Estresse oxidativo e produção de radicais livres

Os radicais livres são moléculas instáveis com eletrons desparelhados que tendem a se associar com outras moléculas. Podem ser definidos espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS), como superóxido, pero- xido de hidrogênio, óxido nítrico, entre outros. As moléculas de ROS são derivadas do oxigênio após ter sido consumido durante os processos metabólicos, ocorrendo principalmente na mitocôndria (130).

Dentre os radicais livres gerados no organismo, destaca-se o óxido nítrico (NO). O oxido nítrico é um radical livre produzido a partir da L-arginina que é conver- tida em L-citrulina. Essa reação por ser mediada pela enzima NO-sintase constituída (c-NOS), que depende de íons de cálcio e calmodulina e está envolvida na sinaliza- ção celular e NO- sintase induzível (i-NOS), produzida por macrófagos e outras célu- las ativadas por citocinas(131).

Quando comparadas as duas enzimas, a c-NOS produz pequenas quantida- des de óxido nítrico e sua ativação é dependente da interação com a calmodulina, que por sua vez, é controlada pelos níveis de Ca++_{. Por outro lado, a i-NOS, não é}

expressa em condições normais, ela pode ser induzida por citocinas e/ou endotoxi- nas em diferentes tipos celulares, como macrófagos, linfócitos T, células endoteliais, entre outras(132).

De forma geral o NO apresenta um papel dúbio, as vezes benéfico, outras vezes prejudicial ao organismo. O NO produzido pelo e-NOS nas células epiteliais, por exemplo, tem um papel essencial no processo de relaxamento do vaso sanguí- neo (133). Já o NO produzido pelo i-NOS possui ação citotóxica, promovendo a des- truição de microorganismos parasitas e células tumorais. A ação direta dessa NOS consiste na sua reação com metais, como o ferro, presentes nas enzimas do seu alvo. Assim, são inativadas as enzimas essenciais para o ciclo de Krebs, cadeia de transporte de elétrons, síntese de DNA e para os mecanismos de proliferação celular (134). O NO em amostras biológicas representa um desafio devido a concentração e meia-vida extremamente curta.

Nossos resultados não mostraram aumento de NO, seja nas culturas celula- res simples ou nas mistas submetidas aos diversos tratamentos quando comparados aos controles. Talvez esse resultado decorra da dificuldade na analise desse radical

livre durante o período longo de cultura necessário para as outras analises, apresen- tando assim, pouca produção desse radical livre.

Outro radical livre importante durante o processo de morte celular é o superó- xido. Superóxido é derivado da reação catalisada por algumas oxidases, como a gli- cose oxidase e a xantina oxidase, mas essa reação dependerá também do tecido examinado ou da ativação de diferentes complexos da cadeia de transporte de elé- trons por exemplo, há evidências de que o complexo I produz a maior parte do supe- róxido nas mitocôndrias (135).

Alterações na estrutura da mitocôndria ocorrem quando há modificação funci- onal da organela, sendo os passos iniciais de algumas formas de morte celular. Normalmente, as mitocôndrias após seus processos metabólicos convertem o oxi- gênio em radicais livres, sendo o superóxido o principal a ser produzido. A elimina- ção desse radical livre ocorre com a ligação do superóxido ao citocromo C, realizan- do a transferência de elétrons, que impede seu desligamento, chegando até a redu- ção completa em água (136).

Com a despolarização da mitocôndria e a perda do citocromo C para o meio extracelular, ocorre o aumento do superóxido e ativação da caspase-3 que conse- quentemente ativará a via apoptótica na célula (137). De forma geral, os tratamen- tos com os compostos vitexina e isoorientina e o extrato aquoso da folha de P.alata, levaram os linfócitos T a produzirem maiores concentrações de superóxido. Prova- velmente os linfócitos T ao serem tratados, ocasionou na perda da polaridade mito- condrial com a liberação do citocromo C e como consequência aumento do superó- xido e ativação da via apoptótica.

Satoh e col. 2013 mostraram que a apoptose induzida por epigalocathequina- 3-galato em linhagem celular de mesotelioma humano, ocorreu por meio da produ- ção de ROS e diminuição do potencial de membrana mitocondrial (138).

Em contraposição ao aumento dos radicais livres existem os antioxidantes, que removem o oxigênio do meio, sendo classificados como inibidores por seques- trarem os metais catalizadores da formação dos radicais livres. Contudo, em concen- trações mais elevadas os antioxidantes podem apresentam ação pró-oxidativa (139). Sassi, e col. 2012, mostraram que o tratamento com o polifenol quercetina em célu- las de fibroblastos de embrião (MEF) e células de C-26 de câncer de cólon de rato causou a morte por necrose destas células, atuando como um pro-oxidante e gera-

ção de anião superóxido nas mitocôndrias, o que indica despolarização mitocondrial (140).

Os antioxidantes podem ser classificados como exógenos/não enzimáticos e endógenos/enzimáticos. Os antioxidantes não enzimáticos são provenientes da ali- mentação, como as vitaminas, carotenoides, polifenóis, entre outros. Os flavonoides, um dos componentes principais da família dos polifenóis, além de possuir atividade antioxidante, sua ação pode envolver tanto a doação de hidrogênio inibindo a ativi- dade lesiva dos radicais livres, como também, modular ações celulares por meio de sinalização das proteínas quinases (141, 142).

Spencer e col. (2001) demonstram que a “via clássica” de doação de hidrogê- nio, durante a atividade antioxidante, é diferente entre as células, provavelmente de- vido a diferença encontrada no metabolismo de cada tipo celular. Os flavonoides, por exemplo, são metabolizados de diferentes formas no trato gastrointestinal, que pode modificar sua estrutura, sendo absorvidos de diferentes formas nas células (143).

Nas células os flavonoides apresentam três formas no metabolismo intracelu- lar, a primeira a conjugação de thiols, particularmente o GSH; a segunda o metabo- lismo oxidativo e o terceiro metabolismo relacionado ao P450 (citocromo que oxidam substratos lipofílicos exógenos) (144). Spencer, e col (2001) monstraram que a quercetina ao ser metabolizada nos fibroblastos dérmicos humanos induziu a forma- ção de produtos de oxidação intracelular, como o radical 2´- quercetina de glutationa (145).Outro metabolito gerado a partir dos flavonoides, é a forma O-metilado que reduz a habilidade de doar hidrogênio e diminui a eficácia de sequestrar as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, em relação a suas formas agliconas (146).

Os efeitos celulares dos flavonoides pode ser mediado pela interação com proteínas específicas (147). A interação entre flavonoides e proteínas específicas pode inibir ou estimular as funções celulares alternando a fosforilação de moléculas ou modulando a expressão gênica, ativando diferente vias de sinalização. Essas va- riações podem estar relacionadas com a associação nas células pela membrana ou pela captação no citosol (148).

Há evidências que ligam a ativação da via JNK MAPK pelos flavonoides. Essa via é responsável por diversos eventos celulares, como a ativação da morte celular e pode levar a perda neuronal devido aos estímulos pró-apoptóticos (149, 150).

As isoformas PKC (proteína quinase) também podem ser ativadas e levar a produção das principais enzimas de transdução de sinalização para responder a si- nais extracelulares em processos como proliferação, sobrevivênvia, angiogenese, metástase e tumorigria (151).

Além da via JNK MAPK e PKC, outra via que pode estar envolvida com os flavonoides e ser ativadas isolada ou em interação com essas vias é o fator de transcrição NFkB.