Os softwares utilizados na técnica de docking molecular – Molegro, PEARLS e Drugscore – diferem no tipo de análise dos complexos ligante/receptor. O software Molegro determina a maior cavidade do receptor de interesse e testa os possíveis encaixes dos ligantes, rotacionando-os em diferentes angulações possíveis. A interação ligante/receptor é testada de forma estática, avaliando unicamente o encaixe mecânico entre a molécula de interesse e o receptor, não permitindo grande flexibilidade nem torções dos átomos. Além disso, a possibilidade de formação do complexo é avaliada meramente em termos de encaixe mecânico, não simulando nenhuma situação em solução.
Já os softwares PEARLS e Drugscore, além de testar a formação de complexos ligante- receptor com maior flexibilidade que o Molegro (leva em consideração as possíveis torções dos átomos – Figura 51 - e não somente as possíveis angulações), também compara os complexos formados entre si, comparando a afinidade e força de ligação, parâmetro importante para avaliação dos scores e força dos complexos. Diferentemente do Molegro, PEARLS e Drugscore mimetiza um ambiente dinâmico, simulando uma situação de formação do complexo em solução, o que garante um ambiente mais similar ao fisiológico.
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3.2: Predição in silico da afinidade dos princípios ativos ao receptor de
estrógeno (ER)
Os estudos de docking molecular foram realizados com o objetivo de predizer a potencial afinidade das moléculas de guajadial e psidial A pelos receptores ER-α e ER-β. A acurácia das análises de docking foram monitoradas por comparação dos encaixes do estradiol e do tamoxifeno com em seus respectivos modos de ligação observados nas estruturas cristalográficas dos complexos ER-α/estradiol (PDBid: 1A52, Tanenbaum et al., 1998), ER-β/estradiol (PDBid: 3OLL, Möcklingshoff et al., 2010) e ER-α/tamoxifen (PDBid: 2P7Z, Abad et al., 2008).
Os cálculos RMSD entre o encaixe previsto e experimental do estradiol e tamoxifeno resultaram em valores RMSD de 0.23Å e 0.19Å, respectivamente. Estes valores asseguram a robustez da metodologia empregada no estudo.
A análise da área de superfície molecular (MSA) indicam que o psidial A (647Å) e o
guajadial (636Å) apresentam MSA similares ao tamoxifeno (654Å), indicando que ambas as
moléculas cabem na fenda correspondente ao sítio de ligação do estradiol e do tamoxifeno. De fato, os resultados de docking comprovaram que o guajadial e psidial A ligam-se no mesmo sítio que o estradiol e tamoxifeno em ambas as isoformas do receptor (ER-α e ER-β).
A área interfacial do guajadial e psidial A e o ER-α foram determinadas 427 e 407Å, respectivamente. Estes valores são próximos daqueles obtidos para o tamoxifeno (433Å), indicando seu potencial uso como drogas quimioterápicas, assim como o tamoxifeno. O ligante fisiológico estradiol apresenta uma área interfacial de 307Å, cerca de 30% menor em comparação ao tamoxifeno, guajadial e psidial A. Resultados semelhantes foram encontrados ao testar estes Figura 51: Exemplo de ligante a ser avaliado por docking molecular in silico. As esferas representam átomos e as barras representam as ligações entre estes. Setas curvadas indicam os átomos rotacionáveis da molécula (Teodoro, 2001).
66 compostos no ER-β, onde as interações são mantidas com maior área de contato do que com o ligante fisiológico (Figura 52).
O sítio de ligação do estradiol nos ERs é caracterizado por grande hidrofobicidade com poucos resíduos polares nas suas extremidades , responsáveis pela ancoragem da cauda polar do estradiol e tamoxifeno. Este ambiente químico é muito propício para a interação com moléculas apolares ou anfipáticas, como o estradial, tamoxifeno, guajadial e psidial A. A estrutura cristalográfica do ER-α complexado com o estradiol demonstra que o a interação do hormônio é orientada por 2 tipos de contatos: pontes de hidrogênio nas extremidades polares e interações hidrofóbicas de van der Waals nos anéis fenólicos A, B e C do hormônio (Tanenbaum et al., 1998).
Os estudos de docking do guajadial e psidial A nas isoformas ER-α e ER-β mostraram que cerca de 20 resíduos de aminoácidos estabelecem interações de van der Waals (Figura 52). Notavelmente, no complexo guajadial/ER-α, cerca de 15 resíduos que fazem contato do tipo van der Waals são conservados (R394, L391, L387, L346, F404, E353, A350, T347, L384, L428, M421, I424, G521, H524, L525; numeração ER-α humano), em relação ao complexo tamoxifeno/ER-α. No caso do psidial A, observa-se 14 resíduos que fazem contato do tipo van der Waals que podem interagir com o ER-α, também presentes no complexo tamoxifeno/ER-α. (G521, H524, R394, E353, A350, L387, L384, L391, M421, I424, F404, T347, L346, L525; numeração ER-α humano) (Figuras 52 A e B).
Os resíduos polares R394, E353 e H524 são tidos como elementos chave no reconhecimento do estradiol pelo ER, devido a sua habilidade de ancorar grupos hidroxila nas extremidades dos ligantes (Tanenbaum et al., 1998). Diferentemente do estradiol, ambas as moléculas de guajadial e psidial A apresentam somente uma extremidade polar, de modo que as interações de pontes de hidrogênio somente são observadas em uma das terminações do complexo (Figura 53). Importante notar que o segundo melhor encaixe para ambos os ligantes é aquele em que as moléculas encontram-se rotacionadas 180o em torno do centro, onde as interações de van der Waals são conservadas, permitindo, entretanto, um conjunto diferente de interações de hidrogênio com ambas as isoformas do receptor. Tal constatação é suportada pelo fato de que o sítio de ligação do estrógeno apresenta ambas as extremidades preenchidas de resíduos polares como mencionado anterioremente. A Tabela 11 apresenta a energia de interação
67 relative entre o guajadial e psidial A, e os receptores ER-α e ER-β, que também sugere afinidade entre os ligantes às isoformas dos receptores.
Tabela 11: Energias de afinidade relativas dos ligantes complexados nos ERs.
Receptor estrógeno Estradiol Tamoxifeno Guajadial Psidial A
ER-α 1 1.33 0.82 1.02
ER-β 1 0.92 0.85 1.21
Obs: Energia de afinidade relativa do estradiol no receptor de estrógeno (ER) normalizada para 1 por se tratar do ligante fisiológico.
Desse modo, o docking molecular consiste de uma técnica que avalia eficazmente a formação e estrutura de complexos ligante-receptor, aumentando substancialmente a chance de predizer atividades biológicas in vitro, tanto de compostos que ocorrem naturalmente quanto de compostos sintéticos melhorados organicamente, sendo ferramenta importante para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. Esta técnica permitiu predizer a potencial afinidade de ambos os princípios ativos isolados da folha de goiabeira, guajadial e psidial A a ambas as isoformas do receptor de estrógeno, ER-α e ER-β, com semelhança química ao estradiol e corroborando a idéia de semelhança com o tamoxifeno no que concerne o mecanismo de ação como SERMs.
68 Figura 52: Interações entre Guajadial (A/C) e Psidial A (B/D) e as isoformas do receptor de estrógeno ER-α/ER-β.
69 Figura 53: Representação gráfica da interação molecular de Guajadial (A) e Psidial A (B) com ER- α e Guajadial (C) e Psidial A (D) com ER-β. A cadeia principal da estrutura do receptor está representada em cinza com as cadeias laterais dos resíduos de interação evidenciados em verde. Ligante representado por modelo bola-bastão com carbonos em amarelo.
4. Resultados imunohistoquímicos
A histolopatologia do tumor sólido de Ehrlich apresenta como característica mais marcante a presença de extensas áreas de necrose, superficiais e profundas, entremeadas a áreas também extensas de células neoplásicas proliferativas, de alta celularidade. As células tumorais inoculadas
70 no coxim plantar apresentaram intensa proliferação local, invadindo e tecidos adjacentes, como o conjuntivo e a musculatura. Observa-se a presença de células tumorais arredondadas e volumosas, pouco diferenciadas, com pleomorfismo celular evidente, hipercromatismo nuclear e cromatina irregularmente distribuída. Podem ser visualizadas diversas figuras mitóticas, assim como focos de infiltrados inflamatórios. Há presença de células em processo de apoptose, localizadas dispersa e pontualmente. O estroma é bastante escasso, com pouca vascularização.
Considerando potenciais novos quimioterápicos, drogas que controlem a proliferação celular das células tumorais ou que induzam a morte celular destas são particularmente interessantes e merecem destaque maior investigação. De maneira a investigar mais a fundo os possíveis mecanismos de ação dos princípios ativos da goiaba, realizou-se testes de imunohistoquímica para parâmetros de proliferação celular (PCNA) e apoptose (TUNEL in situ).