Atividade anti-câncer – in vivo

A toxicidade promovida por muitos quimioterápicos anticâncer torna-se um desafio para a terapêutica. Desse modo, buscam-se fármacos com maiores índices terapêuticos (relação entre a concentrações terapêutica e tóxica) e com maior seletividade para as linhagens tumorais (Weinberg, 2008).

Antes de iniciar os ensaios anticâncer in vivo, os testes de toxicidade aguda (quadro 1) promoveram suporte para a definição das doses que foram utilizadas nos ensaios antitumorais e também para as avaliações posteriores do controle da nocicepção e inflamação. Desse modo, os experimentos foram iniciados com as menores doses das amostras, aumentando essas doses frente aos resultados encontrados que pudessem promover o efeito anticâncer. O intervalo de tempo entre os tratamentos foram determinados pelo início, duração, severidade e sinais tóxicos apresentados (OECD 423, 2001).

Assim, foi possível o acompanhamento da evolução dos tumores frente à atividade farmacológica e também dos efeitos tóxicos, considerando que anteriormente, apenas os testes de toxicidade aguda para determinação das doses tinham sido determinados. Os sinais de toxicidade apresentados pelas amostras durante os ensaios anticâncer, juntamente com os resultados de toxicidade aguda, puderam ser avaliados para determinação das doses que seriam utilizadas, posteriormente, nos ensaios antinociceptivos e anti- inflamatórios em camundongos Swiss machos, pois os protocolos aprovados para esses experimentos que envolvem atividade comportamental (nocicepção e inflamação) foram aprovados apenas para administração de doses únicas.

Inicialmente, a via intraperitoneal (i.p.) determinou o perfil de atividade das amostras por essa via, além de diminuir o efeito de primeira passagem dos compostos, evitando assim, a metabolização hepática e pela microbiota intestinal (consequência da via oral), antes que os compostos de interesse

chegassem à circulação sistêmica. De acordo com Mendes e Andersen (2011), a via i.p. pode ser utilizada para que um determinado efeito seja mais facilmente observado, já que as doses utilizadas por essa via costumam ser de três a cinco vezes mais ativas que pela via oral. Entretanto, também é possível que sejam mais tóxicas por esta via, lembrando que com a administração oral, a amostra está sujeita à metabolização pelo trato gastrintestinal, e alguns constituintes podem não ser absorvidos. Apesar disso, foi avaliado também a via oral para efeito comparativo com as respostas alcançadas via administração i.p..

O dispersante Tween-80® (polissorbato-80) foi utilizado na preparação

das amostras, pois de acordo com Farnswonth (1982) uma solução de Tween-

80® a 0,4%, injetada i.p., no volume de 0,5mL/camundongo/dia durante 30 dias,

não causou morte dos animais; assim como injetado 1mL/camundongo/3hs por um dia também não gerou mortes. Desse modo, após a pesagem das amostras em estudo, adiciona-se o agente dispersante de maneira que a concentração final do mesmo ficasse entre 0,5 a 1%. (Corrêa et al, 2011). Nos experimentos desse trabalho foram utilizados como veículo a salina 0,9% juntamente com o

dispersante Tween-80® para preparação das amostras.

O 5-FU (5-fluoruracil) foi escolhido como controle positivo sendo um dos mais comuns agentes quimioterápicos utilizados na prática oncológica além de estar associado ao quadro de mucosite, que pode motivar a interrupção do tratamento (Stringer et al, 2009). Apesar desse agente promover mucosite oral nos animais, dificultando a alimentação e representar uma das causas de perda de peso do grupo tratado, não foram observadas perdas de peso dos animais nos experimentos anticâncer tratados com amostras testadas. As fêmeas Balb-c ganharam peso muito lentamente, e em 15 dias de experimento, não foi tempo representativo suficiente para esse parâmetro de comparação. Vendramini-Costa et al, (2010) também demonstraram que grupos de animais tratados com 5-FU não apresentaram sinais de toxicidade ou expressiva perda de peso.

Diferentes esquemas terapêuticos foram utilizados na tentativa de inibir o tumor de Ehrlich após inoculação. O interesse de identificar as menores dosagens das amostras que pudessem promover redução tumoral determinou que o primeiro ensaio (figura 26) fosse realizado com as menores doses avaliadas em todo o projeto, utilizando extrato bruto (100 e 300mg/kg) e a fração de lactonas (Lac-FR 30, 50 e 70mg/kg). As duas doses de extrato bruto avaliadas não demonstraram efetividade no controle do tumor. No 15º dia, a dose de 100mg/kg (EB) demonstrou redução de 15,15% quando avaliada pelo pletismômetro, contrário a medida do peso das patas (0,34±0,036) comparado ao grupo veículo (0,34± 0,038). Da mesma forma não ocorreu redução significativa dos tumores com as três doses de Lac-FR avaliadas em ambos recursos de quantificação. A evolução dos tumores foi próxima a do grupo veículo, com exceção do grupo Lac-FR (50mg/kg) que demonstrou inibição de 8,48% quando medido no pletismômetro, sem apresentar correlação com o

peso das patas (0,36±0,030) em comparação ao veículo (0,34±0,038).

Um segundo ensaio (figura 27) foi realizado com amostras de extrato bruto (500 e 700mg/kg) e fração de lactonas (Lac-FR 100, 200 e 300mg/kg), em doses superiores as do experimento anterior. Os resultados desse ensaio foram obtidos com uso do paquímetro, considerando que o pletismômetro foi danificado nesse período. No 10º dia de avaliação, o grupo que recebeu extrato bruto (700mg/kg) demonstrou redução de 18,75%. Quando avaliado no 15º dia, não constatou-se diferença do volume tumoral comparado ao veículo em nenhum dos recursos de avaliação utilizados (paquímetro ou peso). Os três

grupos que receberam a amostra Lac-FR (100mg/kg - 0,33±0,04; 200mg/kg –

0,35±0,04; 300mg/kg – 0,36±0,033) demonstraram evolução de crescimento

próximo ao grupo veículo (0,34±0,038).

No terceiro experimento proposto (figura 28) com avaliação pelo pletismômetro, doses maiores da Lac-FR (500, 600, 700 e 800mg/kg) foram avaliadas. Na terceira dose administrada nos grupos (6º dia), ocorreram óbitos de animais pela possibilidade de toxicidade da amostra e/ou associada à condição do animal, com desenvolvimento tumoral. De acordo com os resultados do quadro 1 que demonstra os sinais de toxicidade aguda, doses

acima de 300 mg/kg i.p. promovem letargia e a dose de 500mg/kg i.p. promoveu letargia com recuperação em 30 minutos.

Dentre os grupos avaliados, três animais dos grupos compostos por seis camundongos que receberam 800, 700 e 500mg/kg, vieram a óbito após aproximadamente 1 hora de administração da terceira dose. O mesmo não ocorreu com o grupo que recebeu 600mg/kg, permanecendo até o 15º dia com o grupo intacto de animais (n=6). Não foram observados sinais de toxicidade anteriores que justificassem a interrupção dos tratamentos para os ensaios até a data da terceira dose. A toxicidade seguida de óbito não foi dose-dependente ainda não podendo excluir a possibilidade do grupo que recebeu 600mg/kg apresentar maior resistência aos tratamentos.

Não foi possível identificar uma clara correlação dose-toxicidade, pois um dos grupos com dose intermediária (600mg/kg Lac-FR) não mostrou o mesmo perfil de resistência comparado aos outros grupos. No entanto, esse experimento forneceu indícios de que doses acima de 500mg/kg administradas a cada 3 dias, geram toxicidade grave seguida de óbito em alguns animais, possivelmente mais sensíveis aos efeitos da amostra. Como não foi possível prever esses efeitos em ensaios de toxicidade aguda em que os animais recebem apenas uma dose única das amostras, nenhuma outra dose foi administrada nesse experimento por questões éticas; os animais foram monitorados até o 15º dia de experimento para extração e pesagem das patas.

De acordo com a avaliação pelo pletismômetro, ainda nesse ensaio 3, não ocorreu inibição tumoral de acordo com os resultados observados (figura 28). No entanto, pela avaliação do peso das patas foi possível identificar redução do tumor nas doses de 800, 600 e 500mg/kg de 10,69% (n=3), 9,25% (n=6) e 26,52% (n=3), respectivamente. A avaliação com o pletismômetro (deslocamento de volume) está sujeita a maiores variações na obtenção dos valores comparada a pesagem das patas (g) no último de dia de experimento. Apesar de o equipamento ser calibrado em todo início de avaliação, é possível movimentação do animal, mesmo que imobilizado, e a movimentação do operador podem contribuir para obtenção de resultados falso-negativos ou

falso-positivos. Com a extração padronizada e pesagem das patas, têm-se uma maior segurança da obtenção do volume tumoral (pela diferença de peso das patas), evitando-se toda a interferência da obtenção das medidas com o animal vivo.

Sabendo que as neoplasias elevam as taxas de mortalidade e as

reações adversas de tratamentos quimioterápicos aumentam os dados de toxicidade obtidos durante os experimentos, essas informações são de relevância clínica para o conhecimento do perfil farmacológico das amostras em teste (Machado et al, 2008). Nos ensaios propostos neste trabalho o ajuste da dose durante o experimento poderia ter sido uma alternativa para manter os animais vivos até o última dia de tratamento, evitando as mortes dos animais pela toxicidade das amostras e/ou pela condição clínica do animal de acordo com a evolução do tumor. Com exceção do ensaio 3, devido às mortes dos animais após a terceira dose, todas as doses e a frequência dos tratamentos propostos como esquema terapêutico foram mantidos nos outros ensaios, já que não foram observados sinais e ou morte por toxicidade.

Dois compostos isolados da A. annua também foram avaliados nesse modelo. A artemisinina no ensaio 4 (figura 29) foi avaliada em diferentes dosagens (10, 30, 70 e 100mg/kg). A dose mais representativa de 100mg/kg reduziu em 58,20% quando avaliado pelo pletismômetro e 67,39% quando medido o peso das patas.

A artemisinina possui baixa solubilidade em água ou óleo, pobre biodisponibilidade e meia vida curta in vivo (aproximadamente 2,5h) (Ashton et

al, 1998; Ulrika et al, 1999; Li et al, 2007; Crespo-Ortiz; Wei, 2012). Weathers

et al (2014) demonstrou que a artemisinina apresentou concentração máxima

(Cmax) de 4,33 mg L−1 e o tempo máximo (Tmax) de 60 minutos em estudo

farmacinético da Artemisia annua L. v.o., equivalente a 100mg/kg de artemisinina, administrada em camundongos.

Tal como muitas outras drogas, a artemisinina é metabolizada no fígado pelo citocromo P450 incluindo a CYP2B6 e CYP3A4 (Svensson e Ashton,

1999), dando origem a uma série de compostos incluindo deoxiartemisinina, deoxidi-idroartemisinina, 9,10-di-hidrodeoxiartemisinina, e um metabólito denominado cristal 7 encontrado na urina humana (Lee e Hufford, 1990; Weathers et al, 2014). Em estudo realizado por Weathers et al, (2014) foi demonstrado que animais que recebaram amostras de Artemisia annua L. v.o. equivalente a 100mg/kg de artemisinina, esta se converte em deoxiartemisinina no processo de biotransformação hepática (Figura 59).

Cada um desses produtos de degradação não possuem a porção de

endoperóxido presente na artemisinina, consequentemente são,

terapeuticamente inativos no controle do Plasmodium (Lee e Hufford, 1990). Ao contrário do seu metabolismo em camundongos saudáveis (Figura 59) o metabolismo de artemisinina para deoxiartemisinina pareceu ser suprimido em

camundongos infectados; a infecção retardou a capacidade de

biotransformação em deoxiartemisinina da artemisinina durante o período de estudo de duas horas. Em geral, as concentrações de artemisinina diminuem com um aumento concomitante nos níveis deoxiartemisinina, mas apenas em indivíduos saudáveis. Em contraste, em camundongos infectados, os níveis de artemisinina continuaram a aumentar ao longo do período de estudo, enquanto o nível deoxiartemisinina caiu e, em seguida, manteve-se constante (Weathers et.al, 2014).

O segundo composto avaliado foi a deoxiartemisinina (30, 70 e 100mg/kg) no 5º experimento (figura 30). Para os grupos tratados com deoxiartemisinina, o pletismômetro mostrou redução de 41,45% (100mg/kg), 26,23% (70mg/kg) e 21,33% (30mg/kg), enquanto os resultados de redução dos pesos das patas foi de 26,13% (100mg/kg), 23,61% (70mg/kg) e 6,33% (30mg/kg), respectivamente.

Nos estudos envolvendo a artemisinina, atribui-se sua atividade esquizonticida (malária) e anti-câncer ao seu grupo endoperóxido (Crespo-Ortiz e Wei, 2012). Essa ação anti-câncer baseia-se na clivagem mediada pelo ferro do grupamento endoperóxido, resultando na formação de espécies reativas de

oxigênio (ROS) (Efferth e Oesch, 2004; Efferth 2006) e/ou radicais alquilantes de carbono que destroem as células tumorais (Mercer et al, 2007, 2011).

Já a deoxiartemisinina não apresenta em sua estrutura esse grupo funcional (grupamento endoperóxido) e mesmo assim contribui no controle tumoral. Desse modo, outro mecanismo de ação pode estar envolvido para promover a atividade anticâncer, possivelmente envolvendo mecanismos de controle da inflamação. Vários estudos tem demonstrado essa relação entre o câncer e a inflamação (Vendramini-Costa 2012). Os dados epidemiológicos indicam que mais de 25% de todos os cânceres estão relacionados a infecções crônicas e outros tipos de inflamação (Schetter et al, 2010; Vendramini-Costa 2012).

Figura 59 – Gráficos comparativos demonstrando a biotransformação da artemisinina em deoxiartemisinina em camundongos saudáveis.

Fonte: Weathers et al, 2014

Foi demonstrado nos testes de edema de orelha com tratamento tópico o controle da inflamação promovido pela fração Lac-FR (figura 56) e sua significativa redução da atividade de mieloperoxidase (figura 57). O edema de orelha foi controlado de modo mais significativo pela via i.p., comparado com a via tópica, com as amostras de Lac-FR, artemisinina e deoxiartemisinina, reforçando o potencial anti-inflamatório dessas lactonas (Figura 58).

Baseados nos experimentos realizados por Dias (1997) em que foi utilizado a dose máxima de 500mg/kg da fração de lactonas sesquiterpênicas pela via oral para controle de úlcera induzida por indometacina (inibição das lesões ulcerativas em 47,1%), buscou-se no ensaio 6 (figura 31), avaliar diferentes doses da Lac-FR v.o. que pudessem inibir o tumor de Ehrlich na forma ascítica.

Para o 6º experimento (figura 31) determinou-se doses menores de 500mg/kg, inicialmente, administrando 100, 200 e 400mg/kg em dois esquemas terapêuticos diferentes, em que 3 grupos (n=6) foram tratados todos os dias e outros 3 grupos (n=6) com as mesmas doses foram tratados a cada dois dias após a inoculação. A pesagem inicial e final dos animais mostrou que nas doses testadas, não houve perda de peso significativo nos grupos tratados em ambos os esquemas terapêuticos. A perda de peso ocorreu apenas com o controle positivo 5-FU, devido à indução de mucosite induzida pelo quimioterápico no trato gastrintestinal, dificultando a alimentação. Com o uso da técnica de citometria de fluxo que avalia a densidade celular/µL, observou- se que os resultados dos grupos tratados diariamente mostraram redução da densidade celular de 40,44% para 200mg/kg e para os grupos tratados a cada dois dias a melhor reposta também ocorreu com a dose de 200mg/kg (29,43%), tendo a via oral demonstrado capacidade de diminuição do tumor no modelo ascítico avaliado.

O 7º ensaio (figura 32, 33) proposto com um novo esquema terapêutico, os grupos receberam 2 doses das amostras avaliadas, dois dias antes (pré- tratamento) da inoculação das células de Ehrlich. O extrato bruto (1.500mg/kg i.p. – pré tratamento) foi avaliado como dose máxima e não promoveu redução

tumoral. Os animais que receberam esse tratamento, apenas com essa dosagem de extrato bruto apresentaram letargia observada com uso da Lac-FR e deoxiartemisinina, com recuperação em 30 minutos e ptose com recuperação em 20 minutos. Considerando a alta dosagem utilizada, não foram realizados outros testes com extrato bruto.

A Lac-FR avaliada como pré-tratamento (700mg/kg) via oral, promoveu redução tumoral de 50,49% no 15º dia medido pelo pletismometro e redução de 24,47% pelo peso tumoral. Durante o experimento foi possível acompanhar o controle do tumor a partir do 6º dia que mostrou-se com valores de inibição de 68,91% e no 10º dia 64,43% (paquímetro). Esses resultados sugerem que a amostra por v.o. além de ter promovido melhor resultado com o pré- tratamento, contribuiu no controle do crescimento tumoral. Esse efeito pode estar associado a ação da artemisinina, por apresentar ação anticâncer isoladamente, além do seu produto de metabolização, a deoxiartemisinina, ter contribuído na atividade anticâncer; foram também demonstrados os efeitos anti-inflamatórios desses compostos nos ensaios de edema de orelha que podem estar envolvidos no controle tumoral (figura 55 e 57).

Com o uso da fração Lac-FR (700mg/kg) por v.o. como pré-tratamento, nesse trabalho foi possível observar uma melhor resposta comparada ao tratamento v.o. após a inoculação, assim como comparado com os tratamentos pela via i.p.. Essa atividade positiva observada pode ter ocorrido devido à ação da artemisinina, deoxiartemisinina ou outra lactona sesquiterpênica presente na fração Lac-FR, além da deoxiartemisinina ser um metabólito ativo da artemisinina após biotransformação para atividade anticâncer como descrito anteriormente.

Apesar de o pré e pós-tratamento com a fração (400mg/kg i.p.) terem mostrado um controle do tumor no último dia de experimento (pré-tratamento 0,016±0,003; pós-tratamento 0,014±0,002) em relação ao veículo (0,02±0,003), o peso tumoral das patas não corroboram esses dados.

Os fármacos, normalmente, tem que atravessar barreiras da membrana lipídica não polar a fim de alcançar seus sítios de ação. Conforme a natureza polar do fármaco aumenta, usualmente, torna-se mais difícil para o composto atravessar estas barreiras. Na maioria dos casos, fármacos cujas estruturas contêm grupamentos carregados não conseguem atravessar estas membranas apolares (Corrêa et al, 2011).

A atividade de um fármaco está relacionada à sua biodisponibilidade, que é definida como a fração da dose de um dado fármaco detectada na circulação sistêmica. Além disso, para que um fármaco seja efetivo, ele deve permanecer estável por tempo suficiente após a administração, para que quantidades suficientes dele alcancem os receptores e consequentemente a resposta farmacológica investigada. Dentre as estratégias para aumentar a estabilidade in situ de um fármaco têm-se a modificação estrutural, administração na forma de um pró-fármaco, mais estável, e ainda, a utilização da forma farmacêutica mais adequada (Corrêa et al, 2011).

Os resultados apresentados com as amostras obtidas a partir da

Artemisina annua L. mostraram nos modelos de câncer que a fração de

lactonas sesquiterpênicas (Lac-FR) (200mg/kg) via oral mostrou ser uma alternativa eficaz para controle do tumor ascítico de Ehrlich tanto no tratamento diário como em dias alternados. A artemisinina (100mg/kg i.p.) mostrou sua atividade no controle do tumor sólido de Ehrlich confirmando suas propriedades antitumorais descritas na literatura. O composto deoxiartemisinina (100mg/kg i.p.) de forma semelhante apresentou atividade inibitória tumoral significativa no mesmo modelo, mostrando que mesmo com ausência do grupamento endoperóxido em sua estrutura, a atividade anticâncer pode ser explorada assim como a compreensão do seu mecanismo de ação.

Os tumores sólidos apresentam estruturas complexas e heterogêneas e um microambiente composto por células tumorais e do estroma, cercadas por uma matriz extracelular e uma rede vascular. Muito utilizado na oncologia experimental, o tumor de Ehrlich (tumor murino) é transplantável, originado de um adenocarcinoma mamário de crescimento rápido e agressivo, que gera

uma resposta inflamatória local caracterizada pelo aumento da permeabilidade vascular, formação de edema e migração celular, relacionado com a imunidade inata, especialmente a resposta inflamatória (Bergami-Santos et al, 2004; Nascimento et al, 2006; Vendramini-Costa et al, 2010).

O excesso de produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, citocinas inflamatórias e expressão de quimiocinas, aumento da ciclo- oxigenase-2 (COX-2) e fator nuclear kappa B (NFkB), representam alguns dos fatores que contribuem para a carcinogênese induzida por inflamação. A inflamação pode alterar a expressão de oncogenes e genes supressores de tumor (incluindo tanto proteínas de codificação de genes e genes micro-RNAs não codificantes) para promover a transformação neoplásica (Schetter et al , 2010).

As prostaglandinas (derivadas da ação das cicloxigenases) e

leucotrienos (derivados da via mediada pela lipo-oxigenase) são promotores de

crescimento tumorais devido ao seu papel na relação entre as células tumorais e o estroma, estabelecendo um microambiente que facilita a angiogênese e evita o ataque do sistema imunológico. Além disso, modulam a proliferação, diferenciação tumoral, apoptose e interferem na migração e invasividade das células tumorais (Vendramini-Costa et al, 2010).

Há um aumento significativo nos níveis de PGE2 após o inóculo das

células tumorais de Ehrlich igualmente aumentadas em casos de tumores malignos em geral (Salgado Oloris et al, 2002). A COX-2 encontra-se superexpressada em muitos tipos de câncer. Seus produtos estão relacionados à angiogênese e metástase em diferentes níveis, além de terem papel na supressão da resposta imune local no ambiente tumoral e na apoptose (Vendramini-Costa e Carvalho, 2012).

Os leucotrienos modulam a proliferação, diferenciação do tumor,

apoptose e interferem com a migração e invasão das células tumorais. No microambiente tumoral, células do sistema imunológico e endotélio são recrutadas para produzir mais mediadores pró-inflamatórios incluindo

eicosanóides, fatores de crescimento e angiogênicos (Vendramini-Costa et al, 2010).

Utilizando fármacos anti-inflamatórios, pode-se desenvolver estratégias de quimioprevenção para reduzir a incidência de câncer. A manipulação da inflamação local que circunda os tumores também pode constituir uma opção terapêutica (Schetter et al, 2010). A utilização prolongada de AINEs (anti- inflamatórios não esteroidais) tem sido associada com redução do risco de desenvolvimento de vários tipos de cânceres. Alguns ensaios clínicos randomizados têm demonstrado que os AINEs têm ação protetora contra câncer de cólon, mama, próstata e pulmão (Schetter et al, 2010; Wang &

Dubois, 2010; Vendramini-Costa e Carvalho, 2012).

Diante da relação entre câncer e inflamação descrita na literatura e frente as alterações comportamentais (letargia) apresentadas pelos animais nos testes de toxicidade aguda, além da observação desse comportamento após administração das amostras de Lac-FR e deoxiartemisinina nos ensaios anticâncer, despertou-se o interesse em investigar se essas amostras podiam promover atividade antinociceptiva e anti-inflamatória. A artemisinina também foi avaliada nos testes propostos mesmo não apresentando essas mesmas alterações comportamentais.