Ativação da via NFkB e Diabetes Mellitus

O fator nuclear kB pode ser ativado por diferentes modos, como apoptose, ci- tocinas, como TNF-α e espécies reativas de oxigênio (152). Dentre todas as formas de ativação do NFkB as mais estudadas são as ativações pelo estresse oxidativo e/ou pelo TNF-α (153).

O TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) é uma citocina proinflamatória que pertecence a superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) (154). A atividade de NFkB induzida por TNF-alfa envolve cinco proteínas NF-kappaB/Rel de mamífero que foram clonados e caracterizadas até agora: c-Rel, NF –kappaB1 (p50/p105), NF- kappaB2 (p52/p100), RealA/p65 e RelB. A ativação do NFkB induzida pelo TNF alfa depende em grande parte da ubiquitinação dependente da fosforilação e degrada- ção do inibidor das proteínas kappa B (IkB) (155).

Essa sinalização pelo TNF-α está envolvida na regulação de diversos proces- sos biológicos, incluindo proliferação celular, diferenciação, apoptose, metabolismo lipídico e coagulação (156).

Entretanto, além dessa via, o NFkB pode ser ativo pelo estresse oxidativo e a decorrente produção de radicais livres. Nossos resultados sugerem que a ativação do NFkB p65/p50, possa estar relacionada com a interação dos radicais livres pro- duzidos pelos linfócitos T durante as culturas celulares.

A ativação do NFKB por essa via pode ser desencadeada pelo processo de oxidação dos radicais livres, ativando também o TLR (toll like receptor) e a proteína ativadora-1 (AP-1), que por sua vez tem sua ativação regulada pelas proteínas qui-

nases (PKC). Essas proteínas têm papel importante na transcrição que modulam a expressão de moléculas pró-inflamatórias, resposáveis por diferenciação linfoide, oncogenese e apotose (157).

Especificamente no diabetes mellitus tipo 1A, a hiperglicemia prolongada ge- rada pela doença, também leva ao aumento dos radicais livres, ativando a via po- lióis. Essa via ativa as proteínas quinases (PKC), formando derivados glicosilados e estimulando o fluxo da glicose pela via alsode-redutase, resultando em acúmulo de sorbitol e diminuição da glutationa (158).

Além disso, essa via aumenta o NADPH- oxidase, considerada em muitas células a maior fonte de produção dos ROS, o que pode desencadear estresse oxi- dativo. As formações das NADPH-oxidase são ativadas e fosforiladas por várias qui- nases, incluindo a PKC (159).

A PKC é uma das principais quinases que está envolvida em eventos de transdução de sinais e fatores de crescimento. Atua catalisando a transferência de um grupo fosfato do ATP (adenosina- tri-fosfato) a várias proteínas. Da mesma for- ma, a PKC também sofre fosforilação que ocorre durante sua translocação no citosol a membrana plasmática, fazendo com que ocorra o aumento do estresse oxidativo no organismo (160).

Bagul e col.2015, demonstraram em seu trabalho que ratos (Sprague-Dawley) diabéticos apresentaram aumento da ativação do NADPH-oxidase e estresse oxida- tivo, que levou a produção excessiva de ROS e como consequência ativou o NFkB- p65 (161).

Outro fator importante é a oxidação da glicose, durante o diabetes, acredita- se ser uma das principais vias de produção dos radicais livres durante a doença. A oxidação da glicose produz produtos finais de glicação avançada (AGEs), que são proteínas ou lipídeos que se tornam glicados após a exposição a açúcares oxidados e contribuem para o desenvolvimento do DM1A. Algumas proteínas como a albumi- na,ativam os receptores de AGEs os RAGEs, estimulando a produção de citocinas inflamatórias, fator de crescimento tumoral alfa, prostaglandinas e fator estimulador de colônias de granulócitos (162).

Os produtos finais da glicação avançada ao se ligarem aos receptores RAN- GEs, induzem um estresse oxidativo caracterizado pelo fator nuclear kB, que promo- ve a produção de óxido nítrico, podendo interagir com outros radicais livres, como o

peroxinitrito, um oxidante potente que acredita-se ser um mediador das lesões nas células beta pancreáticas (163).

A via de ativação do NFkB nas células pode ser desencadeada por diversos fatores e por diferentes interações com outras vias, como citada acima, mas os re- sultados do nosso trabalho demonstram que a ativação desse fator nuclear foi de- sencadeada durante o aumento da produção de radicais livres, decorrente do pro- cesso de morte celular pela via apoptose.

Desta forma, podemos esquematizar os resultados, como apresentado na Fi- gura 12, demonstrando as interações que levaram a inibição da proliferação e morte celular dos linfócitos T.

Figura 13: Representação esquemática dos resultados obtidos no presente trabalho,

demonstrando as possíveis interações dos radicais livres com ativação do NFkB, despolarização mitocondrial e apoptose, após os tratamentos com P.alata, vitexina e isoorientina.

6.CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos podemos concluir que:

1. Na analise de proliferação dos linfócitos CD4+ _{e CD8}+_{, a concentração do}

EC50 do extrato aquoso da folha de P.alata e dos polifenóis vitexina e iso- orientina foram adequados para inibição celular.

2. O processo de morte celular dos linfócitos CD4+ _{e CD8}+_{, após os trata-}

mentos, foi desencadeado pela via apoptose tardia/necrose.

3. Os tratamentos levaram à perda da polaridade mitocondrial dos linfócitos, resultado que corrobora com a morte celular dos CD4+ _{e CD8}+_.

4. O estresse oxidativo e a produção de superóxido aumentou nos linfócitos submetidos aos tratamentos, reforçando os eventos do processo de morte celular.

5. A ativação do NFkB p65/p50 durante os tratamentos aumentou a expres- são quando tratados com o extrato aquoso da folha de Passiflora alata. 6. As analises das MIN6/ilhotas isoladas após os tratamentos mostraram bai-

xo estresse oxidativo e produção de superóxido.

7. As culturas celulares de MIN6/ilhotas isoladas tratadas com extrato aquo- so da folha de P.alata e polifenóis vitexina e isoorientina mantiveram a produção de insulina.