Atividade Antinociceptiva e Anti-inflamatória – in vivo

O interesse de avaliar essa fração e esses princípios ativos, se deu pelo grande número de compostos pertencentes à essa classe química e sua relação com possíveis atividades anti-inflamatórias descritas anteriormente em outros modelos experimentais (Chaturvedi, 2011).

Durante as últimas três décadas, as lactonas sesquiterpênicas têm sido apontadas como um dos maiores grupos de produtos vegetais que têm uma ampla gama de atividades biológicas, tais como a anti-inflamatória. O gênero

e o efeito anti-inflamatório significativo de algumas lactonas isoladas tem sido relatado (Chadwick et al, 2013; Favero et al, 2014).

De acordo com Chadwick et al, (2013) e Chaturvedi (2011), as lactonas sesquiterpênicas da família Asteraceae, podem desempenhar um papel muito significativo na saúde humana, tanto como parte de uma dieta equilibrada, como de agentes farmacêuticos. Elas são descritas como constituintes ativos de uma variedade de plantas medicinais utilizadas na medicina tradicional, devido à grande variedade de atividades biológicas e farmacológicas, tais como

antimicrobianos, citotóxicos, anti-inflamatória, antiviral, antibacteriana,

antifúngica, efeitos sobre os sistemas nervoso central e cardiovascular além de potencial antialérgico.

Na avaliação da toxicidade aguda utilizando camundongos Swiss machos e ratos Wistar machos, as doses de Lac-FR de 30, 75, 100, e 300mg/kg, não mostraram efeitos tóxicos significativos. A dose de 300mg/kg da fração promoveu letargia com recuperação em 15 minutos sendo utilizada nos ensaios propostos também como parâmetros de comparação com a dose de 100mg/kg (Favero et al, 2014).

Previamente a avaliação do efeito antinociceptivo da Lac-FR, nesse trabalho foram realizados os testes de contorção abdominal (figura 34), que definiu a via i.p. para continuidade dos ensaios nos testes de campo aberto, rota-rod, formalina, alodínia induzida por CFA e o teste retirada de cauda pela mesma via (Favero et al, 2014). O edema de pata foi empregado para identificar uma possível propriedade anti-inflamatória da amostra Lac-FR, assim como o teste de edema de orelha (i.p e v.o.). Os testes de retirada de cauda para avaliar o envolvimento do controle da dor pelo sistema nervoso central e também para identificar se a amostra atuava em receptores opióides com o uso da naloxona também complementaram os ensaios envolvendo nocicepção.

Os resultados do teste de contorção abdominal (figura 34) mostraram que a via intraperitoneal foi a mais eficaz na resposta antinociceptiva em

ambas as doses testadas (100 e 300mg/kg) comparada com a via oral. Diante disso, para os ensaios posteriores foi utilizada a via intraperitoneal. Observou- se que ambas as doses de Lac-FR i.p. testadas foram superiores à indometacina (i.p.) na redução das contorções.

A dor induzida por ácido acético (teste de contorção abdominal) é uma avaliação de triagem para a identificação de amostras com possível efeito antinociceptivo ou anti-inflamatório. O ácido acético atua indiretamente por induzir a liberação de mediadores endógenos (prostaglandinas e aminas simpatomiméticas) que estimulam os neurônios nociceptivos. A liberação desses mediadores é secundária à liberação de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNFα (fator de necrose tumoral alfa), IL-1β (interleucina 1-beta) e IL-8 (interleucina oito), o que demonstra a relação entre as vias inflamatórias e nociceptivas (Ribeiro et al, 2000; Spindola et al, 2012; Favero et al, 2014).

A transmissão da dor inflamatória envolve, principalmente, receptores polimodais periféricos ao redor de pequenos vasos, que sinalizam para o SNC, via fibras sensoriais aferentes C e entram no corno dorsal. No entanto, o método químico tem boa sensibilidade, mas baixa especificidade, permitindo fraca interpretação dos resultados, pois este é um estímulo inespecífico para nocicepção, sensível os compostos com diferentes mecanismos. Esse problema pode ser evitado pela complementação com outros modelos de nocicepção (Collier, 1968; Kumazawa, 1996; Spindola et al, 2012; Favero et al, 2014). A maior parte dos agentes testados com esse protocolo gera alguma alteração no número de contorções. Desse modo não é possível concluir definitivamente sobre as ações antinociceptivas apenas baseado nesse modelo isolado (Quintão et al, 2011).

A contorção abdominal por ácido acético é um ensaio de estímulo conveniente para triagem, devido também à intensidade de resposta que

depende da interação de vários fatores, neurotransmissores e

neuromoduladores que determinam a nocicepção, como as cininas, acetilcolina, substância P e prostaglandinas. Assim, este modelo é sensível a substâncias analgésicas com os mais variados mecanismos de ação, sendo

sensível a fármacos com atividade analgésica tais o ácido acetil salicílico, antagonistas do receptor da cininas (bradicinina, calidina ou T-cinina) e analgésicos opióides de ação central ou periférica (Spindola et al, 2010; Favero et al, 2014).

O teste de campo aberto (figura 35) foi realizado a fim de excluir a possibilidade de que o efeito antinociceptivo pudesse estar relacionado com alterações não-específicas na atividade locomotora dos animais (Spindola et al, 2010). Acredita-se que os resultados desses efeitos sejam devido a uma ativação do cérebro, que se manifesta como uma excitação de neurônios centrais e um aumento no metabolismo cerebral (Calabresi et al, 2000; Spindola et al, 2012; Favero et al, 2014).

Como determinados fármacos agem centralmente, tendo o efeito de reduzir o tônus basal dos músculos sem afetar muito sua capacidade de se contrair transitoriamente sob controle voluntário (Rang et al, 2003), não foi possível nessa etapa da investigação determinar o possível efeito da Lac-FR como um relaxante muscular via Sistema Nervoso Central, ou apenas, uma diminuição da área explorada pelo efeito central, sem envolvimento muscular. Desse modo, as curvas dose-resposta foram realizadas em diferentes doses para determinar o efeito farmacológico da fração nos subsequêntes ensaios propostos.

Os resultados do teste de campo aberto (figura 35) mostraram diminuição das áreas exploradas em 53,25% com a dose de 300mg/kg da Lac- FR em relação ao grupo veículo, comparado à diminuição causada pelo pentobarbital (81,48%). Os resultados também mostraram que a dose de 100mg/kg (i.p.) não promoveu interferência significativa na atividade locomotora dos animais, com redução de 7,28% comparada ao grupo veículo (Favero et al, 2014). Nessa avaliação o animal não recebeu nenhum estímulo para se locomover, sendo necessária a investigação de um teste que promovesse esse estímulo a fim de identificar possíveis compromentimentos na força muscular e na coordenação motora.

O teste de rota-rod (figura 37), realizado na sequência ao teste de campo aberto, demonstrou que os animais sob estímulo da rotação por 120 segundos não sofreram comprometimento da coordenação motora e da força muscular. Desse modo, o teste reforçou a possibilidade do uso da dose de 300mg/kg da Lac-FR nos experimentos posteriores.

O modelo da formalina é um dos testes mais utilizados para avaliação de respostas nociceptivas claramente bifásicas (Quintão et al, 2011). A dor neurogênica (fase 1) é causada pela ativação direta dos terminais nervosos nociceptivos, enquanto que a dor inflamatória (fase 2) é mediada por uma combinação do acesso periférico e sensibilização da medula espinal. A formalina produz aumentos significativos nos níveis espinhais de diferentes mediadores relacionados tanto com a dor neurogênica (aminoácidos, cininas) e vias inflamatórias (prostaglandinas, leucotrienos) (Santos et al, 2005; Spindola et al, 2012; Favero et al, 2014).

Os resultados apresentados (figura 37 – Fase 1 e figura 38 – Fase 2)

são consistentes para sugerir a atividade antinociceptiva da Lac-FR tanto na fase aguda pela ativação direta de nociceptores e também na fase tardia, representada pelo controle da dor inflamatória. Nos primeiros 5 minutos (fase 1) uma diminuição significativa foi observada para 100 e 300 mg/kg da Lac-FR em comparação com a morfina (10 mg/kg, i.p.), controle positivo. Estes resultados sugerem que a atividade da amostra pode estar relacionada com a dessensibilização do receptor sensível ao estímulo químico. A segunda fase, também demonstrou uma significativa redução do tempo de reação sugerindo que Lac-FR tem um mecanismo de ação que age tanto através de mediadores neurogênicos como por mediadores inflamatórios, tais como prostaglandinas e leucotrienos (Santos et al, 2005; Favero et al, 2014). Faz-se necessário investigar posteriormente à esses resultados, quais as possíveis vias esses compostos presentes na fração controlam essa resposta.

Avaliou-se também o efeito anti-alodínico (figura 39) como um modelo de nocicepção. A dor persistente causada pela injeção intraplantar de CFA envolve a sensibilização central, devido à liberação de vários mediadores

inflamatórios que aumentam a sensibilidade do sistema nervoso periférico aferente e central após o agente causador da injúria (Samad et al, 2001; Spindola et al, 2011; Favero et al, 2014). A entrada de informações sensoriais de nociceptores no corno dorsal, altera consideravelmente o nível de atividade dentro do cordão de ambos os sistemas excitatórios e inibitórios, podendo invadir a atividade neuronal medular. Esta é a base da hipersensibilidade central, que resulta no aumento da capacidade de resposta dos neurônios do corno dorsal, muitas vezes observada em estados inflamatórios e na dor neuropática (Suzuki e Dickenson, 2005; Spíndola et al, 2011; Favero et al, 2014).

Os resultados do teste de alodínia demonstraram que nas três doses avaliadas, houve redução dos efeitos anti-alodínicos em 4 horas (fase aguda) nas doses de 30mg/kg (40,93%), 100mg/kg (59,73%) e 300mg/kg (65,10%). Em 24 horas (fase sub-aguda) as reduções dos índices foram de 30,4%, 52,02% e 64,18%, respectivamente. Os diferentes componentes ativos da fração, assim como os produtos de metabólitos ativos desses compostos podem ter mantido o efeito anti-alodínico observado até 24 h posterior ao ensaio.

A hipernocicepção induzida por injeção intraplantar da carragenina (figura 40) é um modelo utilizado para investigar hiperalgesia inflamatória e comumente utilizado para avaliar o efeito de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) (Mazzon et al, 2011; Spindola et al, 2011; Favero et al, 2014). A carragenina promove uma característica de resposta muito inflamatória e nociceptiva, que é mediado por diversos grupos de substâncias endógenas que estimulam nociceptores quimiossensíveis, desempenhando assim um papel importante no desenvolvimento da dor inflamatória (Posadas et al, 2004; Spindola et al, 2011; Favero et al, 2014).

Esse método tem sido amplamente utilizado como um modelo para avaliação de inflamação aguda (Winter, 1962) e por produzir edema, sensibilização mecânica e aumento da pata, logo após a inoculação, foi empregado como parâmetro de avaliação (Quintão et al, 2011). Os sinais

cardinais da inflamação como edema, hiperalgesia e eritema, são resultados da ação de agentes pró-inflamatórios como a bradicinina, histamina, taquicininas, espécies do sistema complemento e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Morris, 2003).

A primeira fase do teste se inicia imediatamente após o inóculo da carragenina e permanece até a 6ª hora. Após esse período a fase tardia ocorre entre 48 e 72 horas (Posadas et al, 2004; Nunes et al, 2007). Não há expressão de prostaglandinas na primeira hora, ocorrendo liberação de histamina, serotonina e bradicinina, não apresentando boa efetividade anti- inflamatória com o uso de AINEs (Mazzon et al, 2018). Nessas seis primeiras horas há a participação de serotonina, PLA2 (fosfolipase A2), histamina, cininas, metabólitos derivados de ácido araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos) e óxido nítrico (NO), enquanto que os mediadores na fase tardia promovem edema dependente da mobilização de neutrófilos, aumento da expressão de COX-2, diminuição da produção de NO, com migração de monócitos e macrógafos (Fröde et al, 2001; Nunes et al, 2007; Pedernera et al, 2010)

De acordo com os resultados (figura 40), as amostras de Lac-FR em 2 horas reduziram o edema de pata em 40,57% (100mg/kg) e 75,36% (300mg/kg), tendo esse efeito antiedematoso confirmado pelos testes de edema de orelha em que a Lac-FR foi eficaz por via tópica (figura 55) e intraperitoneal (figura 57). A inibição promovida pela fração Lac-FR no edema de pata nas fases iniciais da inflamação (até a 6ª hora) mostrou que a amostra controlou os mediadores envolvidos nesse período, sendo esses mediadores fundamentais para a manutenção do processo inflamatório e relacionados com o aumento da permeabilidade vascular e o extravazamento de líquidos para o plasma, processos que contribuem para a ativação da resposta celular e migração neutrofílicas aos sítios de inflamação.

O teste de retirada da cauda (figura 41) foi utilizado para mostrar o

possível envolvimento da Lac-FR com a atividade no sistema nervoso central no controle da dor por estímulo térmico. Foi calculado o MPE (máximo efeito

possível %), ou seja, o índice de antinocicepção, respeitando a individualidade na resposta pelo controle da dor termicamente induzida de cada animal, quando foram obtidas as medidas basais pelo prévio cáculo da MEP antes da administração da amostra (Favero et al, 2014).

Considerando-se a atividade da amostra Lac-FR demonstrada na fase 1 do teste de formalina, que mostrou uma correlação com dor neurogênica, o modelo de retirada de cauda foi empregado para verificar se a amostra tinha a capacidade de reduzir a dor por estímulo térmico (figura 42). Ambas amostras (100 e 300mg/kg ip) e morfina (5mg/kg i.p.) demonstraram efeitos próximos depois de decorrido uma hora. Após esse período, a amostra Lac-FR (300mg/kg) manteve o mesmo índice de antinocicepção até a 4ª hora de experimento. Esses achados sugerem que a amostra controla a dor por via antinociceptiva periférica e também pelo sistema nervoso central. Além disso, empregando o mesmo modelo de experimento, com a dose de 100mg/kg associado ao tratamento prévio de naloxona (s.c.) (figura 42) foi possível mostrar que a Lac-FR atua em receptores opióides como a morfina, pois o antagonista opióide reverteu a nocicepção promovida pela amostra (Favero et al, 2014).

Sabendo previamente que a meia-vida da artemisinina, um dos componentes da amostra Lac-FR, é de aproximadamente 2,5h (Ashton et al,

1998; Ulrika et al, 1999; Li et al, 2007; Crespo-Ortiz; Wei, 2012), e que a meia

vida da naloxona é de aproximadamente 64 minutos (Ngai et al, 1976), os resultados mais representativos para avaliação do antagonismo promovido pela naloxona foi considerado entre 30 minutos e 1h, visto também que a Lac-FR (100mg/kg) mostrou seu maior índice de antinocicepção em 1h, sendo conclusivo o antagonismo determinado nesse tempo de experimento.

De acordo com Bremner e Heinrich (2002), a presença de lactonas sesquiterpênicas foi significativa na indução de uma potente atividade inibidora contra a óxido nítrico-sintase induzida (iNOS - induzida por citocinas e lipopolissacarÌdeos, no endotélio e musculatura lisa vascular). A classe mais amplamente publicada de produtos naturais citadas como inibidores de NF-ƙB

(fator nuclear kappa B) são os sesquiterpenos. A NF-ƙB é uma proteína que intermedia a resposta imune em humanos por meio do controle de resposta de outros mediadores como as citocinas e moléculas de adesão celular (Chatturverdi, 2011; Chadwick, 2013). O entendimento atual da cascata do NF- ƙB instiga os pesquisadores da área de produtos naturais a investigar os potenciais alvos das repostas observadas (Bremner e Heinrich, 2002; Favero et al, 2014).

Embora o mecanismo de ação exato de lactonas sesquiterpênicas não seja bem conhecido (Chaturvedi, 2011), alguns autores tem descrito diferentes caminhos para explicar o envolvimento desses metabólitos na atividade anti- inflamatória com diferentes modelos (Chadwick , 2013). Outras teorias sobre os efeitos anti-inflamatórios dessas lactonas incluem a ativação de p53 (proteína relacionada ao bloqueio do ciclo celular) e um aumento de espécies reativas de oxigênio com efeitos citotóxicos (Chadwick, 2013; Favero et al, 2014).

Devido à restrita quantidade dos compostos isolados deoxiartemisinina e artemisinina, foram propostos os testes de campo aberto, rota-rod, formalina, teste de retirada de cauda, edema de orelha e mieloperoxidase, e não foram realizados os testes de edema de pata e alodínia.

Os resultados do teste de campo aberto (figura 43) para a deoxiartemisinina mostraram diminuição das áreas exploradas para dose de 100mg/kg (3,67%) e 300mg/kg (99,59%) (figura 33). Com os valores obtidos foi determinado que a dose de 100mg/kg não comprometia de forma significativa o comportamento exploratório natural dos animais. Similarmente, o teste de rota- rod (figura 44) mostrou comprometimento da coordenação motora, da força muscular ou sedação após o estímulo das rotações em 30 e 60 minutos, com a maior dose de 300mg/kg. Desse modo, nos testes de formalina, retirada de

cauda e edema manteve-se como dose máxima 100mg/kg de

deoxiartemisinina.

O teste da formalina para fase 1 (figura 45) determinou que a deoxiartemisinina na dose de 100mg/kg controlou a dor neurogênica em

56,55%. Com esse resultado pode-se sugerir que esse composto esteja envolvido na resposta positiva mostrada no controle da dor (Fase 1) do teste da formalina quando administrada a Lac-FR. Da mesma forma, para a fase 2 (figura 46), a mesma dose diminuiu a dor inflamatória em 45,43% comparada ao grupo veículo indometacina.

Na avalição do teste de retirada de cauda (figura 47), em 0,5h a deoxiartemisinina mostrou aumento da MPE de 28,09% (30mg/kg) e 40,94% (100mg/kg). Em 1,5h uma melhor resposta foi alcançada com a dose de 100mg/kg, visto qua a MPE foi de 87,99%. Esses dados confirmam a hipótese de que o controle da dor pelo uso da deoxiartemisinina seja parcialmente promovido pelo envolvimento do SNC. Com o uso da naloxona (figura 48) não foi possível demonstrar o efeito antagônico via sistema opióide. Os resultados sugerem que deoxiartemisinina atua por outros mecanismos centrais no controle da dor, podendo ser explorados posteriormente.

Para a artemisinina na dose de 100mg/kg no teste de campo aberto (figura 49), não houve comprometimento significativo da atividade exploratória, similarmente com o teste de rota rod (figura 50). Desse modo, essa dose foi mantida nos testes subsequentes, não sendo avaliadas doses superiores a essa a fim de determinar um parâmetro comparativo com a deoxiartemisinina na mesma dose.

Na primeria fase (0-5min) do teste da formalina para artemisinina (figura 51), as três doses testadas não mostraram variações significativas no controle da dor pelo tempo de lambedura das patas (27,09% - 10mg/kg; 33,01% - 30mg/kg; 28,66% - 100mg/kg). A resposta não foi proporcional à dose administrada, no entanto mostrou ser um dos compostos responsáveis pelo controle da dor, quando comparado aos resultados observados na administração da Lac-FR. Na segunda fase do teste da formalina (figura 52) as diminuições no tempo de lambeduras das patas (24,45% - 10mg/kg; 26,63% - 30mg/kg; 33,35% - 100mg/kg artemisinina) não mostraram significância estatística, no entanto esse composto é uma lactona que contribui no processo

de controle da dor em fase inflamatória observado em comparação as repostas da Lac-FR.

Foi realizado o teste de retirada de cauda (figura 53) para artemisinina. Em 2h verificou-se o maior índice de antinocicepção (MPE) dentre os tempos analisados (17,60% - 10mg/kg; 30,3% - 30mg/kg; 23,31% - 100mg/kg). A dose intermediária contribuiu na melhor reposta antinociceptiva, mostrando sua contribuição no controle central da dor dentre os compostos que compõe a Lac- FR. Os efeitos da artemisinina baseados nesse ensaio e nos anteriores, sugerem que esse composto não atua de modo dose-dependente. Não foi confirmado com o uso da artemisinina o envolvimento no sistema opióide para controle da dor central, como ocorreu com a fração de lactonas (figura 54) sendo que outros mecanismos estão envolvidos nesse processo. A metabolização da artemisinina em deoxiartemisinina pode ter contribuído no controle central da dor de acordo com resultados mostrados anteriormente.

Os modelos de edema de orelha induzido por agentes irritantes permite identificar compostos com uma atividade anti-inflamatória, potencialmente útil no tratamento de doenças inflamatórias da pele, pois promovem condições que se assemelham a alguns tipos de dermatites observadas em humanos (Veras et al, 2013; Cai et al, 2014).

Nas inflamações geradas pelo óleo de cróton, em que há produção de edema e migração neutrofílica, os corticosteróides e inibidores da lipo- oxigenase (LOX) demonstraram uma melhor atividade na redução do edema da orelha, ao passo que os inibidores de ciclo-oxigenase (COX) e anti- histamínicos promoveram pouco ou nenhum efeito. O efeito pró-inflamatório em modelos de edema de orelha crônica pode ser explicado pelo aumento da 5- LOX, uma enzima chave na biotransformação do ácido araquidônico em hidroperóxidos de ácidos graxos, lipoxinas e os leucotrienos, com a potente capacidade quimioatrativa que induz a formação de espécies reativas de oxigênio (Veras et al, 2013; Cai et al, 2014).

O teste de edema de orelha (figura 55) para avaliação de atividade inflamatória foi realizado pela via tópica em um primeiro momento, seguido da avaliação da atividade de mieloperoxidase. Os resultados reforçaram a atividade anti-inflamatória da Lac-FR e a contribuição parcial da deoxiartemisinina nesse processo acompanhado, proporcionalmente, dos resultados de mieloperoxidase (figura 56).

A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima derivada de leucócitos que catalisa a formação de numerosas espécies reativas oxidantes. Além de integrantes da resposta imune inata, evidências tem comprovado a contribuição desses oxidantes para o dano tecidual durante a inflamação. O papel dos neutrófilos nos locais de lesão tecidual é bastante complexo, mas pode ser sumarizado pela ação de endocitose de material estranho e secreção de enzimas intracelulares, como elastase, endopeptidases e mieloperoxidase (MPO) (Roman et al, 2007).

A síntese de MPO ocorre durante a diferenciação mielóide na medula óssea e se completa dentro dos granulócitos previamente à sua entrada na circulação. Essa enzima é encontrada predominantemente em neutrófilos, monócitos e alguns subtipos de macrófagos teciduais. Representa mais de 5% do conteúdo protéico total da célula nos neutrófilos e 1% nos monócitos (Roman et al, 2007).

Os resultados mais representativos para atividade anti-inflamatória nesse modelo de edema foi com o uso da via intraperitoneal (figura 57). No entanto por problemas técnicos não foi possível quantificar a atividade da enzima com as amostras de orelhas edemaciadas. Desse modo, as amostras Lac-FR e os compostos isolados e administrados pela via i.p. foram efetivas no controle da inflamação, possivelmente atuando mais seletivamente pela via