UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
TALITA CRISTINA COLOMEU
Modulação da ativação do fator kappa β p50/p65 (NFkB) e estresse oxidativo, em linfócitos e ilhotas pancreáticas/MIN 6, in vitro, tratados com extrato aquoso das
fo-lhas de Passiflora alata Curtis e polifenóis vitexina e isoorientina
CAMPINAS 2018
TALITA CRISTINA COLOMEU
Modulação da ativação do fator kappa β p50/p65 (NFkB) e estresse oxidativo, em linfócitos e ilhotas pancreáticas/MIN 6, in vitro, tratados com extrato aquoso das
fo-lhas de Passiflora alata Curtis e polifenóis vitexina e isoorientina
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a ob-tenção do título de Doutora em Ciências, área de Clínica Médica.
ORIENTADOR: Prof.Dr. Ricardo de Lima Zollner
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA TALITA CRISTINA COLOMEU, E ORIENTADA PELO PROF. DR. RICARDO DE LIMA ZOLLNER
CAMPINAS 2018
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
TALITA CRISTINA COLOMEUORIENTADOR: Prof.Dr Ricardo de Lima Zollner
MEMBROS:
1. PROF. DR. RICARDO DE LIMA ZOLLNER
2. PROF. DRA DENISE ENGELBRECHT ZANTUT WITTMANN
3. PROF. DRA. FLAVIA MARIA NETTO
4. PROF. DRA MARIANA BATTAGLIN VILLAS BOAS ALVARO
5. PROF. DRA GISELE MARA SILVA GONÇALVES
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Agradecimentos
A minha família que sempre me apoiou e esteve ao meu lado durante todo esse pe-ríodo.
Ao meu orientador Prof.Dr. Ricardo de Lima Zollner que me inspirou na trajetória acadêmica e contribuiu para minha formação.
Ao biólogo do laboratório Luis pela disposição em ajudar.
A minhas amigas de laboratório Débora, Priscila, Nayara e Virginia pela compreen-são e companheirismo.
A Patricia pela amizade e disposição em ajudar em todos os momentos.
A minha amiga, Daniella de Figueiredo, agradeço pela ajuda, concelhos, orientações e principalmente pelo companheirismo durante todo esse trabalho.
A Margarida Maria, minha querida amiga de todos esses oito anos de laboratório, agradeço pela ajuda, amizade e conselhos.
A Capes (01P-3370-2017) pela minha bolsa de doutorado. A Fapesp (2013-25256-8) pelo financiamento do projeto.
Patgen CNPq (010887/2014-8) autorização de coleta e uso das folhas do Passiflora alata Curtis.
“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que
ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”
RESUMO
A linhagem camundongo NOD (diabético não obeso) desenvolve espontaneamente o diabetes mellitus tipo 1A (DM1A) com acentuada similaridade ao observado em humanos. A destruição das células beta pancreáticas produtoras de insulina ocorre com a infiltração de células do sistema imune nas ilhotas pancreáticas em processo chamado de insulite. Vários são os mecanismos propostos para a ruptura da tole-rância imunológica no DM1A explorados em modelos experimentais, associados a distúrbios da tolerância central tímica. Assim, a manifestação da doença seria decor-rente de distúrbios que convergiriam para uma resposta comandada por linfócitos T, especificamente CD4+ e CD8+. A investigação para o desenvolvimento de fármacos
fitoterápicos para o DM1A, baseados na modulação do sistema imunológico, reve-lam que esta pode ser uma estratégia promissora para minimizar a destruição das células beta pancreáticas produtoras de insulina. Neste contexto, investigamos os efeitos dos tratamentos com o extrato aquoso das folhas de P.alata e dos compostos fenólicos isolados vitexina e isoorientina, in vitro, nas culturas de linfócitos, linfócitos e MIN6 (linhagem de célula beta) e linfócitos e ilhotas pancreáticas isoladas. Investi-gamos à morte celular dos linfócitos CD4+ e CD8+, estresse oxidativo, ativação do
fator kappa beta (NFkB) p50/p65 e produção de radicais livres,citocinas e insuli-na.Nossos resultados sugerem que os tratamentos, in vitro, com extrato aquoso fo-lhas do P.alata, vitexina e isoorientina podem levar a morte dos linfócitos ativados CD4+ e CD8+ pela despolarização mitocondrial, ativação do NFkB p50/p65 e pela via
apoptotica. Já as células beta (MIN6 e ilhotas) são conservadas durante os trata-mentos. Desta forma, o extrato de P.alata, a vitexina e isoorientina podem atuar co-mo regulador da sobrevivência da célula beta nas ilhotas pancreáticas diminuindo o processo inflamatório responsável pelo desenvolvimento do DM1A.
ABSTRACT
The strain of NOD mice (non-obese diabetic) spontaneously develops diabetes melli-tus type 1A (DM-1A) with strong similarity to the observed in humans. The destruc-tion of beta cells occurs with the infiltradestruc-tion of immune system cells into the pancreat-ic islets, a process called insulits. Several mechanisms are proposed for the rupture of immunological tolerance in DM1A, explored in experimental models associated with disorders of thymic central tolerance. Thus, the manifestation of the disease would be due to a failure and these disorders would converge to a response com-manded by T lymphocytes, specifically CD4+ e CD8+.Studies for the development of herbal medicines for DM1A based on intervention on the immune system reveal that maybe a promising strategy to prevent the destruction of insulin producing beta cells.In this context, we investigated the effects of the treatment of aqueous extract of the P.alata leaves and the polyphenols vitexin and isoorientin , in vitro, on lympho-cytes, lymphocytes wih MIN6 (beta cell line) and lymphocytes with isolated islets. We investigate cell death of CD4+ and CD8+ lymphocytes, oxydative stress, activation of the kappa beta factor (NFkB) p50/p65,free radical,cytokines and insulin production. Our results suggest that, in vitro, treatments with aqueous extract of P.alata leaves,vitexin and isoorientin can lead to the death of CD4+ and CD8+ lymphocytes by mitochondrial depolarization,activation of NFkB p50/p65 and by the apoptotic pathway, conserving beta cells (MIN6 and islets), thus acting as regulator of beta cell survival in the pancreatic islet assisting in the inflammatory process during the devel-opment of DM1A.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Família IkB e suas funções. Ativação do NFkB resulta na transcrição
dos inibidores do NfKB (IkB) genes. (A) Via atípica do IkB em linfoma de célu-las 3 (BCL-3), IkB e IkBNS resulta no complexo de informação com homodí-meros p50 ou p52. (B) BCL-3 pode facilitar a transcrição de um subconjunto de genes dependentes do NFkB, tendo a capacidade de transativação do ho-modímeros de p52, quando submetida a modificação pós-traducionais que são induzidas pela via de sinalização inflamatória. A BCL-3 não fosforilada é induzida por citocinas anti-inflamatórias para estabilizar os homodímeros p50 ou p52 inibitórios que reprimem a transcrição. A proteína CYLD (deubiquityla-ting enzyme cylindromatosis) pode remover o BCL-3, resultando no sequestro de complexos no citoplasma BCL-3-p52-p52 ou BCL-3-p50-p50. (C) IkB for-nece a capacidade de transcrição para os homodímeros quando complexado com eles. Em contraste, quando complexado com dímeros p65, IkB pode reprimir a transcrição. (D) IkBNS é induzida pela resposta a citocinas anti-inflamatória, tais como a interleucina-10 (IL-10) que pode reprimir a transcri-ção por meio da estabilizatranscri-ção dos homodímeros p50 inibitórios. (E) A expres-são de proteínas precursoras do NFkB e IkB a p105 e p100, gera aumento nos homodímeros p50 e p52 e, no caso da p100, estabiliza o RelB. Isso pro-porciona atividade do NFkB dependendo do IkB α-quinase (IKKα). (F) Ressín-tese das proteínas IkB típicas, especialmente IkBα e IkBε, fornecendo feed-back negativo.
Figura 2: Família IKK e a via de sinalização do NFkB. (A e B) Além da
fosfori-lação do IkB (inibidor do fator nuclear- KB) os membros da família IkB (IKKS) regulam as respostas de transcrição por fosforilação de proteínas NFkB. (C) Também se encontram no núcleo e podem promover a transcrição induzindo a fosforilação da histamina H3, o que leva uma maior acessibilidade do kB. Ikkα também atinge ambos os co-ativadores de transcrição e co-repressores dire-tamente. Fosforilação do co-ativador chave CBP (CREB proteína de ligação) resulta no vinculo para p65 em relação a outros fatores de transcrição. (D) Ikkα também tem como alvo o SMRT (mediador de silenciamento de ácido retinóico e do receptor do hormônio da tiroide) complexo co-repressor, que se associa com os complexos repressores de NFkB, como o p50, resultando no deslocamento de histamina-desacetilase 3 (HDAC3) e a substituição de p50 com complexos de transcrição ativos de NFkB, como o p50-p65. (E) Durante as fases tardias da transcrição em resposta a estímulos pró-inflamatorios, Ikkα regula negativamente a expressão de NFkB, através da fosforilação e direcio-namento de complexos p65, contendo REL para ubiquitinação e regulação negativa da proteína fosforilada.
31
Figura 3: Ativação da via típica do NFkB pelo TNF (receptor TNFR).
Meca-nismos envolvidos na translocação nuclear do heterodímero p50:RelA. A letra “p” significa fosforilados e a letra “u” sítios ubiquitinados.
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Figura 4: A) Folha do maracujá doce ( Passiflora alata Curtis); B) Folhas de
P.alata trituradas
42
Figura 5: A) Folha do maracujá doce (Passiflora alata Curtis);B) Folhas de
P.alata trituradas.
43
Figura 6. Ilhotas pancreáticas de camundongos NOD coradas com Ditizona e
visualizadas em microscopia óptica. Em destaque as ilhotas isoladas viáveis definidas pela coloração rósea. Aumento de 100x.
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Figura 7: Separação das ilhotas pancreáticas dos linfócitos. A) Retirada das
células da placa de cultura após 96hrs. B) Cultura mista de ilhotas (agrupa-mento de células maiores e arredondadas) e linfócitos (células menores, ao redor das ilhotas). Aumento de 200x. C) e D) Imagem representativa da sepa-ração dos linfócitos das ilhotas pancreáticas.
48
Figura 8: Figuras representativas da análise por citometria de fluxo referentes
a proliferação da cultura simples de linfócitos, demonstrando ser dose depen-dente.
60
Figura 9: Figura representativa da análise por citometria de fluxo da
prolifera-ção de linfócitos submetidos à ConA e as concentrações EC50 de extrato aquoso da folha de P. alata e polifenóis. A) Controle negativo apenas linfócitos (ausência de ConA); B) Linfócitos + 5µg/mL de ConA; C) Linfócitos com Con A + 500µg/mL de extrato aquoso da folha de P. alata; D) Linfócitos com Con A + 200µM de vitexina; E) Linfócitos com Con A + 40µM de isoorientina.
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Figura 10: Figura representativa da análise de apoptose e necrose por
cito-metria de fluxo de linfócitos submetidos à cultura simples nas dose EC50 do extrato aquoso da folha de P.alata. As letras no gráfico representa
A/N:Apoptose tardia/Necrose; V: viáveis; A: Apoptose; A) Controle negativo
(linfócitos sem estímulo mitogênico); B) Controle positivo (linfócitos com estí-mulo mitogênico – ConA - 5µg/mL); C) Linfócitos tratados com extrato aquoso das folhas de P. alata 500µg/mL. D) Linfócitos tratados com vitexina 200µM;
E) Linfócitos tratados com isoorientina 40µM.
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Figura 11: Figura representativa da análise por citometria de fluxo de
mitopo-tencial pela sonda JC-1. População superior de coloração verde, indicada pela seta cor verde, demonstra as células com membrana celular em despolariza-ção; já a população abaixo de coloração amarela, indicada pela seta amarela, são células com a membrana celular integra.
Figura 12: Figuras representativas da análise por citometria de fluxo do
po-tencial de membrana mitocondrial nas culturas simples de linfócitos submeti-das as concentrações EC50 do extrato aquoso submeti-das folhas de P. alata e polife-nóis. A) Controle negativo (apenas linfócitos); B) Controle positivo (linfócitos com estímulo mitogênico – ConA - 5µg/mL); C) Valiomicina 100µM (controle de despolarização); Linfócitos + 5µg/mL de ConA; D) Extrato de P. alata 500µg/mL; E) 200µM de vitexina; F) 40µM de isoorientina.
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Figura 13: Representação esquemática dos resultados obtidos no presente
trabalho, demonstrando as possíveis interações dos radicais livres com ativa-ção do NFkB, despolarizaativa-ção mitocondrial e apoptose, após os tratamentos com P.alata, vitexina e isoorientina.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Cultura simples de linfócitos tratados nas diferentes concentrações
de extrato aquoso da folha de P.alata. Análise estatística ANOVA com pós teste de Dunn ; *p<0,05; ****p<0,0001.
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Tabela 2: Cultura simples de linfócitos tratados com diferentes concentrações
de vitexina. Análise estatística ANOVA com pós teste de Dunn ; **p<0,01; ****p<0,0001.
61
Tabela 3: Cultura simples de linfócitos tratados com diferentes concentrações
de isoorientina. Análise estatística ANOVA com pós teste de Dunn ; **p<0,01; ****p<0,0001.
61
Tabela 4: Oxido Nítrico analisados nos sobrenadantes das culturas simples de
linfócitos tratadas com diferentes concentrações de P.alata, vitexina e isoorien-tina. Os resultados são expressos pela média±SD.Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn;*p<0,05;****p<0,0001.
74
Tabela 5: Proliferação de linfócitos CD4+ e CD8+ nas culturas mista de MIN6 e
linfócitos tratadas com diferentes concentrações de P.alata, vitexina e isoorien-tina.
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Tabela 6: Expressão de NFkB p65 em linfócitos CD4+ e CD8+ a partir das
cultu-ras mistas MIN6/linfócitos tratados com P.alata, vitexina e isoorientina. Os re-sultados são expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn; *<0,05 e ****p<0,0001.
87
Tabela 7: Expressão de NFkB p50 em linfócitos CD4+ e CD8+ a partir das
cultu-ras mistas MIN6/tratadas com P.alata, vitexina e isoorientina. Os resultados são expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn; *<0,05 e ****p<0,0001.
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Frequência cumulativa da incidência do diabetes nos camundongos
NOD ShiltJ.
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Gráfico 2: Analise da proliferação dos linfócitos submetidos a diferentes
concentrações de concanavalina A (con A), para verificação da concentração correspondente a maior proliferação. A concentração estabelecida foi de 5 µg/mL. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatística ANOVA com pós teste de Dunn ; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.
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Gráfico 3: Analise da proliferação dos linfócitos com concanavalina A (5µg/mL). A) Proliferação de linfócitos com diferentes concentrações de extrato aquoso da
folha de P.alata e identificação do EC50 na concentração de 500µg/mL. B) Proliferação de linfócitos com diferentes concentrações de vitexina e identificação do EC50 na concentração de 200µM. C) Proliferação de linfócitos com diferentes concentrações de isoorientina e identificação do EC50 na concentração de 40µM. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn; *p<0,05; **p<0,01;****p<0,0001.
63
Gráfico 4: Analise da proliferação dos linfócitos com concanavalina A (5µg/mL). A) Proliferação de linfócitos CD4+ tratadas com P.alata (500µg/mL), vitexina
(200µM) e isoorientina (40µM). B) Proliferação de linfócitos CD8+ tratadas com
P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (40µM).Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn; **p<0,01; ***p<0,001;****p<0,0001.
67
Gráfico 5: Analise da porcentagem de apoptose/necrose em linfócitos CD4+
pro-venientes das culturas simples tratadas com: A) extrato aquoso da folha de P.alata;B) vitexina;C)isoorientina.
68
Gráfico 6: Analise da porcentagem de apoptose/necrose em linfócitos CD8+
P.alata;B) vitexina;C)isoorientina.
Gráfico 7: Análise de Mitopotencial em linfócitos de cultura simples com
conca-navalina A (5 µg/mL). A valiomicina na concentração 100µM foi utilizada para gerar a morte celular, servindo de controle positivo de reação. Porcentagem de linfócitos despolarizados e polarizados em cultura simples com estrato aquoso de P.alata, nas concentrações (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (40µM). Os resultados foram expressos pela média±SD.Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn;*p<0,05;**p<0,01;***p<0,001.
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Gráfico 8: Representação da analise de Oxido Nítrico no sobrenadante das
cul-turas linfocitárias. A) Concentração de nitrito presentes nos sobrenadantes das culturas submetidas às diferentes concentrações de extrato aquoso da folha de P.alata. B) Concentração de nitrito presentes nos sobrenadantes das culturas submetidas às diferentes concentrações de vitexina. C) Concentração de nitrito presentes nos sobrenadantes das culturas submetidas às diferentes concentra-ções isoorientina. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn *p<0,05;****p<0,0001.
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Gráfico 9: Análise de cell rox nos linfócitos de culturas simples. A) Linfócitos
CD4+ tratados com as concentrações EC50 de P.alata (500µg/mL), vitexina
(200µM) e isoorientina (40µM); B) Linfócitos CD8+ tratados com as
concentra-ções EC50 de P.alata (500µg/mL); vitexina (200µM) e isoorientina (40µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn .*p<0,05.
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Gráfico 10: Análise de MitoSOX - Superóxido nos linfócitos CD4+ e CD8+; A)
Linfócitos CD4+ tratados com P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina
(40µM). B) Linfócitos CD8+ tratados com P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e
isoorientina (40µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. **p<0,01 e ****p<0,0001.
Gráfico 11: Análise de Glutationa nos linfócitos CD4+ e CD8+; A) Linfócitos CD4+
tratados com P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (40µM). B) Lin-fócitos CD8+ tratados com P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina
(40µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. **p<0,01; ***p<0,001 e ****p<0,0001.
80
Gráfico 12: Porcentagem de proliferação dos linfócitos CD4+ e CD8+ com IL-2. A) Proliferação de linfócitos com diferentes concentrações de extrato aquoso da
folha de P.alata. Identificação do EC50 na concentração de 500µg/mL. B) Proliferação de linfócitos com diferentes concentrações de Vitexina. Identificação do EC50 na concentração de 200µM. C) Proliferação de linfócitos com diferentes concentrações de Isoorientina. Identificação do EC50 na concentração de 5µM. Os resultados foramexpressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn; *<0,05;**p<0,01;***p<0,001.
82
Gráfico 13: Analise de apoptose/necrose dos linfócitos CD4+ e CD8+ com IL-2
em cultura mista de MIN6/linfócitos. A) Apoptose/necrose de linfócitos CD4+
tratadas com extrato aquoso da folha de P.alata (500µg/mL) e com os compostos isolados Vitexina (200 µM) e Isoorientina (5 µM) B) Apoptose/necrose de linfócitos CD8+ tratadas com extrato aquoso da folha de P.alata (500µg/mL) e
com os compostos isolados Vitexina (200 µM) e Isoorientina (5 µM). Os resulta-dos foram expressos em porcentagem de marcação.
84
Gráfico 14: Mitopotencial das culturas mistas de MIN6/linfócitos tratadas com
extrato aquoso da folha de P.alata (500µg/mL) e com os compostos fenólicos isolados Vitexina (200 µM) e Isoorientina (5 µM) analisando a despolarização mitocondrial celular. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn; **<0,01 e ****p<0,0001.
87
Gráfico 15: NFkB p65/p50 por ELISA nas culturas mistas de MIN6/linfócitos. A)
NFkB p65. B) NFkB p50. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. *p<0,05; **p<0,01;***p<0,001; ****p<0,0001.
Gráfico 16: Análise por citometria de fluxo nas culturas mistas de MIN6/
linfóci-tos referentes a expressão de NFkB p65/50 nos linfócilinfóci-tos CD4+ e CD8+. A) NFkB
p65. B) NFkB p65. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. *p<0,05; ***p<0,01;****p<0,001.
89
Gráfico 17: Análise de citometria de fluxo das citocinas TNF, IFN-Ɣ, IL-5 e IL-4. A) Citocina TNF; B) MFI-intensidade de fluorescência da citocina TNF; C)
Citoci-na IFN-Ɣ; D) MFI-intensidade de fluorescência da citociCitoci-na IFN-Ɣ;E) CitociCitoci-na IL-5;
F) intensidade de fluorescência da citocina IL-5;G) Citocina IL-4;H)
MFI-intensidade de fluorescência da citocina IL-4. Os resultados foram expressos pela média±SD Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn, **p<0,01;***p<0,001; ****p<0,0001.
91
Gráfico 18: Analise de citometria de fluxo da citocina IL-1β nas culturas mistas
de MIN6/ linfócitos tratados com P.alata,Viteixna e Isoorientina. A) Citocina IL-1β;
B) MFI-intensidade de fluorescência da citocina IL-1β. Os resultados foram
ex-pressos pela média±SD Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn
92
Gráfico 19: Análise de insulina produzida nas culturas mistas de MIN6 e
linfóci-tos tratadas com P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5 µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn, ****p<0,0001.
93
Gráfico 20: Concentração de oxido nítrico nas culturas mistas de MIN6 e
linfóci-tos tratadas com P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. **p<0,01; ****p<0,001.
95
Gráfico 21: Estresse Oxidativo- Cell Rox, nas culturas mistas de MIN6/linfócitos
analisados nas populações CD4+ e CD8+. A) Cell Rox nos linfócitos CD4+; B)
Cell Rox nos linfócitos CD8+. Os resultados foram expressos pela média±SD.
Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,001.
Gráfico 22: Análise da produção de superóxido pelos linfócitos nas culturas
mis-tas de MIN6/linfócitos submetidas as doses EC50 de extrato aquoso da folha de P.alata (500 µg/mL), polifenóis vitexina (200 µM) e isoorientina (5 µM). A) Linfóci-tos CD4+. B) Linfócitos CD8+. Os resultados foram expressos pela média±SD.
Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.**p<0,01;****p<0,0001.
98
Gráfico 23: Análise da produção de glutationa nas culturas mistas de
MIN6/linfócitos submetidos a dose EC50 de extrato aquoso da folha de P.alata (500 µg/mL) e polifenóis vitexina (200 µM) e isoorientina (5 µM). A) Linfócitos CD4+ . B) Linfócitos apenas CD8+. Os resultados formas expressos pela
mé-dia±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.**p<0,01;****p<0,0001.
99
Gráfico 24: Porcentagem de proliferação dos linfócitos CD4+ e CD8+ com IL-2
em cultura mista de ilhota/linfócitos. As culturas foram tratadas com a concentração EC50, 500µg/mL de P.alata, 200 µM de vitexina e 5 µM de isoorientina. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.***p<0,001;****p<0,0001.
101
Gráfico 25: Porcentagem de apoptose e necrose dos linfócitos CD4+ e CD8+
com IL-2 nas culturas mistas de ilhotas e linfócitos. A) Apoptose e necrose de linfócitos CD4+ tratadas com extrato aquoso da folha de P.alata (500ug/mL),
vitexina (200 µM) e isoorientina (5 µM) B) Apoptose e necrose de linfócitos CD8+
tratadas com extrato aquoso da folha de P.alata (500ug/mL), vitexina (200 µM) e isoorientina (5 µM).
102
Gráfico 26: Análise por ELISA da expressão de NFkB p65/50 em linfócitos
CD4+ e CD8+ provenientes das culturas mistas de ilhotas/linfócitos. A) NFkB p65. B) NFkB p50. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica
ANOVA com pós teste de Dunn. *p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.
105
Gráfico 27: Analise da expressão de NFkB p65/50 em linfócitos CD4+ e CD8+
provenientes das culturas mistas com ilhotas/linfócitos. A) NFkB p65. B) NFkB p50. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA
com pós teste de Dunn. *p<0,05;**p<0,01; ****p<0,0001.
Gráfico 28: Analise por citometria de fluxo da expressão de citocinas TNF,
IFN-Ɣ, IL-5 e IL-4. A) Citocina TNF; B) MFI-intensidade de fluorescência da citocina TNF; C) Citocina IFN-Ɣ; D) MFI-intensidade de fluorescência da citocina IFN-Ɣ;E) Citocina 5; F) MFI-intensidade de fluorescência da citocina 5;G) Citocina IL-4;H) MFI-intensidade de fluorescência da citocina IL-4. Os resultados foram ex-pressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn, *p<0,05;***p<0,001.
107
Gráfico 29: Analise por citometria de fluxo das citocinas IL-1β nos
sobrenadan-tes das culturas mistas ilhota/linfócitos submetidas as doses EC50 do extrato aquoso da folha com P.alata,vitexina e isoorientina. A) Citocina TNF; B) MFI-intensidade de fluorescência da citocina IL-1β. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn, **p<0,01
108
Gráfico 30: Análise da secreção insulínica nos sobrenadantes das culturas
mis-tas de ilhomis-tas/linfócitos, submetidas às doses EC50 de P.alata (500µg/mL), vite-xina (200µM) e isoorientina (5 µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.
108
Gráfico 31: Análise de oxido nítrico produzido durante a cultura mista
ilho-ta/linfócitos submetidas a doses EC50 do extrato aquoso da folha de P.alata (500µg/mL) vitexina (200 µM) e isoorientina (5 µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.*p<0,05.
109
Gráfico 32: Análise da produção de cell rox nos linfócitos provenientes das
cultu-ras mistas linfócitos com ilhotas pancreáticas isoladas submetidas às doses EC50 do extrato aquoso da folha de P.alata (500 µg/mL), vitexina (200 µM) e isoorientina (5 µM). A) Linfócitos CD4+. B) Linfócitos CD8+. Os resultados foram
expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.*p<0,05;***p<0,001.
Gráfico 33: Produção de Superóxido (Mito-SOX) em linfócitos provenientes das
culturas mistas linfócitos com ilhotas pancreáticas isoladas submetidas às doses do extrato aquoso da folha de P.alata (500 µg/mL), vitexina (200 µM) e isoorien-tina (5 µM). A) Linfócitos CD4+. B) Linfócitos CD8+. Os resultados foram
ex-pressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.*p<0,05; ***p<0,001; ****p<0,0001.
113
Gráfico 34: Produção de Glutationa pelos linfócitos provenientes das culturas
mistas linfócitos e ilhotas pancreáticas isoladas submetidas às doses EC50 do extrato aquoso da folha de P.alata (500 µg/mL),vitexina (200 µM) e isoorientina (5 µM). A) Linfócitos CD4+. B) Linfócitos CD8+. Os resultados foram expressos
pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.****p<0,0001.
114
Gráfico 35: Estresse oxidativo – cell rox nas células MIN6 submetidas às doses
EC50 do extrato aquoso da folha da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.
117
Gráfico 36: Superóxido (Mito-SOX) nas células MIN6 submetidas às doses
EC50 do extrato aquoso da folha da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. *p<0,05.
117
Gráfico 37: Glutationa nas células MIN6 submetidas às doses EC50 do extrato
aquoso da folha da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. *p<0,05.
118
Gráfico 38: Expressão de NFkB p65 e p50 nas células MIN6 submetidas às
do-ses EC50 do extrato aquoso da folha da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). A) Células MIN6 expressando NFkB p65. B) Células MIN6 expressando NFkB p50. Os resultados foram expressos pela
média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. *p<0,05;***p<0,001;****p<0,0001.
Gráfico 39: Cell Rox-estresse oxidativo nas ilhotas submetidas às doses EC50
do extrato aquoso da folha da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.*p<0,05; **p<0,01.
120
Gráfico 40: Superóxido (Mito-SOX) nas ilhotas submetidas às doses EC50 do
extrato aquoso da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.**p<0,01.
121
Gráfico 41: Glutationa nas ilhotas submetidas às doses EC50 do extrato aquoso
da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoorientina (5µM). Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn.***p<0,001.
121
Gráfico 42: Expressão de NFkB p65 e p50 nas ilhotas submetidas às doses
EC50 do extrato aquoso da folha de P.alata (500µg/mL), vitexina (200µM) e isoo-rientina (5µM). A) Ilhotas expressando NFkB p65. B) Ilhotas expressando NFkB p50. Os resultados foram expressos pela média±SD. Análise estatistica ANOVA com pós teste de Dunn. **p<0,01.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
• 7AAD- 7 aminoactinomicina D • APC- aloficocianina
•
ConA- concanavalina A•
CFSE- sonda de proliferação-cell dye • DAP- 4´,6- diamidino-2-phenylndole • DABCO-1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane • DMEN-Dulbecco´s modified Eagle´s médium • ELISA- ensaio de imunoabsorção enzimático•
EC50- concentração de farmáco que induz metade do efeito máximo • FITC- isotiocianato de fluoresceína• IL-1B- interleucina-1B • IL-2- interleucina 2 • IL-4 – interleucina 4 • IL-5- interleucina 5
• TNF-fator de necrose tumoral • INF-interferon
• FAS
• JC-1- carbocyanina catiónica
•
MIN6- células beta insulinoma de murinho•
NOD-Shilt-J – camundongo non-obese diabetic• NO- óxido nítrico
•
NFKB- fator de transcrição kB•
P.alata- Passiflora alata Curtis• Percp- Proteínas Peridinina-Chropila • PE- ficoeritrina
• PBS- tampão fosfato-salino
• RPMI- Roswell Park memorial Institute • TH1- célula T helper 1
• TH2- células T helper 2
SUMÁRIO
1-INTRODUÇÃO 27
1.1 Fator de transcrição kappa beta 27
1.2 Família NFkB 28
1.3 Família IKB e vias de sinalização de NFkB 28
1.4 Ativação e Inibição do fator de transcrição kappa-B 32
1.5 Diabetes mellitus tipo 1A e o NFkB 33
1.6 Apoptose e morte celular 34
1.7 Processo Oxidativo 35
1.8 Compostos antioxidantes e suas ações 37
1.9 Camundongo NOD ShiLtJ (diabético não obeso) modelo expe-rimental para Diabetes mellitus tipo 1A
39
2.0 Objetivo 41
3.0 Material e Métodos 42
3.1 Folhas de Passiflora alata Curtis 42
3.2 Preparo do extrato aquoso da folha liofilizado de Passiflora alata
42
3.3 Compostos polifenóis vitexina e isoorientina 42
3.4 Células MIN6 43
3.5 Modelo Experimental e Sacrifício dos animais 43
3.7 Extração de linfócitos 45
3.8 Cultura Simples de linfócitos de animais não diabéticos com
30 semanas de vida. 46
3.9 Identificação da concentração de concanavalina A para as culturas simples de linfócitos
47
3.10 Cultura mista de ilhotas/linfócitos 47
3.11 Cultura mista de MIN6/linfócitos 48
3.12 Identificação do EC50 e proliferação de linfócitos CD4+ e
CD8+ com extrato aquoso da folha de Passiflora alata nas culturas
simples e nas culturas mistas
49
3.13 Identificação do EC50 e proliferação dos linfócitos CD4+ e
CD8+ com compostos fenólicos vitexina e isoorientina
49
3.14 Apoptose 50
3.15 Despolarização Mitocondrial 51
3.16 Estresse Oxidativo – CellRox 52
3.17 Superóxido MitoSOX 52
3.18 Glutationa 53
3.19 Fator Kappa β (NFk-B) 53
3.20 Identificação do Fator Kappa β (NFk-B) p65/p50 em linfócitos CD4+ e CD8+ nas culturas mistas de ilhota/linfócitos e
MIN6/linfócitos
3.21 Níveis de Oxido Nítrico 54
3.22 Citocinas IL-1β,IL-4,IL-5, TNF e IFN- 55
3.23 Insulina radioimuno ensaio 56
3.24 Imunofluorescência 55
3.25 Análise Estatística 55
4. Resultados 58
4.1 Incidência de Diabetes mellitus nos camundongos NOD (non obese diabetic)
58
4.2 Cultura Simples de Linfócitos ativados com Concanavalina A 59 4.3 Analises das culturas mistas de MIN6 e linfócitos ativados com
IL-2
81
4.4 Analises das culturas mistas de ilhota e linfócitos ativados com IL-2
100
4.5 Analise de células MIN6 isoladas 115
4.6 Analise de células ilhotas isoladas 119
5.0 Discussão 123
5.1 Diabetes mellitus tipo 1A e camundongos NOD 123 5.2 Passiflora alata e seus compostos vitexina e isoorientina na
inibição celular de linfócitos T
123
5.3 Inibição dos linfócitos T e produção de citocinas 125 5.4 Processo de morte celelular nos linfócitos T 130 5.5 Estresse oxidativo e produção de radicais livres 132 5.6 Ativação da via NFkB e Diabetes Mellitus 135
7.0 Consideração Final 140
8.0 Referencias 141
1.INTRODUÇÃO
1.1 Fator de transcrição kappa beta
O NFkB (fator nuclear kappa B) é uma família de proteínas reguladoras da expressão de diversos genes. Sen e Baltimore (1986) (1) descobriram o fator de transcrição, através de sequências intrônicas de regulação positiva, presentes no gene que transcreve a cadeia k (kappa) da imunoglobulina em linfócitos B de huma-nos e camundongos. Nesse estudo a ausência desse fator em núcleos de outras células levou os autores a acreditarem que se tratava de um fator exclusivo das célu-las B, denominando-o como fator nuclear kappa B.
Na mesma época, outro estudo, Atchison e Perry (1987) (2) demonstraram que o NFkB poderia ser induzido, em linhagem de plasmocitomas. Alguns anos de-pois Chirmule e colaboradores (1994) (3) descreveram que os linfócitos T quando ativados pelo vírus HIV (vírus da imunodeficiência humana) apresentavam um au-mento da ligação de NFkB ao DNA.
Após os estudos iniciais, foi verificado que a não detecção deste fator nos ex-tratos nucleares de diferentes tipos celulares era devido à associação entre o NFkB e um fator de inibição citoplasmático nas células estimuladas. Essa observação foi decorrente das análises de agentes dissociadores que induziram a localização nu-clear do NFkB em células não linfoides e pela identificação da proteína complexada ao NFkB no citoplasma, chamada proteína inibitória kappa B (IKB). Com esses me-canismos pode-se identificar a via de sinalização, onde células não estimuladas apresentam o fator NFkB ligado a proteína inibitória IKB no citoplasma, mas quando ocorre a separação deste complexo proteico, o NFkB livre, transloca-se ao núcleo e se liga as sequencias presentes nas regiões regulatórias de diversos genes (4, 5).
Sabe-se atualmente que o NFkB além de estar presente em praticamente to-dos os tipos celulares, está também associado ao sistema imune, tendo como os principais estímulos que ativam esta via, o fator de necrose tumoral (TNF), interleu-cinas (IL-1β; IL-2), os padrões moleculares associados a patógenos (PAMPS), sina-lizadores de apoptose e de proliferação celular, fatores de crescimento, estresse oxidativo e infecção viral (6).
1.2 Família NFkB
Encontram-se em mamíferos cinco proteínas da família NFkB, identificadas por compartilharem entre si um domínio amino-terminal de homologia REL, sendo elas: p65, RelB, c-Rel, p50 (NFKB1) e p52 (NFkB2). A p50 e p52 são formadas pela clivagem dos precursores maiores, p105 e p100 (7).O REL é essencial para o con-trole da translocação nuclear de NFkB, pois é o domínio responsável pelos proces-sos de dimerização entre subunidades e possuem as sequências de localização nu-clear (NLS). Estes domínios possuem sítios de interação com as proteínas inibitórias IKB que quando ligados recobrem o NLS de NFkB, mantendo as subunidades no citoplasma e também com o DNA, reconhecendo as sequências nucleotídicas res-ponsivas ao NFkB nos genes-alvos(8).
As subunidades de NFkB atuam em forma de dímeros como p50:RelA, p50:RelB, p50:c-Rel, p52:RealA, p52:RelB, p52:c-Rel, RelA:RelB, RelA:c-Rel,p50:p50,p52:p52, c-Rel:c-Rel e RelA:RelA, onde a forma predominante encon-trada é o heterodímero p50:RelA ou p50:p65 (8, 9).
Essas subunidades podem ser consideradas ativadoras ou inibidoras gênicas. As subunidades RelA,RelB e c-Rel são ativadoras da transcrição gênica, pois apre-sentam um domínio de transativação na sua porção C-terminal, essencial para indu-ção gênica. Por outro lado, as subunidades p50 e p52 são tidas como repressoras por não apresentarem este domínio. O homodímero p50:p50 é a forma mais encon-trada de repressores de transcrição gênica (10).
As sinalizações para translocação do NFkB para ativação ou inibição dessa via estão envolvidas com a família IKB-IKK.
1.3 Família IKB- IKK e vias de sinalização de NFkB
Existem nove membros da família IKB que compartilham um domínio de repe-tição de ankirinas que lhes confere a capacidade de interação com as subunidades NFkB.Essas proteínas podem ser IKB típicas (IKBα, IKBβ e IKBε), IKB atípicas (IK-Bζ, BCL-3 e IKBNS) e precursores p100, p105 e IKBγ.Esses precursores formam dímeros com outras subunidades, mantendo-as no citoplasma. Após estímulo os precursores p100 e p105 podem ser totalmente degradados ou formar as subunida-des p50 e p52 (11) (Fig. 1;pág 32) .
Já o complexo de quinase IKK é composto pelas subunidades catalíticas IK-Kα e IKKβ e pela subunidade regulatória IKKγ, mais conhecida como NEMO (NFkB essential modulator) (12). As subunidades catalíticas agrupam-se em homodímeros e heterodímeros e são responsáveis pela fosforilação das IKBs. A presença de to-dos esses componentes possibilita que um sinal extracelular seja convertido em uma cascata de sinalização intracelular comum, mas com geração de uma resposta gêni-ca adequada e específigêni-ca. A mediação por NFkB também é relevante a especificida-de, havendo a rápida indução da transcrição de genes e posteriormente a resposta tardia. Nestes últimos estão incluídos os genes das próprias proteínas inibitórias, como IKBα, revelando um mecanismo de retroalimentação negativa envolvido na finalização da resposta mediada por NFkB (13)(Fig. 2;pág 33).
As vias de sinalização do NFkB pode ser pela via típica, alternativa e atípica (14). A via típica o complexo IKK, em especial o IkKβ, fosforila a IKBα, cuja degrada-ção leva à translocadegrada-ção nuclear do heterodímero p50:RelA. Esta via é ativada por estímulos relacionados ao NFkB, como TNF-α, Il-1 e outras citocinas. O heterodíme-ro p50:RelA induz à transcrição da grande maioria dos genes regulados pelo NFkB durante a resposta imune (15) (Fig. 3;pág 34).
A via alternativa pode ser induzida pelo CD40 e há ativação da IKKα pela qui-nase indutora de NFkB (NIK)c, o que resulta na fosforiação da subunidade p100 formando o p52. O dímero translocado é o p52:RelB e a ativação dessa via está re-lacionada aos processos de maturação de linfócitos B e T, e diferenciação das célu-las dendríticas (16).
A última via, a atípica é acionada pelo reconhecimento do DNA danificado, como por estímulos da H2O2. Esses estímulos fosforilam o IKB por um mecanismo
independente do completo IKK, dissociando-se em NFkB sem ser degradada por proteassoma. As subunidades envolvidas nesse processo são as mesmas da via típica p50:RelA, tendo importância em situações inflamatórias crônicas (17).
Figura 1: Família IkB e suas funções. Ativação do NFkB resulta na transcrição dos
inibidores do NfKB (IkB) genes. (A) Via atípica do IkB em linfoma de células 3 (BCL-3), IkB e IkBNS resulta no complexo de informação com homodímeros p50 ou p52.
(B) BCL-3 pode facilitar a transcrição de um subconjunto de genes dependentes do
NFkB, tendo a capacidade de transativação do homodímeros de p52, quando sub-metida a modificação pós-traducionais que são induzidas pela via de sinalização in-flamatória. A BCL-3 não fosforilada é induzida por citocinas anti-inflamatórias para estabilizar os homodímeros p50 ou p52 inibitórios que reprimem a transcrição. A pro-teína CYLD (deubiquitylating enzyme cylindromatosis) pode remover o BCL-3, resul-tando no sequestro de complexos no citoplasma BCL-3-p52-p52 ou BCL-3-p50-p50.
(C) IkB fornece a capacidade de transcrição para os homodímeros quando
comple-xado com eles. Em contraste, quando complecomple-xado com dímeros p65, IkB pode re-primir a transcrição. (D) IkBNS é induzida pela resposta a citocinas anti-inflamatória, tais como a interleucina-10 (IL-10) que pode reprimir a transcrição por meio da esta-bilização dos homodímeros p50 inibitórios. (E) A expressão de proteínas precursoras do NFkB e IkB a p105 e p100, gera aumento nos homodímeros p50 e p52 e, no caso da p100, estabiliza o RelB. Isso proporciona atividade do NFkB dependendo do IkB
α-quinase (IKKα). (F) Ressíntese das proteínas IkB típicas, especialmente IkBα e IkBε, fornecendo feedback negativo.
Figura 2: Família IKK e a via de sinalização do NFkB. (A e B) Além da fosforilação
do IkB (inibidor do fator nuclear- KB) os membros da família IkB (IKKS) regulam as respostas de transcrição por fosforilação de proteínas NFkB. (C) Também se encon-tram no núcleo e podem promover a transcrição induzindo a fosforilação da histami-na H3, o que leva uma maior acessibilidade do kB. Ikkα também atinge ambos os ativadores de transcrição e repressores diretamente. Fosforilação do co-ativador chave CBP (CREB proteína de ligação) resulta no vinculo para p65 em rela-ção a outros fatores de transcrirela-ção. (D) Ikkα também tem como alvo o SMRT (medi-ador de silenciamento de ácido retinóico e do receptor do hormônio da tiroide) com-plexo co-repressor, que se associa com os comcom-plexos repressores de NFkB, como o p50, resultando no deslocamento de histamina-desacetilase 3 (HDAC3) e a substi-tuição de p50 com complexos de transcrição ativos de NFkB, como o p50-p65. (E) Durante as fases tardias da transcrição em resposta a estímulos pró-inflamatorios, Ikkα regula negativamente a expressão de NFkB, através da fosforilação e direcio-namento de complexos p65, contendo REL para ubiquitinação e regulação negativa da proteína fosforilada.
TNF TNFR Complexo IKK NEMO IKKβ IKKβpp IkBα p65 p50 p p p u u u u p p p IkBα p50 p65 IL-6,IL-8
Fig.3: Ativação da via típica do NFkB pelo TNF (receptor TNFR). Mecanismos
en-volvidos na translocação nuclear do heterodímero p50:RelA. A letra “p” significa fos-forilados e a letra “u” sítios ubiquitinados.
1.4 Ativação e Inibição do fator de transcrição kappa-B
De forma geral, a via de sinalização do NFkB abrange diversos fatores com mecanismo complexo de estímulos-específicos e célula-específica. Em células não estimuladas, a manutenção do NFkB:IkB no citoplasma está em equilíbrio dinâmico de entrada e saída nuclear, permitindo que o NFkB transloque-se naturalmente para o núcleo. As proteínas IkB, também são encontradas no núcleo e contribem para a finalização da resposta mediada pelo NFkB(18).
Já a IkBα, tem sua transcrição induzida pelo NFkB sendo capaz de se com-plexar com o NFkB nuclear que está no DNA e transporta-lo de volta ao citoplasma, pois possuem um domínio de exportação nuclear em sua estrutura (19).
A ativação da família NFkB também participa no desenvolvimento e funções de linfócitos T (20), principais tipos celulares envolvidos em doenças autoimunes, como o Diabetes Mellitus tipo 1A.
1.5 Diabetes mellitus tipo 1A e o NFkB
O Diabetes Mellitus é um grupo de distúrbios metabólicos que apresenta em comum a hiperglicemia crônica. Especificamente no diabetes tipo 1A (DM-1A), é uma doença autoimune que apresenta um início agudo, com infiltração celular nas ilhotas pancreáticas, que levam a destruição das células betas produtoras de insuli-na, mas o(s) fator(s) desencadeante (s) ainda não foram totalmente elucidados. A predisposição genética do indivíduo, juntamente com fatores ambientais e nutricio-nais, parece favorecer o desencadeamento de mecanismos auto-imunes levando ao desenvolvimento da doença (21-23).
O Diabetes mellitus tipo 1A e outras doenças relacionadas com a inflamação, como doenças por infecção viral ou doenças genéticas, estão associadas a ativação do fator nuclear kB (NFkB). Especificamente no diabetes tipo 1A, a ativação do NFkB está vinculada à alta produção dos radicais livres ocasionada no decorrer do desenvolvimento da doença e esta ativação leva à destruição das células β produto-ras de insulina e o agravamento da progressão da doença (24).
Kuon e col (1995), estudando a ativação do NFkB pelos radicais livres em modelo de linhagem celular de células beta, verificou aumento das citocinas, como interleucinas, TNF-α, entre outras, levando assim ao aumento do processo inflama-tório e morte celular (25). Por outro lado, estudos in vitro empregando células beta extraídas de ratos wistar mostraram que inibição da produção de IL-1 no meio celu-lar induziu o IkBα, impedindo assim a apoptose celucelu-lar e por consequência a morte celular (26).
O papel do NFkB no diabetes tipo 1A foi descrito por Lamhamedi-Cherradi e col., (2003) onde p50/p105 foram essenciais para o desenvolvimento da doença em ratos wistar (27). A sinalização de NFkB também parece estar envolvida com a resis-tência a insulina no diabetes tipo 2. Yuan, e col. (2015) (28) mostraram que
reduzin-do a sinalização da via IkKβ aumentava a sensibilidade a insulina e redução da obe-sidade em camundongos.
A ativação NFkB em células β parece ser estimulada com o fluxo intracelular de cálcio (Ca+). A supressão do NFkB nas células β conduz a alterações na
ex-pressão do gene envolvido na captação da glicose, metabolismo oxidativo e Ca+
de-sencadeando exocitose da insulina (29).
A destruição de células produtoras de insulina durante o diabetes tem a parti-cipação de linfócitos CD8+ e CD4+ que levam essas células a morte. Os linfócitos
CD4+ durante o DM1A induzem à produção de mediadores inflamatórios como,
TNF-α, IL-1 e INF-γ. Suk e seus colaboradores (30) sugerem que a citocina TNF- α ou o TNF- α junto com INF- γ, participem como mediadores na destruição das células β. Kandharen e col. (2015) verificaram que a IL-1 β juntamente com o óxido nítrico au-menta o processo oxidativo e inflamatório, processos envolvidos na morte destas células (31).
Como a via de sinalização do NFkB pode ser estimulada pelo TNF- α e IL-1 alguns autores acreditam que esses mediadores inflamatórios possam desenvolver papel importante na ativação desta via levando as células β a morte celular pela via apoptótica durante o diabetes(32).
1.6 Apoptose e morte celular
A morte celular pode ser desencadeada por diferentes vias, como a apoptose e a necrose celular. A apoptose é a morte celular programada que inclue diversos fatores e desempenha papel na homeostase celular. A ativação da apoptose pode ser iniciada pela via extrínseca (citoplasmática) ou pela via intrínseca (mitocondrial). Na via extrínseca, receptores de fatores de necrose tumoral (rTNF) ativam a via das caspases. A ligação do TNF ao TNFR1 associa o receptor à proteína adaptadora TRADD (proteína de domínio associada ao receptor), que por sua vez, se liga a FADD e leva à apoptose através da ativação das caspases, assim como ocorre com as interações Fas-FasL (33).
O Fas é expresso na maioria das células e seu ligante Fas-L é encontrado nas membranas de linfócitos T ativados. A apoptose pela via Fas-Fas-L é
desenca-deada quando esses receptores formam agregados e ligam-se à proteína adaptado-ra FADD (Fas- domínio de morte associado) presente no citoplasma. Essa ligação ativa a pró-caspase-8, resultando na formação de um complexo denominado DISC (Complexo de sinalização induzindo à morte), que culmina na auto-clivagem forman-do a caspase-8. A caspase-8 pode, diretamente ou pela via mitocondrial, ativar a caspase-3 efetora, o que resulta na apoptose celular (34, 35).
Já na via intrínseca, a presença de compostos oxidantes ou qualquer interfe-rência pró-apoptótica nas células, ocorre migração de proteínas BAX e BID do plasma para mitocôndria, liberando outras proteínas pró- apoptóticas, como os cito-cromos C, o fator indutor de apoptose, DNAses e pró-caspase 2 e 9(36). O citocro-mo C se liga à proteína adaptadora (Adaf-1), ativando as caspases e culminando na apoptose pela via mitocondrial, que também é regulada por proteínas da família Bcl-2 (37).
Quando sinais de morte alcançam a mitocôndria, levam ao colapso do poten-cial da membrana mitocondrial interna, bem como a uma transição da permeabilida-de mitocondrial. Ao mesmo tempo, a água do espaço entre as membranas passa para a matriz mitocondrial, levando a ruptura da organela e consequente liberação de proteínas pró-apoptóticas para o citoplasma. A liberação de citocromo c, a indu-ção do colapso do potencial de membrana e a transiindu-ção da permeabilidade levam a perda da homeostasia celular, interrompendo a síntese de ATP e aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS). A EROS leva à oxidação de lipí-deos, proteínas e ácidos nucleicos, aumentando o colapso do potencial da membra-na, gerando o processo oxidativo (38).
1.7 Processo Oxidativo
Em mamíferos, a progressão de diversas doenças pode se associar à modu-lação do estresse oxidativo. O estresse oxidativo pode ser definido como um estado de desequilíbrio entre os fatores que geram os radicais livres e os fatores que prote-gem o organismo, os antioxidantes. No diabetes a compreensão do papel oxidativo é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento (39).
A hiperglicemia prolongada e o aumento dos radicais livres no diabetes levam ao estresse oxidativo, gerando oxidação de proteínas, carboidratos, enzimas, lipídeos de membrana, DNA e aumento da inflamação no organismo (40). Os radicais livres formados durante o processo oxidativo, como o hidroxil (OH), superóxido (O2-),
pe-roxil (RO2), hidroperoxil (HRO2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido
hidrocloridri-co (HCL), induzem à diminuição dos antioxidantes, fosfato de dinucleótido de nihidrocloridri-coti- nicoti-namida e adenina (NADPH) e a glutationa (GSH) (41).
Além disso, o excesso de glicose intracelular produzido pela via poliol é converti-do em poliálcool de sorbitol, que por sua vez, reduz a concentração intracelular converti-dos agentes antioxidantes, NADPH e GSH, e consequentemente, induz a produção de superóxido nas mitocôndrias. O sorbitol é metabolizado em frutose, aumentando o NADH/NAD+, que leva a inibição de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GA-PDH) promovendo o aumento de fosfato de triose. Os níveis elevados de fosfato de triose leva a formação de metilglioxal precursor das AGEs e o diacilglicerol (42) que ativa o PKC(43).
A oxidação da glicose leva a formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Os AGEs são proteínas ou lipídios que se tornam glicados após a exposição a açúcares oxidados e contribuem para o desenvolvimento do diabetes. Sua ação leva à modificação de proteínas intracelulares envolvidas na regulação gênica, inter-ferindo na sinalização entre a matriz e a célula e causando disfunção celular. Algu-mas proteínas como a albumina, ativam os receptores de AGEs, os RAGEs (recep-tor para produtos finais de glicação avançada) e essa ligação na superfície celular, induz ao estresse oxidativo caracterizado pelo aumento do fator de transcrição NFkB que promove a produção de óxido nítrico. O óxido nítrico pode interagir com outros radicais livres gerando o peroxinitrito, oxidante potente que acredita-se ser um medi-ador das lesões nas células β das ilhotas pancreáticas(44).
O excesso de radicais livres durante o diabetes leva ao desequilíbrio nos anti-oxidantes. Os antioxidantes por sua vez, pelas suas propriedades anti-inflamatórias podem auxiliar no combate dos radicais livres e seus danos gerados durante o dia-betes mellitus tipo 1A.
1.8 Compostos antioxidantes e suas ações
Os antioxidantes são moléculas presentes em baixas concentrações, que inibem o processo oxidativo, eliminando os radicais livres, agindo como agentes de redução (45).
Os compostos fenólicos, encontrados nas plantas, podem agir como anti-inflamatório, anti-proliferativo, anticancerígeno, vaso protetor, anti- hepatotóxico, en-tre outros (46, 47).
A espécie Passiflora alata Curtis, conhecida popularmente como maracujá doce, possui em sua composição concentrações elevadas de antioxidantes e é considera-do pela farmacopeia brasileira como um fitoterápico no tratamento como ansiolítico. As suas folhas são utilizadas pela medicina popular no Brasil, como tranquilizante, sedativo e com ação hipoglicemiante (48-50).
Na composição química das folhas do maracujá doce podemos encontrar compostos fenólicos como flavonoides (vitexina; isovitexina; orientina; rutin; querce-tina; isoorienquerce-tina; vitexina -2´´-Orhamnoside; etc), alcaloides (harmana), saponinas, entre outras (51, 52).
Dentre os compostos presentes na folha do no Passiflora alata, o flavonoide vi-texina possui ação anti-inflamatória (53), anti-oxidante (54) e anti-tumor (55). Tan e col.,(2012) (55), mostraram que os efeitos da vitexina podem estar relacionados a indução de mecanismos apoptóticos via caspase-3 e Bcl2/Bax.
A vitexina possui propriedade de aumentar a produção de TNF-α que induz a morte celular em cultura de células hepatócitas de ratos swiss, protegendo contra hepatoxinas, como descrita por Kumari, e col., (2012) (56). Além disso, esse com-posto pode agir como antioxidante efetivo na inibição dos AGEs, do fator Kappa β (NFKβ) em monócitos/macrófagos (57).
Já o composto isoorientina, isolado da espécie Gentiana olivieri Grieseb. foi de-monstrada uma ação anti-hepatotóxica (58) e hipoglicemiante (59). Em adição, Ku-peli e col. (2004) (60) verificaram seus efeitos anti-inflamatórios em ratos Swiss albi-no não induzindo nenhum daalbi-no gástrico aparente e com atividade anti-albi-nociceptiva próxima ao encontrada no ácido acetilsalicílico.
Estudar a ação desses compostos em doenças vem se tornado cada vez mais usável nas pesquisas experimentais e clinicas. Os flavonoides e os fenóis provenien-tes da dieta, especialmente de fonprovenien-tes como o chá, têm sido investigados em diferen-tes modelos de cultura celular (61). Os resultados encontrados na literatura podem ser divididos basicamente em dois grupos: os compostos que atuam na proteção celular contra o estresse oxidativo e os que agem no combate de células de tumor, mostrando ação na inibição de proliferação e indução de morte celular (62).
Estudos com esses compostos em células tumorais demonstram efeito anti-proliferativo inibindo o crescimento e levando a morte das células cancerígenas com potencial contribuição na prevenção e tratamento do câncer, (63, 64).
Sgambato e col.,(2001) (10) verificaram que o composto fenólico resveratrol adicionado à cultura de célula epitelial de camundongos, fibroblasto de ratos e célu-las de câncer de mama, cólon e próstata de humanos, possui efeito na inibição da proliferação das células cancerígenas atuando também na indução da apoptose. Jing-Pin e col., (2009) (65) demonstram também que o composto rutina inibe o crescimento de tumores de leucemia no baço de ratos.
Na investigação da fisiopatologia do diabetes mellitus, é comum o uso de cé-lulas beta produtoras de insulina isoladas, como a HIT (66), MIN6 (67), βTC (68), RIN(69) e INS-1(70). De forma geral, essas células, tem a capacidade de estimular a secreção de insulina semelhante às células beta encontradas nas ilhotas pancreáti-cas (71). Contudo, no conjunto das células MIN6 pode ocorrer pequenas produções de outros hormônios como o glucagon ou somatostatina (67).
Os estudos que investigam a ação dos compostos fenólicos, in vitro, devem ser analisados com cautela, pois a interação dos compostos fenólicos com os com-ponentes do meio de cultura celular (como os íons de metal) podem ter efeito pró-oxidante. Compostos como a epicatequina,epicatequina galato, catequina e querce-tina em meio de cultura pode gerar alta concentração de água oxigenada (H2O2),
que ocasionará na morte das células em cultura (72).
Esta produção de H2O2 pode ter diferentes funções dependendo da
concen-tração produzida durante a cultura celular, como aumentar os níveis de cálcio, ativar os fatores de transcrição, reprimir a expressão de alguns genes, promover ou inibir a proliferação celular, ser citotóxica, ativar ou suprimir certas vias de transdução de
sinal, promover ou suprimir a apoptose e promover a diferenciação ou senescência celular (72, 73).
A ação antiproliferativa encontrada nos compostos fenólicos poderá ser útil na translacionalidade para o tratamento do diabetes mellitus tipo 1 A. A inibição da proli-feração das células do sistema imune, como os linfócitos T, macrófagos, entre ou-tras, que levam à destruição das células beta nas ilhotas pancreáticas pode ajudar na diminuição do processo inflamatório durante o desenvolvimento dessa doença.
1.9 Camundongo NOD ShiLtJ (diabético não obeso) modelo experimental para Diabetes mellitus tipo 1A
Na investigação do diabetes mellitus tipo 1A, o uso de modelo experimental auxi-lia no entendimento do desenvolvimento da doença.
A linhagem do camundongo NOD foi desenvolvida no Japão, após o cruza-mento de sublinhagem CTS (propensa a catarata) com uma linhagem não consanguí-nea ICR. O primeiro animal a desenvolver o DM-1A espontâneo foi uma fêmea que permitiu, a partir de cruzamentos seletivos de sua prole, o estabelecendo da linha-gem NOD isogênica em 1980 no laboratório Shionogi Aburahi como modelo animal para o diabetes mellitus tipo 1 (74). No Brasil, a linhagem foi introduzida em 1995 e implantada na Universidade Estadual de Campinas por Pavin&Zollner, a partir de colônias matrizes doadas gentilmente pelo Instituto Pasteur Inserm U-25-Necker, Paris,França (75). Contudo, recentemente trouxemos do Laboratório Jackson (EUA) e implantada no Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB) nova linhagem de camun-dongos NOD (NOD ShiltJ) com fenotipo diabético mais estável. Ela é mantida em condições “germ free” e apresenta prevalência de diabetes entre 70-100% nas fê-meas e 40-60% nos machos(76)
O DM-1A neste modelo animal caracteriza-se por duas etapas: a primeira com in-filtrados CD4+ e CD8+ nas ilhotas pancreáticas e a segunda com a destruição das
células β produtoras de insulina. Os fatores ambientais, tais como condições de ha-bitação, saúde e dieta, podem influenciar também no desenvolvimento do diabetes nesses animais (77-79).
Em trabalho prévio, verificamos que o consumo de antioxidantes, provenientes do extrato aquoso da folha do Passiflora alata Curtis,em camundongos NOD, in vivo,
auxilia na diminuição de infiltrado celular (CD4 +, CD8+ e CD11c+) , estresse
oxidati-vo e apoptose nas ilhotas pancreáticas desses animais , além de conservar os ní-veis de insulina sérica e glutationa reduzida no fígado e rins nesses animais (80). A partir desses resultados anteriores de inibição de infiltrado celular nas ilhotas pan-creáticas, neste presente trabalho avaliamos a interação dos compostos isolados presentes na folha do P. alata, vitexina e isoorientina, como também o extrato aquo-so das folhas do P. alata, nos linfócitos CD4+ e CD8+ em culturas mistas de ilhota e
células beta isoladas MIN6.
Hipótese do trabalho: O extrato aquoso das folhas de Passiflora alata Curtis e
seus compostos isolados vitexina e isoorientina modulam a ativação do NF-kB p50/p65 e possuem ação na inibição celular de linfócitos em culturas mistas com ilhota/MIN6.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL: Avaliar os efeitos in vitro, do extrato aquoso das folhas de
Passiflora alata e dos compostos fenólicos isolados vitexina e isoorientina, na modu-lação do NF-kB p50/p65, extresse oxidativo, produção de citocinas e morte celular de linfócitos ativados provenientes de camundongos NOD ShiltJ.
2.2 Objetivos Específicos:
Estabelecer os efeitos in vitro do extrato aquoso das folhas de P.alata, vitexi-na e isoorientivitexi-na sobre linfócitos, linfócitos/ilhotas pancreáticas e linfócitos/células MIN6 a partir das analises de:
• Proliferação de linfócitos totais e de CD4+ e CD8+ nas culturas simples e em
culturas mistas de linfócitos/ilhotas e linfócitos/MIN6.
• Morte celular dos linfócitos culturas simples e mistas linfócitos/ilhotas e linfóci-tos/MIN6.
• Citocinas (IL-1β; IL-2, TNF-α e IFN-) e insulina liberadas nas culturas simples de linfócitos e nas culturas mistas de linfócitos/ilhotas e linfócitos/MIN6.
• Ativação do fator nuclear Kappa β (NF-kB) p65/p50 nos linfócitos em cultura celular simples e mistas (linfócitos/ilhotas e linfócitos/MIN6).
• Ativação do fator nuclear Kappa β (NF-kB) p65/p50 especificamente, nas ilho-tas pancreáticas e nas células MIN6.
• Estresse oxidativo e produção de radicais livres nos linfócitos em cultura celu-lar simples e mistas (linfócitos/ilhotas e linfócitos/MIN6).
• Estresse oxidativo e produção de radicais livres, especificamente, nas ilhotas pancreáticas e nas células MIN6.
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Folhas do Passiflora alata Curtis
As folhas do maracujá (Patgen CNPQ 010887/2014-8) doce (P.alata), com coleta no período de Outubro a Dezembro de 2014, eram secas em estufa de circu-lação de ar (MARCONI, Piracicaba/SP) a 50ºC/48 horas, trituradas até obtenção de um pó e armazenadas sob refrigeração a 8ºC em frasco escuro.
Figura 4: A) Folha do maracujá doce (Passiflora alata Curtis);B) Folhas de P.alata
trituradas.
3.2 Preparo do extrato aquoso da folha liofilizado de Passiflora alata
O preparo do extrato aquoso da folha pesava-se 10g de folha seca e 100 mL de água, autoclavado por 20 minutos a 121ºC (80). O extrato era então filtrado em papel filtro estéril, liofilizado (Liofilizador Edwards-super Modulyo- West Sussex,RU) e armazenado a 8ºC em frasco escuro hemerticamente fechado.
3.3 Compostos polifenóis vitexina e isoorientina
Os compostos polifenóis isolados vitexina e isoorientina eram adquiridos da Sigma (Sigma, St Louis, EUA). A vitexina é uma apiginina flavona aglicona que pos-sui diversos glicosídeos. Já a isoorientina também é uma flavona luteolina-6-C-glicosídeo.
