Foram utilizados camundongos fêmeas das linhagens Balb/C, de 3 meses de idade, para realização do modelo murino do tumor sólido de Ehrlich, cujo protocolo experimental foi aceito pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA-Unicamp) sob número de protocolo 1810-1.
O tumor de Ehrlich foi mantido na forma ascítica através de repiques semanais em camundongos doadores. Semanalmente, o fluido ascítico era retirado de animais portadores desse tumor e imediatamente inoculado na cavidade peritoneal de animais receptores de mesma linhagem, para posteriormente atuarem como animais doadores das células de Ehrlich inoculadas na forma sólida (Figura 10). Após inoculação, os animais receptores eram mantidos em isoladores individuais devidamente identificados com água e ração ad libitum.
Figura 10: Manutenção das células do Tumor de Ehrlich, na forma ascítica, para posterior crescimento na forma sólida (adaptado de Ferreira, 2006).
O teste de tumor sólido de Ehrlich teve duração de 21 dias, com 7 animais (camundongos Balb/C fêmeas) por grupo, com as doses determinadas previamente a partir de testes de toxicidade. Foram inoculadas 2,5 x 106 células do Tumor Ehrlich no coxim plantar da pata posterior direita dos camundongos. O número de células tumorais para inoculação na forma sólida foi obtido através de contagem direta das células obtidas a partir do líquido ascítico, na câmara de Neubauer. O tratamento foi administrado por via intraperitoneal, a cada 3 dias, a partir do 3o dia após a inoculação das células.
20 Um grupo salina 0,9% foi utilizado como controle negativo (G1), um grupo doxorrubicina 3 mg/kg foi o controle positivo (G2), e outros 3 grupos foram tratados com a fração enriquecida de goiaba PG.(F2- F3).(F6-F9) nas doses de 10, 30 e 50mg/kg (G3, G4 e G5, respectivamente). No dia da inoculação das células (D0), a cada dia de tratamento (D3, D6, D9, D12, D15 e D18) e no dia do sacrifício (D21), foram analisados o peso dos animais e o volume do tumor (com auxílio de Pletismômetro Digital, WE7500, Panlab), assim como a taxa de sobrevivência de animais/grupo. Ao final do experimento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os órgãos coletados (cérebro, estômago, fígado, rim, coração, pulmão, baço, útero), assim como as patas afetadas pelo tumor, para avaliação macroscópica de sinais de toxicidade e avaliação de peso. A partir dos parâmetros avaliados durante os 21 dias de teste, foram feitas as seguintes avaliações: volume tumor/dia, peso bruto do tumor (peso animais/dia), peso relativo do tumor (peso tumor/peso animais). A variação de peso e diferenças no tamanho do tumor foram analisadas estatisticamente através do Teste de Duncan (p<0,05). A Figura 11 representa um esquema do modelo experimental seguido, com o dia de início do teste (D0), dias de tratamento (D3, D6, D9, D12, D15 e D18) e o dai de sacrifício (D21).
Figura 11: Esquema do modelo experimental in vivo utilizado no tumor sólido de Ehrlich.
Uma vez constatada a semelhança entre o efeito da fração ativa de goiaba PG.(F2-F3).(F6-F9) com o mecanismo de ação do tamoxifeno, repetiu-se o experimento de tumor sólido de Ehrlich, no mesmo esquema de tratamento apresentado na Figura 11, mas utilizando-se o tamoxifeno - além da doxorrubicina - como controle positivo. Estabeleceu-se os seguintes grupos experimentais: G1 = Controle negativo (veículo, salina), G2 = Controle positivo (doxorrubicina 3mg/kg), G3 = Controle positivo (tamoxifeno 10mg/kg), G4 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 10mg/kg, G5 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 30mg/kg, G6 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 10mg/kg + tamoxifeno, G7 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 30mg/kg + tamoxifeno.
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3. Metodologia de docking molecular in silico
Guajadial e psidial A foram utilizados como ligantes ao receptor de estrógeno α e β (ERα e ERβ,
respectivamente). A estrutura das moléculas de estradiol e do tamoxifeno foram obtidas a partir banco de dados Hetero-compound Information Centre Uppsala (Hic-up) e suas propriedades de ligação ao receptor foram utilizadas como controles para estudos in silico, uma vez que a interação destes com o receptor já é conhecida. A estrutura dos princípios ativos guajadial e psidial A foi obtida a partir do Cambrige
Crystallographic Data Centre (CCDC). Foram utilizadas as estruturas das isoformas ER-α e ER-β,
depositadas no Protein Data Bank (PDB), com código de acesso 2FJ9 e 3OLL, respectivamente.
O software Molegro Virtual Docker (MDV, Thosen and Christensen, 2006) foi empregado para as simulações de docking. Foi utilizado 0.30 Å como grid, 15 Å radius a partir do molde como sítio de ligação, MolDock SE as como algoritmo de busca. O processo foi repetido 10 vezes e o número máximo de interações ajustado para 1500. Após cada simulação de docking, minimização de energia e otimização de pontes de hidrogênio foram realizadas.
O algoritmo utilizado pelo MVD no docking molecular resulta em resultados cujos valores (scores) não são exatatamente os mesmos (Sivaprakasam et al., 2009). De maneira a aumentar a acurácia dos resultados, 10 simulações consecutivas foram conduzidas, e os maiores valores de score de cada simulação foram utilizados para calcular o score médio de cada ligante, em cada encaixe possível, sendo MolDock e Rerank tendo sido empregados para selecionar o melhor encaixe de cada ligante.
Para a análise da plausibilidade dos complexos gerados pelo MVD, estes foram submetidos a avaliação dos servidoresDrugScore (Velec et al., 2005) e PEARLS (Han et al, 2006). DrugScore avalia a distância interatômicas entre ligante-receptor e o score obtido é resultado da soma das interações entre o ligante e o receptor. PEARLS („Program for Energetic Analysis of Receptor-Ligand System‟) tem o cálculo baseado na energia de interação entre o ligante e o receptor considerando as ligações intermoleculares de Van der Walls, eletrostáticas e pontes de hidrogênio num campo de força AMBER. Os valores gerados por ambos os softwares foram utilizados para calcular a afinidade relativa. A energia de afinidade entre o estradiol e o receptor de estrógeno foi normalizada para 1 e os valores de score representam a afinidade de ligação predita para o composto em questão em relação ao estradiol, sendo um valor relativo e não absoluto.
Para todas as análises foram realizadas 10 corridas nos respectivos programas, e utilizou-se como score dos complexos a média entre tais corridas. O complexo ligante-receptor tido como correto foi
22 aquele que apresentava menor energia de formação, ou seja, de conformação mais favorável. A Figura 12 apresenta de forma esquematizada a técnica de docking molecular.
Figura 12: Representação esquemática da técnica de docking molecular. Moléculas provenientes de um banco de dados são testadas em determinado sítio de ligação, conformacional e configuralmente (sampling), e a força de interação dos complexos ligante-receptor avaliados (scoring). Fonte: adaptado da apresentação de Dr. Sander B. Nabuurs, Computational Drug Discovery group, Center for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud University Medical Centre, “Virtual screening and molecular docking”, disponível em http://swift.cmbi.ru.nl/teach/B1SEM/HTML/fleksy.pdf.
4. Metodologia imunohistoquímica
Com o intuito de avaliar os índices de proliferação celular e apoptose no tumor utilizado como modelo animal in vivo, secções transversais das patas com tumor sólido de Ehrlich e tratados com a fração ativa de P. guajava PG.(F2-F3).(F6-F9) foram avaliados por imunohistoquímica para reação de PCNA e TUNEL in situ,