”, indispensável à realização deste trabalho.
À Universidade de Pernambuco, em especial à Prograd, pelo apoio financeiro nos hiatos do apoio da CAPES.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo Pinto Joazeiro, pela atenção, paciência e oportunidade.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual Animal, em especial a Stephanie, Cinta, Célia e D. Raquel pelo acolhimento.
À secretária Liliam Panagio, pela paciência e eficiência.
À colega e amiga Viviane Rosa, por toda dedicação e disponibilidade em ensinar sempre, além de me oferecer hospedagem no último ano, sem sua colaboração não teria chegado aqui.
A todos os colegas do Departamento, em especial àqueles que estiveram mais próximos Viviane, Sílvio, Bianca e Lucimara, tornando assim o trabalho e os dias no Departamento muito mais agradáveis.
Aos colegas da turma do Dinter da UPE, em especial aos do campus Petrolina: Juliana, Leilyane e Adauto.
Aos meus irmãos, Ana Christina e Luiz Regino, pela hospedagem e pelo apoio aos meus filhos nas minhas ausências e, finalmente, aos mais importantes: meus filhos, César e Ana Regina, motivo da minha permanência neste programa, diante das inúmeras dificuldades ao longo desses quatro anos, e meu grande pai HÉLIO MOREIRA, exemplo de dedicação e trabalho e à minha mãe Ana Regina (in memorian), motivo de orgulho e admiração.
LISTA DE ABREVIATURAS
3dpp - 3 dias pós-parto 5dpp - 5 dias pós-parto 10dpp - 10 dias pós-parto CH- Cartilagem Hialina
COMP- Proteína Oligomérica da Matriz Cartilaginosa 12d - 12º dia de prenhez
15d - 15º dia de prenhez 19d - 19º dia de prenhez ETR- Energia Total de Ruptura
FFT- Transformada Rápida de Fourier GAL-3- Galectina 3
Lip - Ligamento Inter Púbico MEC - Matriz Extracelular
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura MMP- Metaloprateinase da Matriz
NP- não prenhe
POP- Prolapso de Órgãos Pélvicos SP –Sínfise Púbica
1. INTRODUÇÃO
Alguns mamíferos, como morcegos, cobaias e camundongos, apresentam drástico remodelamento de componentes musculoesqueléticos, que dão suporte a pelve durante a prenhez, particularmente a sínfise púbica (SP), para permitir acomodação do canal de parto e passagem dos fetos sem distocia. Nos animais não prenhes (NP), essa junta é constituída de dois coxins de cartilagem hialina, que revestem os ossos púbicos os quais se conectam por um disco fibrocartilaginoso (CRELIN, 1969; TALMAGE, 1947 a-b; HALL, 1947; HAM, 1972).
No camundongo, a histoarquitetura da SP proporciona grande suporte biomecânico à integridade de órgãos pélvicos em machos (YIOU, et al., 2001) e nas fêmeas, particularmente no que diz respeito ao canal de parto; o emprego de métodos morfométricos evidenciou variações nas dimensões de ossos pélvicos no pós-parto (SCHUTZ et al., 2009).
Por volta do 12º dia da prenhez (12d), os tecidos interpúbicos da SP de camundongo ainda mostram características morfológicas de estrutura adaptada para dissipar e amortecer as forças de compressão que atuam sobre a pelve durante o movimento. Após esse período, a região central da articulação, particularmente seu disco fibrocartilaginoso, se remodela para dar lugar ao ligamento interpúbico (Lip). Reconhecidamente o Lip, tem o papel de manter unidos os ossos púbicos, guiar os movimentos durante a remodelação e evitar deslocamentos anormais dos ossos e, consequentemente resistir às instabilidades de estruturas pélvicas durante a prenhez, parto e pós-parto. No camundongo, os tecidos interpúbicos remodelam aceleradamente, em três fases distintas, que se sobrepõem para permitir a separação dos ossos púbicos, fase em que a SP dá lugar ao ligamento; o relaxamento do ligamento, que permite a acomodação do canal de parto para a passagem da prole; e o retorno dos ossos no pós-parto (BECKER et al., 2010; JOAZEIRO et al., 2014).
No camundongo, o remodelamento, que leva ao relaxamento do Lip durante a etapa final da prenhez, bem como o retorno da fibrocartilagem após a primeira gestação requerem um fino balanço tanto no que diz respeito à proliferação e morte celulares (VERIDIANO et al., 2007) quanto à deposição e degradação da matriz extracelular (MEC). Observou-se, na matriz, que, se por um lado a deposição de fibras colágenas, elásticas, proteoglicanos e ácido hialurônico de altos pesos moleculares contribuem para a máxima
expansão e flexibilidade do Lip (CONSONNI et al., 2012a; ROSA et al., 2012; GARCIA et
al., 2008; MORAES et al., 2003; PINHEIRO et al., 2003-05). Por outro lado, o delicado
equilíbrio entre as expressões de metaloproteases (MMP) -8 (do 12d ao 15d), MMP-2 e -9 (do 15d ao 19d), catepsina B, da protease ADAMTS1 (A Disintegrin-like And
Metalloprotease with Thrombospondin type 1 motif) e dos inibidores de metaloproteases
TIMP-1 e -2, na ausência de células granulocíticas, evidenciaram importante papel dessas macromoléculas no remodelamento dos tecidos interpúbicos, particularmente no relaxamento que precede o parto (ROSA et al., 2008, ROSA et al., 2011-12).
Além da expressão espaço-temporalmente regulada de componentes da MEC, células semelhantes aos fibroblastos, presentes nos tecidos interpúbicos de animais NP e prenhes, expressam continuadamente alfa-actina de músculo liso e, transitoriamente, vimentina e desmina no Lip. No ligamento essas células apresentam características ultra-estruturais típicas de miofibroblastos (MORAES et al., 2004).
Ainda no que diz respeito aos fatores que contribuem para o relaxamento da SP do camundongo durante a prenhez, demonstrou-se que as células semelhantes a fibroblastos são capazes de gerar óxido nítrico (NO) e têm a capacidade de aumentar, significativamente, os níveis de expressão do RNA mensageiro da enzima óxido nítrico Sintase (iNOS), induzida no final da prenhez, especificamente entre o 18d (quando o Lip se mostra parcialmente relaxado) e o 19d (dia do parto). Consequentemente, o aumento de NO tem potencial para contribuir, de modo eficiente, para o relaxamento do Lip e, consequentemente, para a adequada acomodação do canal do parto e, ainda, para que este ocorra sem distocia (MORO et al., 2012).
A complexidade descrita anteriormente e a velocidade do remodelamento durante a prenhez e pós-parto fizeram desses animais modelos experimentais de adaptações de tecidos sob estímulos hormonais, particularmente da relaxina, além de outros mecânicos e funcionais (SHERWOOD, 1994; NAQVI et al., 2005), até mesmo em ambientes especiais, como o de microgravidade (BLABER et al., 2013). Devido à magnitude desse fenômeno, ele foi descrito como uma “metamorfose” da SP em Lip (GARDNER, 1936).
Reconhecidamente, durante o desenvolvimento dos embriões, são necessárias modificações nos órgãos reprodutores e em estruturas do sistema locomotor, que dão suporte a estes e se constituem no canal duro do parto, como a pelve e suas articulações, a sacroilíaca na região dorsal e ventralmente a SP. Os hormônios da gestação,
principalmente estrógeno e relaxina, são responsáveis pela fina regulação das adaptações necessárias à criação do ambiente ideal não somente para o desenvolvimento intrauterino da prole nos mamíferos, particularmente no camundongo, como permitir o parto seguro (SHERWOOD, 1994; CROY et al., 2014).
O tecido conjuntivo caracteriza-se por grande quantidade de MEC, composta por um complexo conjunto de macromoléculas e fibras, que, de acordo com a organização e proporção destes, definem suas propriedades biomecânicas. Curiosamente, esses aspectos despertaram a atenção de Storey et al., (1957), que, há quase 60 anos, propuseram um elegante estudo para caracterização biomecânica das diferenças observadas no limite elástico e resistência máxima à tração apresentados por ligamentos interpúbicos e sínfises fibrocartilaginosas de camundongos virgens e prenhes. Este estudo permitiu a inferência de que os aumentos no limite elástico são devidos, respectivamente, ao maior ou menor deslizamento das fibras colágenas, umas sobre as outras, assim como a existência do que, posteriormente, foi descrito como crimp de fibras colágenas (RUNDGREN, 1974; PINHEIRO et al., 2004).
Se, por um lado, os estudos de propriedades biomecânicas na sínfise de modelos experimentais despertaram pouca atenção, por outro a determinação de propriedades biomecânicas de tecidos e/ou estruturas dos componentes do útero, da cérvice e da vagina se tornou algo intuitivo. Estes modelos despertaram a atenção de pesquisadores que associam as modificações de estruturas do canal parto às características biomecânicas de cada componente, particularmente daqueles que compõem o canal de parto (READ et al., 2007; RAHN et al., 2008; ABRAMOWITCH et al.,
2009; ASHTON-MILLER e DELANCEY, 2009 ; BUHIMSCHI et al., 2009; HOUSE et al.,
2009; DA SILVA-FILHO et al., 2010; FEOLA et al., 2011-2014; VARGIS et al., 2012; ZHOU et al., 2012).
Os dados sobre as propriedades biomecânicas tanto da sínfise de modelos experimentais quanto de humanos são muito escassos, particularmente os da sínfise humana durante a gestação, que pode ser atribuído, sobretudo a razões éticas. No entanto, os dados disponíveis sobre o canal de parto, em especial sobre a cérvice uterina, são numerosos (BUHIMSCHI et al., 2007 e 2009; DA SILVA-FILHO et al., 2010; FEOLA et
al., 2011-2014. Partindo-se do pressuposto de que as propriedades biomecânicas dos
tecidos pélvicos retornam ao normal após o primeiro parto (RUNDGREN, 1974), e para tal, são cruciais processos de restabelecimento da homeostase dos tecidos conjuntivos no
pós-parto. De um modo geral, associa-se o prolapso às falhas no reparo (como a síntese e organização de componentes da MEC) de fibras elásticas, as quais podem resultar em alterações irreversíveis na biomecânica dos tecidos conjuntivos e contribuir para as patologias dos órgãos pélvicos (RAHN et al., 2008).
Estudos têm focalizado o decréscimo na expressão das proteínas estruturais, importantes para a manutenção das características biomecânicas da matriz, relacionadas ao trajeto do parto, no que diz respeito à redução quantitativa das fibras de colágeno (WONG et
al., 2003). Liu et al., (2004 e 2006), estudaram às falhas na homeostase das fibras colágenas
e elásticas da MEC e encontraram acentuada redução dos transcritos e da produção de elastina em fibroblastos da pelve de mulheres com prolapso de órgãos pélvicos, e Yamamoto
et al. (1997) em fibroblastos in vitro. Enquanto Rosenbloom et al., (1993) e Chen et al. (2005)
sugeriram que a ativação do gene da elastina, seja via hormônio-dependente.
De um modo geral, a histoarquitetura da fibrocartilagem encontrada na SP de camundongo é semelhante à que está presente em outros modelos de tecidos moles viscoelásticos. Pode-se dizer que tal organização é característica de tecidos submetidos à força de contato. Consequentemente, pode-se afirmar que essas estruturas desempenham um papel crítico na resposta da articulação à alta frequência de cargas e impactos (HUNZIKER et al., 2007). A organização da MEC depende do tipo dominante de força biomecânica presente de tração ou compressão (FEITOSA et al., 2002).
A cartilagem articular tem sido foco de estudos de engenharia de tecidos, que mostram o aumento das atividades metabólicas e maior resistência mecânica como resposta às forças aplicadas, em comparação aos controles sem carga, apesar de não haver diferenças significativas na composição bioquímica da matriz (NAGEL E KELLY, 2012). Nos tecidos que suportam cargas mecânicas, como cartilagens, tendões e ligamentos, há destacada expressão da “cartilage oligomeric matrix protein (COMP), quando comparados aos tecidos não expostos a cargas (HALEEM-SMITH et al., 2012). O aumento na expressão dessa proteína modifica os componentes da matriz, aumentando o teor de glicosaminoglicanos (GAGs), agrecan e colágeno II, porém sua atuação não seria na expressão gênica mas na organização, montagem e sinalização na matriz (ROCK et
al., 2010, HAUDENSCHILD et al., 2011; HALEEM-SMITH et al., 2012). A COMP é o
principal componente não-colagênico da cartilagem e interage com numerosas proteínas da matriz, incluindo os colágenos dos tipos I, II, IX, XI e XII, presentes em altas concentrações nas matrizes das cartilagens hialinas e fibrosas, como aquelas da sínfise,
além de glicoproteínas e proteoglicanos a exemplo da fibronectina, decorin e matrilin-3 (KATARZYNA et al., 2010). Nesses estudos, evidenciou-se o aumento na velocidade de formação das fibras de colágeno, o que lhe confere o papel de catalisador na fibrilogênese, facilitando interações de moléculas de colágeno entre si e formação de microfibrilas (HALASZ et al., 2007; TAN et al., 2009; KATARZYNA et al., 2010; HAUDENSCHILD, 2011). Durante a embriogênese, ela foi detectada no pericôndrio, periósteo e na zona de cartilagem hipertrófica de ratos, evidenciando seu importante papel no desenvolvimento e na manutenção da cartilagem. Os camundongos deficientes ou mutantes para a COMP apresentam osteoartrite precoce e fenótipo característico de deformidades esqueléticas (KOELLING et al., 2006; GENG et al., 2008).
Sabidamente, a manutenção da homeostasia dos tecidos conjuntivos é dependente em parte das interações matricelulares e, particularmente, no que diz respeito à COMP, ela pode se ligar à galectina 3 (GAL-3) por intermédio de proteínas integrais da membrana. A GAL-3 aparece após a adesão celular a componentes da MEC (NEIDHART
et al., 2005) e exerce importantes papéis na interação entre a célula e a matriz no tecido
conjuntivo (DUMIC et al., 2006). A GAL-3 é um membro altamente conservado da família das lectinas de origem animal, encontrada em vários tipos celulares, como epitélio do trato respiratório e digestório, em fibroblastos, cardiomiócitos, condrócitos, monócitos, macrófagos, no fígado, nos túbulos renais e em uma grande diversidade de tumores (VAN DEN BRÜLE et al. 1997; COLNOT et al., 1999, 2001; INOHARA et al., 1998).
A GAL-3 tem sido apontada como molécula biomarcadora, com participação na manutenção da homeostase celular, conferindo proteção a diferentes tipos celulares, seja permitindo sua multiplicação ou promovendo resistência à morte celular programada e, consequentemente, protegendo condrócitos e fibroblastos de diversos sinais de morte, como o receptor Fas, reagentes quimioterápicos, estaurosporina, fator de necrose tumoral, radiação, oxido nítrico e a perda da ancoragem da célula (INOHARA et al., 1998; COLNOT et al., 1999, 2001; MOON et al., 2001; YOSHII et al., 2002; LIU et al., 2002).
Em trabalhos recentes, discute-se a importância da GAL-3 e COMP na organização estrutural da MEC (HALASZ et al., 2007; TAN et al., 2009; KATARZYNA et
al., 2010; ROCK et al., 2010). A compreensão dos rápidos mecanismos de
estudados, torna-se importante para se entender o envolvimento dessas proteínas e das cargas mecânicas exercidas nos tecidos conjuntivos, que dão suporte aos órgãos pélvicos, e na falta desse suporte, nas disfunções do assoalho pélvico feminino após o parto e durante o processo de envelhecimento, quando a supressão dos hormônios em mulheres após a menopausa e alterações na mecânica pélvica (ZHOU et al., 2012) são apontadas como uma das causas dessas patologias (BECKER et al., 2010) e em doenças degenerativas de cartilagem.
Parte deste trabalho está voltado ao estudo da expressão de COMP e GAL-3 na sínfise púbica de camundongos fêmeas adultas jovens, durante a primeira prenhez e após o parto, particularmente nas entesis e na inserção de tecidos interpúbicos nos ossos.
No desenvolvimento dessa etapa do projeto, utilizamos a microscopia eletrônica de varredura (MEV), tendo em mente a facilidade para medir parâmetros do crimp, da orientação espacial e dos aspectos relativos à preservação de fibras colágenas em preparados totais em que há possibilidades de explorar diferentes profundidades, de acordo com as recomendações de Villegas e Donahue (2010). A partir de imagens digitais, obtidas do MEV, a exemplo das imagens capturadas por outras técnicas como a microscopia fotônica e eletrônica, pode-se quantificar a organização de fibras, utilizando-se a análise pela Transformada Rápida de Fourier [Fast Fourier Transformation (FFT)] de modo semelhante ao que foi empregado em diferentes tecidos e órgãos (DE VRIES et al., 2000; VIDAL E MELLO, 2009; CICCHI et al., 2010). Além desses tecidos e órgão, a análise foi extensivamente validada em tendões e ligamentos (BASHFORD et al., 2008; SEREYSKY et al., 2010; FRISCH et al.,2012).
Os resultados obtidos até o presente momento abrem outras perspectivas para o melhor entendimento de aspectos dinâmicos de fenótipos celulares e de composição e organização da MEC, contribuindo para o monitoramento de falhas na remodelação do tecido conjuntivo e de rupturas da histoarquitetura de componentes osteoarticulares do canal de parto e nos tecidos de suporte dos órgãos pélvicos.
Desse modo, o modelo da SP do camundongo poderá ser útil para estudos que investigam tanto o turnover de complexos macromoleculares da matriz extracelular quanto de possíveis falhas do próprio turnover, particularmente daqueles que constituem fatores que podem afetar propriedades biomecânicas do canal e de suas estruturas de suporte, a exemplo do que foi observado na perda de capacidade de recuperação da SP no
pós-parto de camundongos multíparos senescentes (CONSONNI et al., 2012b). O reconhecimento dessas alterações em modelos animais pode ampliar tanto o reconhecimento de fatores de risco que levam ao comprometimento de estruturas de suporte de órgãos pélvicos quanto o desenvolvimento de novas terapias que visam ao reparo e a regeneração da MEC de tecidos do assoalho pélvico no pós-parto (VENKATARAMAN et al., 2012).
2. OBJETIVOS
• Avaliar as bases do comportamento biomecânico, que podem ser associadas à função da sínfise e do ligamento interpúbico de camundongos C57BL/6, durante a prenhez e após o parto.
• Caracterizar fenótipos celulares e aspectos da matriz extracelular ao microscópio de luz e eletrônico e quantificar as imunoexpressões de COMP e Galectina 3 na sínfise e no ligamento interpúbico de camundongos C57BL/6 durante a prenhez e após o parto.
• Correlacionar propriedades biomecânicas, organização supramolecular, fenótipos celulares e as imunoexpressões de COMP e Galectina-3 na sínfise e no ligamento interpúbico de camundongos C57BL/6 durante a prenhez e após o parto.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Aprovação Prévia dos Ensaios Experimentais
Os experimentos foram conduzidos, de acordo com “The Guide for Care and
Use of Laboratory Animals” (USA National Academy of Science,1996), revistos e
aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal-CEUA/IB Unicamp, em
agosto de 2011 e aprovados através do Protocolo nO 2519-1.
Animais
Foram utilizados 70 camundongos fêmeas nulíparas da linhagem C57BL/6, com idade entre 3 e 5 meses, provenientes do CEMIB/UNICAMP. Os animais foram mantidos em um ambiente de temperatura controlada (25 mais ou menos 2ºC constantes) e expostos à luz, por um período diário de 12 horas (7:00 – 19:00), em condições sanitárias adequadas, com uso de ração própria para a espécie e água potável ad libitum.
Acasalamento de animais
Para obtenção de animais prenhes, um macho e três fêmeas foram colocados em cada gaiola, após as18h, e a presença de tampão vaginal foi verificada entre 7h e 8h do dia consecutivo. Esse dia foi considerado como primeiro dia da prenhez ou 1d.
Foram coletadas amostras de tecidos interpúbicos, SP e Lip, de 12 animais NP; dos
diferentes dias da prenhez: 12 (12d), 15 (15d), 18(18d) 19 (19d) e do pós-parto: 10, 30, 50,
180 e 100 dia após o parto (dpp).
Procedimentos Cirúrgicos
No momento da coleta, fêmeas foram mantidas sob a dose de anestésico 1:1 de Cloridrato de Xylazina 2,0% (Virbaxyl 5-16mg/kg) e Ketamina 10% (Francotar 100-200mg/kg) na dose de 0,15 ml/100g de peso corporal por via intramuscular (de acordo com o protocolo número 315/1 da CEEA/IB, UNICAMP) e sacrificadas entre as 11h e 12h. Após laparotomia, os tecidos interpúbicos SP e Lip bem como as porções mediais dos
ossos púbicos foram removidos e imediatamente dissecados sob microscópio estereoscópico para remoção das inserções de tecidos musculares e, em seguida, processadas de acordo com o método de estudo a ser empregado.
Microscópio de Luz Convencional
Após a coleta, as amostras de tecidos, foram fixadas em paraformaldeído 4% em solução-tampão de fosfato de sódio e potássio 0,1M (pH 7,4), durante 24h, a 4ºC. As amostras para fins de análise morfológica rotineira foram descalcificadas em solução de EDTA 5% com 2% de paraformaldeído em solução-tampão de fosfato 0,05M (pH 7,4) por cinco dias a 4ºC, enquanto que as destinadas à imunohistoquímica não foram descalcificadas. Amostras destinadas às análises morfológicas rotineiras foram desidratadas em bateria de alcóois, diafinizadas em xilol e embebidas em parafina a 60ºC. Cortes de 5µm foram corados com Hematoxilina e Eosina.
Imunohistoquímica
Cortes de 7µm de amostras destinadas à imunohistoquímica foram desparafinizados, levados ao microondas em tampão citrato a 0,01M por 2 ciclos de 1 minuto, com o objetivo de expor os epítopos. Após lavagem em PBS (0,01M pH 7.4) com o intuito de bloquear a peroxidase endógena, incubaram-se os cortes em solução 0,3% de
H2O2 em PBS (0,01M pH 7.4) durante 30 minutos, à temperatura ambiente. O bloqueio de
virtuais reações inespecíficas foi realizado, utilizando-se solução de BSA 1% em PBS (0,01M pH 7.4) durante 1 hora, à temperatura ambiente. Seguiu-se a incubação com anticorpo primário (Para o estudo da COMP, foi utilizado o anticorpo primário policlonal, obtido em Coelho contra a proteína oligomérica da matriz, obtida a partir de cartilagem articular humana, produzido pela Abnova diluído na proporção 1:150 em solução diluente
de anticorpo e anti-GAL-3 [GALECTIN-3 (D-20)] GOAT IgG, 200μg/mL - Marca: SANTA
CRUZ 1:100 em PBS) overnigth em câmara úmida a 40 C. Alguns cortes foram utilizados
como controle negativo da reação e, para isso, em vez de solução de anticorpo, foram incubados, apenas, com a solução na qual o anticorpo primário foi diluído. No dia seguinte, os cortes foram lavados e incubados com o anticorpo secundário (anti-imunoglobulinas de rato – Dako Corporation, CA, USA) conjugado à peroxidase, diluído
na concentração de 1:200, durante 1 hora à temperatura ambiente, em câmara úmida. Posteriormente, os preparados foram, então, incubados em solução contendo o conjugado marcador streptoavidinaperoxidase (LSAB-2; kit Dako) na diluição 1% em TBS 0,05M pH7.4. A reação foi revelada em solução de peroxidase, contendo 0,05% de DAB
(Sigma Company, St. Louis, USA) e 0,03% de H2O2, diluídos em TBS (0,05M pH 7.4).
Após a revelação os cortes foram contracorados em hematoxilina de Harris ou verde de metila, desidratados, diafanizados em xilol e montados em meio sintético. Os materiais foram analisados e documentados no fotomicroscópio Eclipse 800 (Nikon, Japan), usando câmera digital Coolsnap (Media Cybernetics, USA).
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Os tecidos contidos entre as porções mediais dos ossos púbicos, isentos de tecidos musculares, foram previamente fragmentados em amostras menores e fixados em solução contendo glutaraldeído a 2,5% e ácido tânico a 0,5% diluídos em tampão cacodilato 0,1M, durante 3 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, foram lavados em tampão cacodilato 0,1M. Os fragmentos foram pós-fixados em tetróxido de ósmio 1% a 4ºC, durante 1 hora e, em seguida, desidratados em gradiente crescente de álcool etílico. Após a desidratação, os fragmentos foram pré-embebidos em mistura de acetona e resina Epon na proporção de 1:1, 3:1 durante 2 horas e, posteriormente, embebidos em resina pura “overnight”. Em seguida, posicionados em suportes adequados que foram mantidos em estufa, a 60ºC, durante 48 horas. Cortes ultrafinos de 70ηm de espessura foram coletados em grades de cobre e contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo e, em seguida analisados no microscópio eletrônico de transmissão LEO 906-Zeiss do Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia – UNICAMP.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Os tecidos interpúbicos, SP e Lip, e suas porções mediais dos ossos púbicos, isentos de tecidos musculares foram processados de acordo com a técnica descrita por Ohtani et al. (1988), modificada por Goranova et al. (1996) e Joazeiro et al. (2014). Os tecidos foram fixados em solução de glutaraldeído a 2,5%, dissolvido em tampão cacodilato 0,1M, durante 48 horas, à temperatura ambiente. Após esse período, os
tecidos foram macerados em solução de NaOH 2N (Synth, Brasil), durante sete dias, à temperatura ambiente. Posteriormente, foram lavados em água destilada, por igual período e temperatura. A maceração remove efetivamente células e outros componentes amorfos da MEC e expõe claramente fibras dos tecidos conjuntivos. Após lavagem os tecidos foram transferidos, sucessivamente, para solução aquosa de ácido tânico a 1,0% durante 3 horas; lavados em água destilada, durante 20 minutos; pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio a 1%, durante 1 hora a 4ºC e novamente lavados em água destilada. Após lavagem e desidratação em gradiente de etanol, os tecidos foram imersos em nitrogênio líquido, durante 30 minutos e posicionados para serem fraturados ao longo do eixo transversal, isto é, no sentido do afastamento dos ossos púbicos durante a prenhez. Em seguida, foram desidratados em gradiente crescente de álcool etílico. Após fratura, os fragmentos foram transferidos e desidratados novamente em etanol e secos ao ponto crítico (Balzers CPD030, Balzers Lichenstein); aderidos a suportes de alumínio (stubs) e cobertos com filme de ouro no equipamento sputtering coater (Balzers SCD 050).
As análises qualitativas da organização fibrilar da MEC de SP e Lip durante a prenhez e pós-parto foram realizadas em micrografias eletrônicas de aumentos de 800 e 2700, obtidas do MEV Jeol JEM 5800LV (Jeol, Japão), operando em tensão aceleradora de 10kV.
Análise pela Transformada Rápida de Fourier [Fast Fourier Transformation (FFT)]
Resumidamente, a função matemática FFT transforma dados presentes em imagens complexas em uma distribuição de pontos correspondentes à frequência espacial de periodicidades de seus componentes. A distribuição de pontos na frequência espacial FFT (bidimensional) corresponde a uma elipse de 0 ≤ ε (excentricidade) ≤1 cujo centro coincide com a origem do plano cartesiano. A função FFT é recurso disponível na ferramenta computacional/“software” ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/features.html), que permite uma diversidade de análise de dados em segundos. O ImageJ é ferramenta computacional de livre acesso para comunidade científica e não requer instalação de dispositivo ou equipamento específico para análise de dados.
As análises FFT foram realizadas com o auxílio do ImageJ de acordo com as recomendações e parâmetros adotados por Frisch et al. (2012) que empregaram
eletromicrografias obtidas do MEV de índices para quantificação de organização fibrilar nas análises de tendões, sob diferentes estresses ou deformações mecânicas.
Para a realização das análises foram tomados cerca de 5 campos não
sobrepostos, medindo 2.500 µm2 cada, em um mínimo cinco micrografias eletrônicas
(imagens digitalizadas em tons de cinza de área de cerca de 13.200 µm2 cada),
representativas dos conjuntos de tecidos interpúbicos de animais NP e nas fases de
separação dos ossos púbicos (12d, 15d, 18d); relaxamento do Lip (19d) e retorno dos
ossos no pós-parto (1dpp; 3dpp e 5dpp). Para obtenção das imagens FFT e dos respectivos índices quantitativos de organização fibrilar da região central de SP e Lip, foram adotadas as seguintes estratégias descritas por Frisch et al. (2012): a) percentil limiar (threshold) entre 9 e 10% para melhor caracterizar o conteúdo de frequência de alta intensidade no sentido dos eixos maiores (d1) e menores (d2) de figuras elípticas geradas pelas FFT; b) Inscrição de contorno ao redor das maiores densidades de pontos das frequências espaciais, de modo a ressaltar as excentricidades de elipses e facilitar obtenções de razões (índices) entre seus diâmetros d1 e d2.
Morfometria do crimp das fibras de colágeno
O comprimento e a angulação do crimp de fibras de colágeno da região central de tecidos interpúbicos foram medidos diretamente em micrografias eletrônicas obtidas ao
MEV. Os valores foram calculados a partir da projeção do comprimento do crimp (l) e a
do ângulo(θ) com recursos disponíveis na ferramenta computacional/“software” ImageJ
(http://rsbweb.nih.gov/ij/features.html). As relações entre parâmetros medidos são facilmente percebidas na Fig. 1 de acordo com Pinheiro et al. (2004) e Joazeiro et
al.(2014), além disso a estratégia empregada se mostrou eficiente para revelar aspectos
qualitativos de tecidos conjuntivos fibrosos (VILLEGAS e DONAHUE, 2010). Cerca de 10 medidas de cada parâmetro foram tomados em um mínimo cinco micrografias eletrônicas
(imagens digitalizadas em tons de cinza de área de cerca de 13.200 µm2 cada),
representativas dos conjuntos de tecidos interpúbicos nas fases de separação dos ossos púbicos (12d, 15d, 18d) e retorno dos ossos no pós-parto (1dpp; 3dpp e 5dpp).
Análise Biomecânica de SP e Lip ex vivo
Após coleta, SP e Lip com extremidades ósseas preservadas foram imersos em
Análise Biomecânica de SP e Lipex vivo
Após a coleta, SP e Lip com extremidades ósseas preservadas foram imersos em solução salina fisiológica (NaCl 0 9%), para impedir o ressecamento das amostras até a realização dos testes biomecânicos. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente (25°C, 60% de umidade relativa), e as amostras foram fixadas aos suportes metálicos, adaptados, especialmente, para permanecerem alinhados ao eixo da máquina durante teste e conter as amostras por meio de suas extremidades ósseas, em condições similares as fisiológicas, no que diz respeito ao afastamento dos ossos púbicos. Esse modo de contenção de amostra reduz possíveis torções e deslizamentos, como originalmente recomendado por Storey et al. (1957) bem como artefatos gerados pela fixação dos tecidos ao suporte da máquinas de teste, a exemplo daqueles que podem ocorrer nos locais de fixação de tecidos em suportes destinados aos ensaios biomecânicos e que podem modificar características biomecânicas de tecidos ou órgãos do canal de parto de roedores (ABRAMOWITCH et al., 2013).
Os testes mecânicos foram realizados com emprego da máquina universal de
testes “Stable Micro Systems Texture Analyze Texture Expert for the WindowsTM
Operating System” (Figura 2), do Laboratório Central Instrumental do Departamento de
Alimentos e Nutrição da Faculdade de Engenharia de Alimentos/ Unicamp. A distância
Fonte: Joazeiro et al, (2014)
Figura 1 vista da rede fibrilar de colágeno de Lip no 15d. Note as fibras de colágeno apresentando feixes de fibrilas de colágeno paralelas empacotadas e orientadas na mesma direção apresentando um curso ondulante (crimp). Os valores da morfometria são calculados a partir da média projetada do comprimento do crimp e a média do ângulo como o modelo proposto por Villegas e Donahue (2010) tensão de aceleração = 10 kV. Distância de trabalho = 37 mm. Barra = 10µm.
inicial entre ossos púbicos foi previamente definida pela aplicação de pré-carga de 0,1N e deslocamento de 1mm/s para corrigir possíveis folgas nas contenções de amostras nos suportes e destes na máquina. Esse ajuste foi necessário para a detecção de alterações mínimas nas forças pelo sistema operacional da máquina, e, a partir do afastamento atingido, os suportes eram movidos levemente, para aliviar a tensão da pré-carga. Esse ponto foi tomado como o zero para efeito da análise mecânica realizada com emprego de célula de carga de 1kN, a velocidade constante de 1mm/s até a ruptura da amostra. Ajustes dessa natureza se justificam com base nas observações de Agianniotis et al. (2011) que verificaram a carga necessária para alinhar fibras colágenas em um feixe, quando comparada com a carga transmitida pelas fibras estiradas. Desse modo, fibras de colágeno transmitem eficientemente força somente quando se estende além do ponto onde ondulações desaparecem.
As propriedades estruturais, carga máxima em Newton e o deslocamento à carga máxima em mm foram registrados simultaneamente em gráficos. Tabelas com os valores máximos foram registrados pelo software do equipamento. A amostra foi constituída de três (n=3) animais em cada grupo experimental: NP, 12d, 15d, 19d, 3dpp, 5dpp e 10dpp. Para calcular a energia total de ruptura (ETR), foi demarcada, em cada gráfico, a região entre o ponto zero do ensaio e a primeira queda brusca na força, momento em que o corpo de prova inicia a ruptura.
Para calcular a constante elástica, utilizamos o método dos mínimos quadrados, que ajusta curvas de funções conhecidas e, sabendo qual função matemática deve ser usada, aquela equação que melhor descreva o fenômeno. O método recebe esse nome, pois usa o quadrado da diferença entre o dado experimental e da aproximação, de modo que o resultado é o menor valor possível, dando máxima precisão à função calculada.
Nos nossos ensaios, os corpos de prova comportam-se claramente, como uma função afim (ou linear) até o ponto onde começam a ocorrer rupturas na estrutura das amostras. Usamos a função linear para descrever matematicamente o comportamento das amostras, onde y = a.x + b. Após obter um sistema linear de equações, usamos determinantes e chegamos a fórmula:
a =
∑
∑
∑
∑ ∑
∑
⋅ ⋅ − ⋅ ⋅ − xi xi n xi xi yi xi n yi xi ) ( ) ( ) (b =
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
⋅ ⋅ − ⋅ − ⋅ xi xi n xi xi yi xi xi xi yi xi ) ( ) ( ) (Para plotar os gráficos, foi usado o software Excel 2007, da Microsoft.
Figura 2: A) Suportes utilizados para fixação de amostras; B) Stable Micro Systems Texture
Analyze Texture Expert for the WindowsTM Operating System e C) Detalhe dos suportes contendo amostra durante o ensaio.
Análises Estatísticas
Os dados obtidos foram apresentados como média ± erro-padrão. Os índices obtidos por meio da FFT foram comparados entre si utilizando o teste-t de Student do SPSS for windows. A significância estatística foi definida como P<0,05.
A
4. RESULTADOS
4.1 Aspectos da histoarquitetura dos tecidos interpúbicos de camundongos não prenhes, prenhes e no pós-parto
Durante a prenhez, o remodelamento dinâmico do sistema musculoesquelético do camundongo produz modificações da histoarquitetura da SP e Lip em fases que se sobrepõem e são conhecidas como separação, relaxamento e recuperação da forma desses componentes que dão suporte ao canal de parto (Figura 3). A comparação da composição tecidual da SP de animais NP (Figura 3A) com aquela do 12d permite identificar aspectos relacionados ao início da separação dos ossos púbicos durante a prenhez. Essa etapa é marcada pelo remodelamento gradual das porções cartilaginosas e ósseas da sínfise, enquanto a compacta lâmina de fibrocartilagem interposta aos coxins de cartilagem hialina passa por uma série de modificações moleculares que proporcionam o aparecimento de um Lip elástico, observado no 15d. O Lip fixa-se aos ossos por uma entesis osteoligamentosa sendo envolto por tecido conjuntivo denso, que se continua ventral e dorsalmente com o periósteo e pericôndrio da articulação.
Após o 15d (Figura 3C), o Lip sofre grandes modificações com rápido e pronunciado amolecimento nos últimos 2 dias de gestação. O remodelamento acelerado leva ao “relaxamento” do ligamento verificado nos 18d e 19d (Figura 3D), sendo este último o dia do parto. O relaxamento da histoarquitetura do Lip nesse período favorece a observação de características de ligamento, tais como: presença de células alongadas com núcleos de cromatina frouxa, de fenótipo semelhante a fibroblasto, cujos maiores eixos mostram-se alinhados paralelamente ao maior eixo do espaço interpúbico ou direção do afastamento dos ossos. No que diz respeito às características da matriz extracelular do Lip, fica evidente a mudança do arranjo das fibras colágenas com aumento do espaço entre as mesmas, que resulta no aspecto “esgarçado” do tecido conjuntivo, o qual, por sua vez é associado ao acúmulo de substância fundamental da matriz depositada nos espaços interfibrilares e intercelulares, caracterizando o aspecto relaxado do ligamento nessa etapa da prenhez.
No 1dpp, as células alongadas, semelhantes a fibroblastos, ainda apresentam seus maiores eixos orientados paralelamente ao maior eixo do ligamento. No entanto, na matriz extracelular, as fibras readquirem o arranjo compacto semelhante àquele observado durante a “separação”. O remodelamento do ligamento e a reaproximação dos ossos púbicos se
aceleram no 3dpp (Figura 3E), e os tecidos interpúbicos recuperam, gradativamente, o aspecto de tecido conjuntivo denso da histoarquitetura semelhante à da fase de separação dos ossos púbicos. Nessa etapa, as adaptações, que ocorrem tanto no tecido conjuntivo denso do Lip quanto nas entesis e coxins de cartilagem hialina, contribuem para uma significativa redução do espaço e recuperação de histoarquitetura que se assemelha à da SP, a exemplo do que se observa no 10dpp.
Figura 3: Fotomicrografias da SP (A; B e G) e do Lip (C-F) de camundongos não prenhes (A) e prenhes (B-D). Em A; B e G (NP, 12d e 10dpp), observa-se a histoarquitetura característica de sínfise
fibrocartilaginosa (FC) composta por tecido conjuntivo denso e células de fenótipo condrogênico. Na sínfise, a fibrocartilagem se localiza entre coxins de cartilagem hialina (CH), recobrindo a superfície dos ossos púbicos. Em C e D (15d e 19d), a fibrocartilagem é substituída pelo ligamento, e os fibroblastos se posicionam paralelamente em relação ao maior eixo da articulação (seta), juntamente com as fibras de colágeno (cabeça de seta). No detalhe em D, note a orientação dos fibroblastos com as fibras de colágeno. Em (E) a entesis ao 3dpp e a região próxima ao osso com grande densidade celular, em (F) 5dpp e em (G)10dpp observe a presença de fibrocartilagem ocupando o centro do espaço interpúbico. Note em C e D a região de transição (RT). Hematoxilina-Eosina Barras: A, B, C, E, F e G: 50µm. D: 30µm e detalhe: 30µm.
4. 2 Detecção das Proteínas COMP e GAL-3 nos tecidos interpúbicos de fêmeas não prenhes, prenhes e no pós-parto
A detecção imunohistoquímica das proteínas COMP (Figura 4) e GAL-3 (Figura 5) permitiu o reconhecimento de expressões espaciais e temporalmente reguladas dessas
proteínas nos tecidos interpúbicosde camundongos NP; prenhes (15d e 19d) e no pós-parto
(5dpp e 10dpp).
A imunoexpressão da COMP foi detectada em poucas células da zona de transição
entre a fibrocartilagem e coxins de cartilagem hialina da SPde camundongos NP (Figura
4A). Durante a separação dos ossos púbicos na prenhez, particularmente no 15d (Figura 4B), a imunomarcação COMP foi localizada no citoplasma da maioria das células da região de transição fibrocartilaginosa enquanto na região central no ligamento interpúbico em formação apresentou reação difusa na matriz.
Durante o relaxamento, particularmente no 19d (Figura 4C) a ocorrência de células que apresentam marcação para COMP mostra-se reduzida na delgada transição fibrocartilaginosa enquanto, no ligamento relaxado, a marcação da matriz mostra-se igualmente difusa. Na etapa em que ocorre a reaproximação dos ossos púbicos, majoritariamente no 5dpp (Figura 4D), os condrócitos da cartilagem em remodelação se destacam com maior intensidade de marcação, enquanto, no 10dpp (Figura 4E), a expressão da COMP é qualitativamente menor na transição e na porção cartilaginosa, e tem aspecto difuso no tecido conjuntivo denso em remodelamento.
A detecção imunohistoquímica da GAL-3 em camundongos NP mostrou-se positiva em alguns condrócitos e fibrocondrócitos da SP de camundongo. Durante a separação
dos ossos púbicos, a avaliação qualitativa mostrou aumento relativo de células imunomarcadas na transição fibrocartilaginosa e no ligamento interpúbico em formação no 15d. Durante o relaxamento, a ocorrência de células que apresentam marcação para GAL-3 foi detectada tanto no osso subcondral quanto na região de transição correspondente à entesis do Lip relaxado do 19d. Na etapa em que ocorre a reaproximação dos ossos púbicos, a imunoexpressão da GAL-3 mostrou-se presente tanto nas células da transição fibrocartilaginosa do espaço interpúbico no 3dpp quanto nos condrócitos hipertróficos dos coxins de cartilagem hialina que recobrem os ossos púbicos no 10dpp.
Figura 4: Fotomicrografias ilustrativas de reações imunohistoquímicas para detecção de COMP em secções representativas de amostras de tecidos interpúbicos de animais NP (A) e Lip; prenhes 15d (B e F); 19d (C) e no pós-parto; 5dpp (D); 10dpp (E). Em F, controle negativo da reação em tecidos
interpúbicos do 15d. Nessa figura, observam-se células imunomarcadas em menor número na SP (A). Qualitativamente é notada maior marcação nas células da transição fibrocartilaginosa na etapa da separação dos ossos no 15d (B). Durante o relaxamento, no 19d (C), a marcação é qualitativamente menor no compartimento celular da transição fibrocartilaginosa e difusamente distribuída na MEC do ligamento relaxado. No pós-parto, a marcação se mostrou qualitativamente mais intensa no 5dpp (D). No 10dpp (E), observa-se a marcação positiva em células da cartigem hilania (E) e de forma difusa MEC do Lip em involução. Revelação diaminobenzidina e contracoloração por Hematoxilina de Harris. Barras= A, C e F: 30µm; B, D e E: 50µm.
Figura 5: Fotomicrografias ilustrativas de reações imunohistoquímicas para detecção de GAL-3 em secções representativas de amostras de tecidos interpúbicos de animais NP (A) e Lip; prenhes 15d (B e F); 19d (C) e no pós-parto; 3dpp (D); 10dpp (E). Em F, controle negativo da reação em tecidos
interpúbicos do 15d. Observam-se células que expressam a GAL-3 em menor número na SP de animais NP (A). Qualitativamente maior marcação nas células da transição fibrocartilaginosa ocorre na etapa da separação dos ossos no 15d (B). Durante o relaxamento 19d (C), a marcação é evidente em células da entesis fibrocartilaginosa. No pós-parto, a marcação se mostrou presente em células dos coxins de cartilagem no 3dpp. No 10dpp se observam marcação positiva em condrócitos hipertróficos de coxim de cartilagem hialina. Revelação diaminobenzidina e contra coloração por Hematoxilina de Harris (A, B, D, E e F) Verde de Metila (C) Barras: A, C, D e F =30µm; B e E = 50µm.
4.3 Aspectos ultraestruturais da interação entre células e MEC nos tecidos interpúbicos de camundongos não prenhes, prenhez e no pós-parto
A observação dos tecidos interpúbicos de animais NP ao microscópio eletrônico de transmissão, particularmente da região central da sínfise, permitiu a identificação de células elípticas, envolvidas por discreta matriz territorial que se continua em uma trama isotrópica na qual predominam fibrilas finas de colágeno (Figura 6A). Esses fibrocondrócitos diferem de condrócitos esféricos, presentes em pequenos grupos isogênicos nos coxins cartilaginosos e de fibroblastos alongados, presentes no tecido conjuntivo denso, que envolve o centro fibrocartilaginoso.
O processo dinâmico que leva à adaptabilidade da fibrocartilagem da SP para se diferenciar no Lip durante a separação dos ossos púbicos resultou em alterações ultraestruturais, que podem ser detectadas no fenótipo de células e arranjo da MEC. No 12d, as células da região central do espaço interpúbico adquiriram fenótipo de fibroblastos com núcleos de cromatina descondensada e contornos regulares. Essas células mantêm íntimo contato com fibras colágenas densamente empacotadas (Figura 6B). Essas características ultraestruturais básicas se mantêm no 15d, no entanto os fibroblastos exibem perfil mais alongado e fenótipo de células ativamente envolvidas na síntese de componentes de MEC, que, por sua vez, mostrou fibras colágenas densamente empacotadas, no entanto mais espaçadas por regiões de baixa densidade eletrônica (Figura 6C).
Após o 15d, além de fibroblastos exibirem perfil de células ativamente envolvidas com síntese, a MEC mostrou drásticas modificações nos seus componentes, particularmente no que diz respeito ao aumento de espaços intercelulares e entre fibras colágenas, que
contribuem para o relaxamento do Lip. No 19d, essas fibras mostram diâmetros reduzidos e perda de seus contornos (Figura 6D), período de máximo relaxamento do Lip.
Os aspectos da recuperação da forma de tecidos do espaço interpúbico nos dias que se seguem ao parto também encontram paralelo nas características ultraestruturais das células e da MEC. Inicialmente, apesar de persistirem grandes espaços intercelulares e entre fibras colágenas, estas apresentaram contornos definidos e, são constituídas de fibrilas colágenas altamente empacotadas, como observado no 3dpp (Figura 6E).
No que diz respeito ao 5dpp, os espaços entre fibras colágenas progressivamente diminuem e, no 10dpp (Figura 6), retomam o aspecto dos pequenos espaços existentes no início da separação dos ossos púbicos. Quanto ao fenótipo das células, elas mantêm as características semelhantes a fibroblastos, no entanto os núcleos mostram contornos irregulares ou dentados, tendo, em algumas oportunidades, sido possível verificar a presença de estruturas semelhantes a cílios com organização de microtúbulos (9+0) envoltos pela membrana plasmática bem como corpúsculos basais de cílios próximos a núcleos (Figura 7). O aspecto irregular de núcleos bem como a presença de organelas citoplasmáticas constituídas por microtúbulos associados à evidente redução de espaços intercelulares e entre fibras da MEC podem ser tomados como características ultraestruturais que têm potencial para contribuir para recuperação da forma dos tecidos interpúbicos no pós-parto.
Figura 6: Eletromicrografias ilustrativas das modificações ultraestruturais da região central dos tecidos interpúbicos de camundongos não prenhes (NP) e em diferentes dias de prenhez (12d-10dpp). Em A (NP), observa-se fibrocondrócito elíptico de núcleo fusiforme e cromatina descondensada, envolta por delgada auréola de matriz territorial e fibrilas colágenas finas. Em B (12d), nota-se fibroblasto envolto por MEC contendo fibras colágenas compactas. Em C (15d), os fibroblastos de formatos alongados localizados entre fibras de colágeno, com orientações paralelas
ao maior eixo das células (seta), porém com discreto espaço entre elas (cabeças de setas). Em D (19d) observa-se grandes espaços na MEC, constituídos por substância amorfa que envolve fibroblastos alongados e fibras colágenas finas, de contornos irregulares e dispersas. Em E (3dpp) destaca-se o grau de compactação e o contorno definido das fibras colágenas (seta) e o espaçamento pouco eletrondenso entre células e fibras. Em F (5dpp) e G (10dpp) nota-se o contorno irregular de núcleos de células, a compactação das fibras de colágeno (setas) e os diminutos espaços (cabeças de setas) existentes na MEC, tanto entre células semelhantes a fibroblastos quanto entre fibras colágenas. Barras: A e C: 5µm; B: 2µm; D: 10µm; E: 2µm; F: 5µm e G: 2µm.
Figura 7: Eletromicrografias ilustrativas de células do tecido interpúbico no 3dpp em que se pode observar a presença de organelas compostas por microtúbulos com arranjo semelhante a cílio cortado transversalmente (A) e corpo basal de cílio cortado longitudinalmente (B). Barras: A: 2µm;
B: 500nm.
4.4 Padrões ultraestruturais e avaliação quantitativa da organização de fibras colágenas
As observações de tecidos interpúbicos, macerados ao MEV, permitiram tanto o reconhecimento de aspectos qualitativos de fases que se sobrepõem durante remodelamento da MEC quanto a partir destes a obtenção de parâmetros que dizem respeito à organização supramolecular do colágeno de regiões centrais de tecidos interpúbicos durante as modificações espaço-temporalmente reguladas. Estas modificações contribuem para o afastamento dos ossos púbicos, iniciado no 12d da
prenhez, o relaxamento do ligamento interpúbico para acomodação do canal de parto e o retorno dos ossos no pós-parto.
Nas SP de animais NP, a região central do disco fibrocartilaginoso exibiu arranjo frouxo de fibras colágenas finas e íntegras que não apresentavam sequências múltiplas helicoidais ou crimps e mostravam-se orientadas aleatoriamente, em todas as direções do espaço (Figura 8A.1). Essa conformação de fibras colágenas correspondeu à imagem bidimensional FFT de pontos distribuídos em uma figura geométrica de menor excentricidade (Figura 8A.2) e índice FFT equivalente a uma distribuição isotrópica das fibras colágenas finas observadas ao MEV.
A exploração das características morfológicas da região central dos tecidos interpúbicos durante as modificações espaço-temporalmente reguladas, associadas ao afastamento dos ossos púbicos, permitiu distinguir, no 12d, fibras helicoidais; que apresentam crimp e se mostram paralelamente alinhadas a outras aleatoriamente dispersas e que ocupam espaços entre aquelas paralelamente orientadas (Figura 8B.1). Os parâmetros referentes às características helicoidais, particularmente o crimp, de fibras da região central dos tecidos interpúbicos, verificadas entre o 12d e 18d, são estatisticamente significativos durante o progressivo aumento do comprimento de crimps e às respectivas reduções de seus ângulos (Tabelas 1, 2 e Figura 9).
No que diz respeito à dispersão na organização das fibras, na análise FFT bidimensional permitiu a obtenção de elipses de excentricidades maiores e que resultaram em índices FFT estatisticamente significativos, se comparadas aos de menores excentricidades mediadas na SP de animais NP (Figura 8). No entanto não há diferenças estaticamente significativas que dizem respeito aos índices FFT entre 12d e 18d (Tabela 3), o que é indicativo da progressão gradual na orientação de fibras em relação à direção do afastamento dos ossos púbicos.
As características ultraestruturais da região central do Lip relaxado no 19d mostraram arranjo no qual se destaca não só a ausência de crimp nas fibras colágenas finas e de aspecto fragmentado bem como o contraste entre o paralelismo dessas fibras colágenas e a dispersão aleatória de fibras que ocupam os espaços entre aquelas paralelamente orientadas (Figura 8C.1). No que diz respeito à dispersão na organização das fibras, a análise FFT bidimensional permitiu a obtenção de elipses de excentricidades maiores e que resultaram em índices FFT estatisticamente significativos, se comparadas aos valores obtidos nas elipses de menores excentricidades, mediadas nos tecidos
interpúbicos tanto no que diz respeito às fases de afastamento quanto no de retorno dos ossos púbicos nos períodos 12-18d e 1-5dpp, respectivamente (Figura 10, Tabela 4). Essas diferenças estatisticamente significantes traduzem, adequadamente, as avaliações qualitativas das drásticas alterações morfofisiológicas, que correspondem ao relaxamento dos tecidos interpúbicos para a acomodação do canal de parto.
Em relação aos aspectos morfológicos observados na região central de tecidos interpúbicos no pós-parto, é marcante o remodelamento da MEC. Desde o primeiro dia pós-parto ficou evidente o rápido rearranjo helicoidal das fibras ou crimp e da arquitetura das fibras colágenas (Figura 8D.1), o qual pode ser associado à reaproximação dos ossos púbicos. Os parâmetros referentes às características helicoidais, particularmente o crimp, de fibras da região central dos tecidos interpúbicos, verificadas entre o 1dpp e 5dpp, são estatisticamente significativos no que diz respeito à progressiva diminuição do comprimento de crimps e respectivo incremento de seus ângulos (Tabelas 1, 2 e Figura 9) e que vão no sentido contrário do que se observou durante o afastamento dos ossos púbicos. As variações espaço-temporalmente reguladas destes parâmetros morfométricos proporcionam quantificação de modificações dos tecidos interpúbicos com emprego de analise de imagem, ferramenta eficiente para quantificação in loco de aspectos cumulativos decorrentes da prenhez.
No que diz respeito à dispersão na organização das fibras, a análise FFT bidimensional permitiu a obtenção de elipses de excentricidades maiores e que resultaram em índices FFT estatisticamente significativos, se comparadas aos de maiores excentricidades medidas no Lip durante o relaxamento (Figura 10). No entanto não há diferenças estatisticamente significativas nos índices FFT obtidos nos períodos 3-5dpp e 12-18d (Tabela 4). A comparação desses índices oferece elementos indicativos quanto a necessidade de manutenção de histoarquitetura, responsável pelas respostas às demandas biomecânicas do pós-parto.
Figura 8: Eletromicrografias obtidas ao MEV e respectivas frequências espaciais ou imagens bidimensionais geradas pela FFT cujas maiores densidades de pontos foram contornadas em vermelho. As imagens pareadas são ilustrativas da dispersão na orientação de fibras que apresentam disposição helicoidal ou crimp na MEC, presentes tanto nas regiões centrais de fibrocartilagem da SP de camundongos NP (A) quanto de tecidos interpúbicos durante as modificações espaço-temporalmente reguladas, que contribuem para afastamento dos ossos púbicos, iniciado no 12d da prenhez (B), relaxamento do espaço interpúbico, no 19d da prenhez (C) e retorno dos ossos no pós-parto, caracterizado no 5dpp (D). Os maiores espaços entre fibras colágenas correspondem aos nichos ocupados por células. Barras: A, B e C: 10µm; D 200µm.
Tabela 1. Médias e desvios-padrões de medidas de comprimento (µm) e ângulo do crimp (graus) presente em fibras colágenas de regiões centrais de tecidos interpúbicos (SP e Lip) de camundongos em diferentes dias da prenhez, parto e pós-parto.
Dias de prenhez
Comprimento do
crimp (µm) Ângulo α do crimp (graus)
NP no no 12d 8,3 ± 2,1 43,8 ± 8,3 15d 11,5 ± 2,5 44,7 ± 5,0 18d 15,5 ± 4,9 37,4 ± 7,6 19d no no 1dpp 19,0 ± 5,0 25,6 ± 6,0 3dpp 20,0 ± 4,3 25,2 ± 5,2 5dpp 9,7 ± 2,8 33,4 ± 8,0
Figura 9.A Comprimento
Figura 9.B Ângulo
Figura 9: Distribuições de valores medianos de comprimento (µm) (Fig 9.A) e ângulo (graus) (Fig. 9.B) presente em crimps de fibras colágenas de regiões centrais dos tecidos interpúbicos em diferentes dias da prenhez e pós-parto. As barras de erro representam os valores máximos e mínimos das distribuições em 3 animais.
Crimps não foram observados na SP de animais NP e Lip, no 19d. As significâncias estatísticas desses índices
são mostradas nas Tabelas 2 e 3.
Nota: NP=não prenhe; d= dia de prenhez; dpp= dia pós parto; no= não observado
Tabelas 2 e 3. Significâncias estatísticas dos valores de Comprimento (µm) (Tabela 2) e de Ângulo α (graus) do Crimp (Tabela 3), medidos em fibras colágenas presentes em eletromicrografias obtidas ao MEV (***p < 0.001; **p < 0.01).
Tabela 2 Comprimento
Tabela 3 Ângulo
Figura 10: Valores medianos dos ÍndicesFFT do Lip. Os valores aumentam discretamente, durante a fase de afastamento dos ossos púbicos (12d-18d), se comparados ao da SP de animais NP. Depois, aumentaram acentuadamente, durante o relaxamento do Lip (19d); de modo semelhante, reduziram até o 3dpp. No 5dpp,os índices se mantiveram semelhantes aos da fase de afastamento dos ossos. As barras de erro representam os valores máximos e mínimos das distribuições em 3 animais. A significância estatística desses índices é mostrada na Tabela 4.
4.5 Modificações de parâmetros biomecânicos de tecidos interpúbicos durante a prenhez, parto e pós-parto
Os valores medidos nos testes biomecânicos de tecidos interpúbicos, SP e Lip ex vivo, durante a prenhez, parto e pós-parto que estão representados na Figura 11 e Tabela 5 refletem as modificações fisiológicas dos tecidos interpúbicos durante as fases que se sobrepõem: separação dos ossos púbicos, relaxamento do Lip e reaproximação dos ossos no pós-parto. Os tecidos interpúbicos da SP de animais NP respondem à aplicação de força máxima, com distensão mínima, seguida de ruptura; resposta típica de tecidos conjuntivos densos, pouco distensíveis. A força capaz de romper os tecidos interpúbicos decresceu durante a separação dos ossos púbicos entre d12 e d18. A menor força capaz de produzir a maior distensão e rompimento do Lip foi medida durante a distensão no 19d, que corresponde a fase de relaxamento e o dia do parto. Durante a reaproximação dos ossos púbicos, no período 1-3dpp, houve aumento significativo dos valores referentes à força e constante elástica, enquanto a energia total de ruptura foi significativa entre o 5-10dpp. No 10dpp, a força e a enegia medidas foram semelhantes às dos animais controle (NP). A distensão nesse período 1-3dpp diminuiu significativamente e no 10dpp os valores foram menores que o NP.
Tabela 4. Significância estatística dos índices obtidos com o emprego das análises FFT em eletromicrografias obtidas ao MEV (***p < 0,001; **p < 0,01).
Figura 11: Curvas representativas das relações entre a Força (N) e Distensão (mm) de tecidos interpúbicos de animais não prenhes (NP) no início da separação dos ossos púbicos (12d), no final do relaxamento do ligamento (19d) e reaproximação dos ossos (10dpp). Embora haja paralelismo inicial das inclinações dos segmentos lineares das curvas referente à SP de animais NP e do 12d, a força de ruptura de 12d é estatisticamente significante menor que aquela medida na SP de animais NP. O valor da força capaz de romper o Lip durante a fase de relaxamento foi aquele estatisticamente menor dentre os valores verificados durante a prenhez e no pós-parto.
Tabela 5. Comparação de Médias e desvios-padrões de parâmetros medidos em ensaios biomecânicos: Força (N); Distensão (mm); Energia (N/mm) e Constante Elástica, verificados no momento da ruptura de tecidos interpúbicos (SP e Lip) de camundongos não prenhes (NP) durante a separação dos ossos púbicos (12-18d), relaxamento do Lip (19d) e reaproximação dos ossos no pós-parto (3-10dpp).
Variáveis Força Distensão Energia
Média ± dp
Constante Elástica Média ± dp Dias Média ± dp Média ± dp
NP 3.82±0.45 0.32±0.08 0.45±0.30 8.26±2.35 12d 1.95±0.56 0.23±0.13 0.41±0.18 3.64±0.13 P 0.01* 0.38 ns 0.883 ns 0.08 ns 12d 1.95±0.56 0.23±0.13 0.41±0.18 3.64±0.13 15d 1.38±0.70 0.33±0.33 0.51±0.34 2.10±0.42 P 0.33ns 0.65 ns 0.68 ns 0.03* 15d 1.38±0.70 0.33±0.33 0.51±0.34 2.10±0.42 19d 1.28±0.76 1.73±0.64 1.12±1.07 1.00±0.14 P 0.87ns 0.03* 0.45 ns 0.05* 19d 1.28±0.76 1.73±0.64 1.12±1.07 1.00±0.14 3dpp 3.99±1.05 0.37±0.23 1.22±0.44 8.51±2.60 P 0.02* 0.04* 0.88 ns 0.04* 3dpp 3.99±1.05 0.37±0.23 1.22±0.44 8.51±2.60 5dpp 4.39±1.97 0.25±0.15 1.36±0.23 6.82±2.78 P 0.77 ns 0.58 ns 0.21 ns 0.48 ns 5dpp 4.39±1.97 0.25±0.15 1.36±0.23 6.82±2.78 10dpp 3.77±2.62 0.11±0.06 0.40±0.044 10.40±8.13 P 0.76 ns 0.24 ns 0.05* 0.55 ns
NOTA: N = Newton; (*) Diferença estatística significante (p < 0,05); (ns) Diferença estatística não
