A proliferação celular no tumor sólido de Ehrlich, verificada através da presença de células PCNA+, foi de fácil identificação devido à coloração ferrugem característica apresentada por estas células, em contraposição às células PCNA- de coloração hematoxilínica. A proliferação mostrou- se amplamente difusa e generalizada, não apresentando prepronderância por determinada região do tumor (central ou periférica). As áreas proliferantes caracterizam-se por serem muito extensas, sem delimitação clara, e embrenhadas nas áreas de necrose (mais discutidas adiante), sendo também observadas diversas figuras mitóticas facilmente caracterizáveis. A epitélio do tumor apresenta células muito marcadas, o que já era esperado para esta região devido à sua constante renovação. A prancha (Anexo 1) apresenta as principais características encontradas para o tumor sólido de Ehrlich no que concerne a questão da proliferação celular.
b) Morfometria:
A avaliação dos índices de proliferação celular nas secções transversais do tumor sólido de Ehrlich foi realizada através da contagem de células PCNA+, com uso de gratícula de área de 100mm2, com 441 pontos eqüidistantes, acoplada a microscópio de luz. Foram avaliados 15
71 campos aleatórios/animal, em ampliação de 40x, sendo os resultados expressos como no total de células PCNA+/no total de célula, contadas na intersecção dos 441 pontos. Foram evitadas regiões com necrose, uma vez que a presença destas poderia caracterizar um menor número na contagem das células proliferantes e não-proliferantes, levando a uma possível subestimação deste parâmetro. A Figura 54 apresenta a quantificação das células neoplásicas proliferantes, PCNA+, contadas em 15 campos aleatórios e expressa por grupo em % células PCNA+/células totais.
Figura 54: Quantificação das células neoplásicas proliferantes, PCNA+, expressas em % células PCNA+/células totais. A) grupo salina, B) grupo doxorrubicina, C, D, E) grupos goiaba 10, 30 e 50mg/kg, respectivamente.
Apesar do valor de p<0,05 significativo, indicando que o experimento foi válido estatisticamente, a porcentagem de células PCNA+/células totais foi estatisticamente igual em todos os grupos avaliados (controle negativo, controle positivo e grupo tratado com PG.(F2- F3).(F6-F9) nas doses 10, 30 e 50mg/kg), não havendo diferença estatística entre os grupos, conforme pode ser visto na Figura 54.
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4.2: Avaliação de apoptose
a) Histopatologia:
A presença de apoptose no tumor sólido de Ehrlich foi verificada através da reação de TUNEL in situ (descrita por Gravieli et al., 1992). À semelhança do observado para proliferação celular, a identificação de células TUNEL+ foi também facilmente realizada pela coloração ferrugem característica, resultado da reação da peroxidase com seus substrato, a diaminobenzidina (DAB). As células TUNEL+ são representativas de células em processo de apoptose (padrão cor ferrugem muito marcante) foram encontradas de forma pontual e dispersa nas secções transversais.
Estes mesmos cortes apresentaram, no entanto, uma extensa área de coloração também ferrugem, referente à áreas de necrose. Tal constatação é plausível uma vez que a reação de TUNEL in situ baseia-se na marcação direta e específica de DNA fragmentado no núcleo. Esta técnica marca quebras do DNA que ocorrem em fases mais tardias da apoptose, sendo as fases iniciais não detectadas. No entanto, células que sofreram necrose também podem ser detectadas através desse método (Loro et al., 2003). Desse modo, sua marcação não é tão específica quanto outras marcações para células apoptóticas como por caspase-3 (via apoptótica dependende de caspases).
As áreas de necrose, assim como as áreas de proliferação celular, apresentaram-se muito extensas, sem haver delimitação definida entre as mesmas. Ambas as regiões encontram-se intrinsicamente embrenhadas, havendo tendência à maiores áreas necróticas nas regiões centrais do tumor. A prancha (Anexo 2) apresenta as principais características encontradas para o tumor sólido de Ehrlich no que concerne a questão da reação de TUNEL in situ.
Apesar da reação de TUNEL in situ consistir numa técnica amplamente utilizada no estudo de apoptose, estando bem descrita na literatura, sua marcação não é tão específica como aquela realizada por outros marcadores para apoptose (ex: caspase-3), podendo ser detectado, portanto, mais um de um tipo de morte celular. O uso realizado a partir de kit fornecido pelo mercado, permite a realização de poucas reações, além de ser de alto custo, consistindo assim numa desvantagem do método (Balassiano, 2004).
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b) Morfometria:
Uma vez que a marcação de apoptose não foi dominante nas secções transversais do tumor sólido de Ehrlich, e sim as áreas de necrose (An), que ocorriam por grandes extensões do corte, avaliou-se a proporção que estas regiões representavam em relação à área total (At) da secção transversal. Para tal intuito, dividiu-se o corte em 4 grandes campos, de modo que, quando analisados em conjunto, representassem toda a extensão deste. Uma vez fotografados os campos, a porcentagem de área necrótica/área total foi avaliada pelo programa Image Pro-Plus 4.0, através de análise dos pixels. Uma vez diferenciado por cores as diferentes áreas, calculou-se a relação de An/At, expresso em porcentagem.
A Figura 55 apresenta quantificação das áreas de necrose nas secções transversais do tumor sólido de Ehrlich, expressas por área necrótica/área total.
Figura 55: Quantificação das áreas de necrose nas secções transversais do tumor sólido de Ehrlich, expressas por área necrótica/área total. A) grupo salina, B) grupo doxorrubicina, C, D, E) grupos goiaba 10, 30 e 50mg/kg, respectivamente.
Embora a resistência à apoptose de células tumorais esteja bem descrita e intimamente relacionada à tumorigênese, sabe-se que a célula tumoral pode morrer por mecanismos não apoptóticos, como necrose, senescência ou autofagia (Okada & Mak, 2004).
74 As mortes celulares por apoptose e necrose são acionadas e respondem por mecanismos bem diferentes na célula. A apoptose é um tipo de morte celular fisiológica e programada caracterizada por profundas modificações estruturais e funcionais na célula. À microscopia óptica, estas células apresentam características típicas, usualmente circundadas por um halo claro, e seus núcleos sofrem uma série de alterações, como retração celular e marginação e condensação da cromatina, seguidas de fragmentação da própria célula em corpos apoptóticos (Assis, 2007). Trata- se de uma morte dita silenciosa, onde a célula é estimulada a acionar mecanismos que resultarão em sua própria morte, sem induzir reações inflamatórias (Cohen, 1993; Kerr et al., 1972). Neste tipo de morte celular programada, a célula alvo não sofre lise, não liberando seus conteúdos celulares, os quais são transformados em corpos apoptóticos e esses são fagocitados por macrófagos ou fagócitos adjacentes, impedindo assim um processo inflamatório (Majno & Joris, 1995). Além disso, ela acomete as células isoladamente, não modificando a arquitetura tecidual e ocorre, na maioria das vezes, de forma programada e não de forma acidental (Dossef, 2004).
Na necrose, por sua vez, há tumefação celular com subseqüente perda da integridade da membrana plasmática e o conteúdo da célula é liberado ao espaço extracelular, o que conduz a uma resposta inflamatória naquela região. Além disso, a necrose acomete um maior número de células sendo, portanto, tissular e ocorrendo geralmente em caráter acidental ou patológico (radiação, infecção, inflamação ou isquemia) (Kressel & Groscurt, 1994; Levin et al., 1999; Majno &Joris, 1995; Okada & Mak, 2004).
A presença de necrose muito provavelmente está relacionada à falta de oxigênio (Assis, 2007) e de outros fatores nutricionais, sobretudo na região central do tumor. As células tumorais têm a capacidade de produzir fatores de crescimento que estimulam a angiogênese, e quando a taxa de crescimento é muito alta e a produção desses fatores não é proporcional à necessidade, as células tumorais sofrem hipóxia e morrem por necrose (Montenegro & Franco, 1999). As regiões centrais do tumor estão mais sujeitas à essa deficiência nutricional e de oxigênio, uma vez que localizam-se mais distantes dos vasos sanguíneos que nutrem o tumor.
De maneira semelhante ao constatado para a proliferação celular, a quantificação das áreas de necrose (% área necrótica/área total) também não apresentou diferença estatística entre os grupos avaliados: controle negativo, controle positivo e goiaba PG.(F2-F3).(F6-F9) 10, 30 e 50mg/kg, conforme pode ser visto na Figura 55, apesar do valor de p<0,05 para o experimento,
75 indicando sua validade estatística. A detecção inespecífica de mais de um tipo de morte celular (apoptose e necrose) talvez tenha tornado a quantificação das áreas necróticas menos acurada, sugerindo-se imunohistoquímica com marcadores específicos para necrose em experimentos futuros.
De qualquer maneira, as constatações observadas no modelo experimental utilizado neste projeto estão de acordo com a literatura que descreve a atividade de amostras frente ao Tumor de Ehrlich. Assis (2007) verificou uma redução no crescimento do tumor sólido mediante tratamento com vitamina E, mas não pôde constatar diferença significativa entre os grupos com relação às áreas de necrose existentes no tumor. Verçosa Jr. et al. (2007) também observou redução do crecimento do tumor sólido de Ehrlich mediante o tratamento com extrato aquoso de Agaricus
blazei, uma espécie de cogumelo, enquanto os valores de peso relativo e os padrões
morfohistopatológicos tumorais, assim como o potencial proliferativo da neoplasia ficaram inalterados.
Os resultados referentes à proliferação celular encontrados por Matsuzaki (2004) indicam também que o tratamento com extrato butanólico de Pfaffia paniculata, uma espécie vegetal, foi capaz de conter unicamente o crescimento do tumor na forma ascítica (mas não na sólida), possivelmente pelo maior acesso dos metabólitos contidos no extrato às células neoplásicas presentes no peritôneo, uma vez que este é mais vascularizado que a forma sólida do tumor. Além disso, quando avaliada a porcentagem de necrose em meio à massa tumoral na forma sólida, constatou-se que esta não diferiu entre os animais tratados com o extrato e os animais controle.
Uma vez que se observou que a amostra de goiaba foi eficaz na contenção do crescimento do tumor sólido de Ehrlich (avaliado em volume e peso) em relação ao controle negativo e positivo, mas que as porcentagens de proliferação celular e de necrose dos grupos tratados com goiaba não diferiram daqueles encontrados para os grupos controle, especula-se que tal modelo experimental
in vivo consista num bom modelo experimental de eficácia de possíveis novas drogas, mas não de
elucidação de mecanismos de ação.
Tal hipótese é corroborada pelos dados obtidos por Assis (2007) e Matsuzaki (2004), que também observaram ação de suas drogas sobre o tumor, mas não puderam detectar diferenças com relação às áreas necróticas presentes em meio à massa tumoral. Uma possível explicação para a contenção da proliferação do Tumor de Ehrlich na forma ascítica (e não na sólida)
76 constatada por Matsuzaki (2004), seria a de que, diferentemente da alta vascularização presente no peritônio, o tumor sólido, que apresenta menor vascularização, permita um menor acesso dos metabólitos do extrato vegetal às células tumorais. Além disso, drogas que agem diretamente sobre células neoplásicas localizadas no peritôneo tendem a ser mais eficazes do que aqueles que precisam atingir a corrente sanguínea, podendo sofrer metabolização hepática pelo organismo. Um outro fator a ser levado em consideração é o microambiente em que as células tumorais se encontram, que diferem entre estes dois modelos, o que poderia causar respostas diferentes do tumor à ação de substâncias presentes na amostra. Adicionada à essa questão, as células tumorais freqüentemente apresentam redundância nos mecanismos de morte, apresentando ação conjunta de mais de um tipo de morte celular (Matsuzaki, 2004).
A porcentagem da área de necrose dos animais tratados nas maiores doses da fração ativa PG.(F2-F3).(F6-F9) (30 e 50mg/kg) mostraram-se reduzidas em relação ao controle negativo (salina) e positivo (doxorrubicina). Uma possível explicação para isso seria que a de que a morte por necrose estimularia mais a resposta imune (os eventos apoptóticos estimulariam menos essa resposta). Apesar do estímulo imunológico gerar eventos inflamatórios clinicamente desfavoráveis aos organismos/pacientes, estimula o desenvolvimento de respostas imunes específicas contra os tumores tratados, promovendo a regulação do volume tumoral pela pressão imunológica contra os tumores (Castano et al., 2006). Assim, a amostra de goiaba poderia estar atuando sobre o tumor sólido de Ehrlich por mecanismos de controle sobre a inflamação, uma vez que esses processos são estimulados na presença de morte celular por necrose, uma das principais características deste modelo experimental.
A determinação da via de morte que determinada droga apresenta, assim como sua possível atuação sobre mecanismos inflamatórios representa é importante para o delineamento de melhores estratégias de tratamento. O modelo murino de tumor sólido de Ehrlich mostrou-se um modelo experimental indicado somente para eficácia de potencias novas drogas anticâncer, não sendo particularmente esclarecedor acerca dos mecanismos de controle da progressão tumoral dos princípios ativos testados. Para investigação de mecanismo de ação, maiores testes in vitro são indicados, assim como aprofundamento das técnicas de docking molecular.
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CONCLUSÕES
O EBD apresenta atividade antiproliferativa in vitro mais pronunciada que o EBE frente ao painel de linhagens tumorais humanas, o que justificou a continuidade do trabalho de purificação com este extrato.
O EBD e as frações enriquecidas obtidas a partir de folhas de goiabeira apresentaram seletividade para MCF-7 (mama) e OVCAR-3 (ovário), ambas linhagens hormônio-dependentes.
O processo de fracionamento biomonitorado do EBD mostrou-se eficaz no enriquecimento das frações ativas e purificação dos princípios ativos, levando ao isolamento dos princípios ativos meroterpenóides Guajadial e Psidial A, e mais dois isômeros destes, ainda inéditos, e cuja elucidação estrutural química está em andamento.
A atividade anticâncer da amostra também foi constatada in vivo, em animais inoculados com tumor sólido de Ehrlich, que apresentaram redução no crescimento do tumor em relação aos animais do grupo controle negativo (salina), nas 3 doses da fração ativa PG.(F2-F3).(F6-F9) testada.
Uma vez que as 3 doses da fração ativa foram significativas estatisticamente, e as maiores doses – 30 e 50mg/kg – apresentaram perda de peso, um importante sinal de toxicidade, justifica- se o uso da menor dose – 10mg/kg – que além de não tóxica, também implica em menor gasto de amostra.
O útero dos grupos tratados com goiaba apresentou-se evidentemente aumentado em tamanho e peso, sobretudo em relação ao grupo controle positivo (doxorrubicina), sugerindo uma possível ação hormonal dos princípios ativos, atuando como fitoestrógenos.
A observação de redução do crescimento do Tumor de Ehrlich, originalmente um adenocarcinoma de mama, aliado à estimulação do útero sugere um mecanismo de ação semelhante ao tamoxifeno, quimioterápio utilizado na clínica para o tratamento de câncer de mama, cujo maior risco é a estimulação das células do útero, levando a câncer de endométrio.
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De modo análogo ao tamoxifeno, os meroterpenóides Guajadial e Psidial A parecem atuar como SERMs, possuindo ação antagonista sobre os receptores de estrógeno da mama e agonista sobre os receptores do útero.
A atividade hormonal dos princípios ativos Guajadial e Psidial A isolados foi comprovada por docking molecular in silico, demonstrando afinidade pelo ER-α e ER-β.
O modelo murino de tumor sólido de Ehrlich mostrou-se um modelo experimental indicado somente para eficácia de potencias novas drogas anticâncer, não sendo particularmente esclarecedor acerca dos mecanismos de controle da progressão tumoral dos princípios ativos testados. Para investigação de mecanismo de ação, maiores testes in vitro são indicados, assim como aprofundamento das técnicas de docking molecular.
A goiaba, cujo uso tradicional para o tratamento de desordens gastrointestinais é amplamente recomendado, também tem seus frutos utilizados para consumo e também pela indústria alimentícia para a produção de geléias, doces e outros produtos. O presente projeto argumenta a favor de mais usos da espécie vegetal, que comprovadamente apresentou atividade anticâncer in
vitro e in vivo, além de também ter apresentado efeito hormonal in silico.
Frisa-se a relevância do saber tradicional associado à flora, sobretudo no que se refere à diversidade florística brasileira, uma vez que o conhecimento tradicional pode, muitas vezes, servir como valioso atalho para a descoberta de fármacos (Patwardhan & Vaidya, 2010). Ressalta-se também a importância da preservação do patrimônio genético e conservação das espécies vegetais fontes de potenciais drogas, fornecendo substrato autóctone para as indústriais farmacêuticas locais (Simões et al., 2007).
Testes adicionais são necessários, visto que somente as moléculas de Guajadial e Psidial
A têm sua estrutura elucidada, sendo os outros dois isômeros desta compostos inéditos. A
elucidação química das moléculas isômeras pode levar à descoberta de compostos com ação mais específica para as células tumorais, possivelmente com menor toxicidade e que possam atuar como adjuvantes das terapias anticâncer convencionais.
79 Ambos os resultados in vitro e in vivo sugerem a fração enriquecida na mistura de isômeros do meroterpenóide Guajadial e Psidial A (e, possivelmente, os isômeros isoladamente) como candidatos promissores para atividade anticâncer. Estudos adicionais são necessários para melhor compreender o mecanismo de ação dos princípios ativos de P. guajava L., tanto para terapia anticâncer como para desordens hormonais.
O depósito de patente sob a atividade anticâncer e hormonal dos princípios ativos isolados já foi realizado junto à Agência de Inovação da Unicamp (INOVA), e encontrada-se atualmente em fase de avaliação pelo INPI (Instituto Nacional de Propriedade Intelectual), com número de protocolo Goiaba_398.
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