iv
Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do
Instituto de Biologia da UNICAMP, as agências financiadoras CNPq, Capes e a
FAPESP pela bolsa concedida (processo 2009/06573-7).
“Anything one man can imagine, other man can make real.”
Jules Verne
"Não sabendo que era impossível, foi lá e fez."
Jean Cocteau
v
RESUMO
A pesquisa de drogas anticâncer através da triagem de extratos e princípios ativos obtidos de fontes naturais possibilitou a descoberta e o desenvolvimento de diversos quimioterápicos hoje utilizados no tratamento do câncer. Este projeto teve como objetivo avaliar a atividade anticâncer de Psidium
guajava L. (nome popular: goiabeira), espécie eleita através de levantamento etnofarmacológico para
atividade antiparasitária. Após a colheita, o material vegetal foi submetido a um processo de extração a quente por Soxhlet, com diclorometano e etanol 95%, originando o extrato bruto diclorometânico (EBD) e etanólico (EBE), respectivamente. O extrato bruto ativo, EBD, foi submetido a diversos fractionamentos biomonitorados, até a obtenção de uma fração enriquecida nos meroterpenos guajadial, psidial A e seus isômeros, princípios ativos da espécie vegetal. Todas as amostras (extratos brutos e frações enriquecidas) tiveram sua potencial atividade anticâncer avaliadas in vitro frente a um painel de dez linhagens tumorais humanas, cedidas pelo National Cancer Institute (NCI, Estados Unidos), a saber: K562 (leucemia), MCF-7 (mama), NCI/ADR-RES (ovário resistente a múltiplas drogas), NCI-H460 (pulmão), UACC62 (melanoma), PC-3 (próstata), HT-29 (cólon), OVCAR-03 (ovário), U251 (glioma) and 786-0 (rim). A fração ativa enriquecida nos meroterpenos foi avaliada in vivo no tumor sólido de Ehrlich, em camundongos Balb/C, reduzindo significativamente o crescimento tumoral. Além da atividade antitumoral observada in vivo, a análise macroscópica do útero indicou aumento em tamanho e peso em relação aos grupos controle negativo (salina) e positivo (doxorrubicina). As moléculas de guajadial e
psidial A apresentam propriedades físico-químicas semelhantes ao estradiol e ao tamoxifeno e estudos
de docking molecular sugerem que ambos os compostos se liguem no sítio de ligação no receptor de estrógeno (ER), analogamente ao tamoxifeno. A capacidade de reduzir o crescimento tumoral e, ao mesmo tempo, estimular o útero indicam que guajadial e psidial A possivelmente agem como fitoestrógenos, possuindo um mecanismo de ação semelhante ao tamoxifeno, atuando como SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators) e agindo como agonistas e antagonistas de forma tecido-específica.
Palavras-chave: P. guajava L. (goiabeira), atividade anticâncer in vitro e in vivo, Guajadial e Psidial A, fitoestrógenos, SERMs.
vi
ABSTRACT
Anticancer drug research based on screening of natural sources enabled the discovery of several drugs that are used in cancer treatment. This project aimed to evaluate the in vitro and in vivo anticancer activity of Psidium guajava L. (popular name: guava), elected for its ethnopharmacological use for antiparasitic activity. After harvesting, the vegetal material was extracted in Soxhlet with dicloromethane and then ethanol 95%, leading to the dicloromethane crude extract (DCE) and the ethanolic crude extract (ECE), respectively.The active extract, DCE, was submitted to several biomonitored fractionating processes and an active mixture of meroterpenes identified guajadial, psidial A and its isomers as active principles. All samples (crude extract and enriched fractions) were evaluated in vitro for cytotoxic activity against ten human cancer lines (donated by National Cancer Institute, USA): K562 (leukemia), MCF-7 (breast), NCI/ADR-RES (resistant ovarian cancer), NCI-H460 (lung), UACC62 (melanoma), PC-3 (prostate), HT-29 (colon), OVCAR-03 (ovary), U251 (glioma) and 786-0 (kidney). Meroterpenes enriched fraction was evaluated in vivo in the Solid Ehrlich Tumor, in Balb/C mice, and significantly reduced tumor growth. Besides antitumoral activity, macroscopic analysis of uterus showed increased size and weight in comparison to both negative (vehicle) and positive (doxorubicin) control groups. The molecules of
guajadial and psidial A display similar physicochemical properties to estradiol and tamoxifen and in silico
molecular docking studies suggest that both molecules bind to the estrogen-binding site of ERs analogously to tamoxifen. The ability to reduce breast cancer tumor growth and stimulate the uterus suggests that guajadial and psidial A may act as phytoestrogens, giving insights for a mechanism of action similar to tamoxifen, acting as SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators), having both agonist and antagonist tissue-specific activities.
Keywords: P. guajava L. (guava), in vitro and in vivo anticancer activity, Guajadial and Psidial A, phytoestrogen, SERMs.
vii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
An Área necrótica Ap Área proliferativa
At Ärea total
CCD Cromatografia de camada delgada CCDC Cambridge Crystallographic Data Centre CDCl3 (Fórmula química) Clorofórmio deuterado
CEEA Comitê de Ética em Experimentação Animal CH2Cl2 (Fórmula química) diclorometano
CH3COOH Ácido acético
Co Tecido conjuntivo CO2 Gás carbônico
DMSO Dimetilsulfóxido de sódio EBD Extrato bruto diclorometânico EBE Extrato bruto etanólico
Ep Tecido epitelial
ER Receptor de estrógeno (Estrogen receptor) ER-α Receptor estrógeno α
ER-β Receptor de estrógeno β EtOH (Fórmula química) etanol
GC-MS Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (Gas chromatograpy mass spectrometry)
GC-Tof Time of Flight Gas Chromatography
Hic-Up Hetero Compound Information Centre Uppsala HTS High-throughput screening
LINST Laboratório de Instrumentação
MSA Área de superfície molecular (Molecular surface area) MVD Molegro Virtual Docker
NCI National Cancer Institute n.i. (composto) não identificado OE Óleo essencial
PDB Protein Data Bank PEN-STREP Penicilina-Estreptomicina
RMN Ressonância magnética nuclear
SERMs Selective Estrogen Receptor Modulators SFB Soro fetal bovino
SRB Sulforrodamina B SRB Sulforrodamina B TCA Ácido tricoloroacético
TGI Total Growth Inhibition
THR Terapia de reposição hormonal tR Tempo de retenção
viii
ÍNDICE DE TABELAS E FIGURAS
Figura 1 Espécie vegetal Psidium guajava L., em flor (a esquerda) e em fruto (a direita). p. 2 Figura 2 Tecidos alvo de atuação do estrógeno (a esquerda) e efeitos benéficos e
prejudiciais deste hormônio no organism (a direita), que podem acarretar em aumento do risco de câncer. Fonte: adaptado de National Cancer Institute (NCI), USA (http://www.cancer.gov/).
p. 6
Figura 3 Redução do número de casos de câncer de mama pelo tratamento com tamoxifeno em comparação com tratamento com placebo. Fonte: National Cancer Institute (NCI), USA (http://www.cancer.gov/).
p. 7
Figura 4 Objetivos da técnica de docking molecular: predizer a possibilidade de interação de moléculas de um banco de dados a um receptor de interesse (A) e avaliar a força de formação dos complexos ligante-receptor (B). Fonte: adaptado da apresentação de Dr. Sander B. Nabuurs, Computational Drug Discovery group, Center for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud University Medical Centre,
“Virtual screening and molecular docking”,
http://swift.cmbi.ru.nl/teach/B1SEM/HTML/fleksy.pdf.
p. 9
Figura 5 Fluxograma do processo de extração e isolamento de princípios ativos do material vegetal (folhas) de P. guajava L.
p. 13
Figura 6 Fotos dos processos fitoquímicos empregados para o fracionamento do extrato bruto, por coluna filtrante (a esquerda) e coluna clássica (a direita). Proporção amostra:sílica na coluna filtrante 1:3, na coluna clássica 1:30.
p. 14
Figura 7 Esquema da placa T0, utilizada como controle durante o teste antiproliferativo in
vitro. As letras e números representam abreviaturas das linhagens celulares, a saber: 2 = U-251, U = UACC-62, M = MCF-7, A = ADR, 7 = 786-0, 4 = NCI-460, P = PC-3, O = OVCAR-3, H = HT-29, K = K562, V = VERO.
p. 16
Figura 8 Modelo de placa tratada com 5 amostras a serem testadas, em diluição seriada de 250; 25; 2,5 e 0,25 g/ml.
p. 17
Figura 9 Fluxograma do método utilizado nos testes in vitro para avaliação da atividade anticâncer da espécie vegetal selecionada (Psidium guajava L.).
p. 18
Figura 10 Manutenção das células do tumor de Ehrlich, na forma ascítica, para posterior crescimento na forma sólida (adaptado de Ferreira, 2006).
p. 19
Figura 11 Esquema do modelo experimental in vivo utilizado no tumor sólido de Ehrlich. p. 20 Figura 12 Representação esquemática da técnica de docking molecular. Moléculas
provenientes de um banco de dados são testadas em determinado sítio de ligação, conformacional e configuralmente (sampling), e a força de interação dos complexos ligante-receptor avaliados (scoring). Fonte: adaptado da apresentação de Dr. Sander B. Nabuurs, Computational Drug Discovery group, Center for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud University Medical Centre, “Virtual screening
and molecular docking”, disponível em
http://swift.cmbi.ru.nl/teach/B1SEM/HTML/fleksy.pdf.
p. 22
Figura 13 Gratícula utilizada para contagem das células PCNA+ em secções transversais do tumor sólido de Ehrlich. As cabeças de setas indicam exemplos de células
ix
marcadas nas intersecções dos 441 pontos da gratícula.
Figura 14 Programa Image Pro-Plus 4.0, utilizado para avaliação da porcentagem de An/At nas secções transversais de tumor sólido de Ehrlich, através da análise de pixels.
p. 25
Figura 15 Cromatograma por GC-MS do óleo essencial extraído das folhas de P. guajava. p. 26 Figura 16 Corte transversal da folha de Psidium guajava (base da nervura mediana, aumento
de 100x), destacando-se a presença das bolsas secretoras, onde se acumula o óleo essencial Siani et al. (2000).
p. 28
Figura 17 Atividade anticâncer in vitro do óleo essencial de P. guajava. p. 29
Figura 18 Atividade anticâncer in vitro do extrato bruto diclorometânico (EBD) de P. guajava. p. 31 Figura 19 Atividade anticâncer in vitro do extrato bruto etanólico (EBE) de P.guajava. p. 31 Figura 20 Análise por CCD do EBD (F0) e das frações (F01 – F024) obtidas por fracionamento
em coluna filtrante de P. guajava. Fase móvel: diclorometano/metanol 1%, revelação: anisaldeído.
p. 33
Figura 21 Sobreposição das expansões dos cromatogramas de PG.(F2) e PG.(F3) (tR = 43 –
55 min).
p. 34
Figura 22 Atividade anticâncer in vitro de PG.(F2), obtida a partir do 1º fracionamento de Psidium guajava.
p. 35
Figura 23 Atividade anticâncer in vitro de PG.(F3), obtida a partir do 1º fracionamento de Psidium guajava.
p. 36
Figura 24 Análise por CCD de PG.(F2-F3) (F0) e das frações (F01 – F037) obtidas no 2º
fracionamento (através de coluna clássica) de P. guajava. Fase móvel: hexano/diclorometano 20:80, revelação: anisaldeído.
p. 37
Figura 25 Análise por CCD das frações obtidas no 2º fracionamento de P. guajava, depois de agrupadas. Fase móvel: hexano/dicloro 20:80, revelação: anisaldeído.
p. 37
Figura 26 Sobreposição dos cromatogramas obtidos por GC-MS de PG.(F2-F3).(F6) a PG.(F2-F3).(F9), frações provenientes do 2º fracionamento de Psidium guajava.
p. 38
Figura 27 Atividade anticâncer in vitro de PG.F(2-3).(F6), obtida a partir do 2º fracionamento de Psidium guajava.
p. 39
Figura 28 Atividade anticâncer in vitro de PG.F(2-3).(F7), obtida a partir do 2º fracionamento de Psidium guajava.
p. 39
Figura 29 Atividade anticâncer in vitro de PG.F(2-3).(F8), obtida a partir do 2º fracionamento de Psidium guajava.
p. 40
Figura 30 Atividade anticâncer in vitro de PG.F(2-3).(F9), obtida a partir do 2º fracionamento de Psidium guajava.
p. 40 Figura 31 Análise por CCD de PG.(F2-F3).(F6-F9) = (F0) e das frações (F01 – F040) obtidas
no 3º fracionamento (através de coluna clássica) de P. guajava. Fase móvel: hexano/diclorometano 15:85, revelação: anisaldeído.
p. 41
Figura 32 Análise por CCD das frações obtidas no 3º fracionamento de P. guajava, depois de agrupadas. Fase móvel: hexano/diclorometano 15:85, revelação: anisaldeído.
x
Figura 33 Cromatogramas da fração PG.(F2-3).(F6-F9).(F4), do 3º fracionamento de P.
guajava.
p. 42
Figura 34 Atividade anticâncer in vitro de PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4), obtida a partir do 3º fracionamento de Psidium guajava.
p. 43
Figura 35 Análise por CCD de PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4) = (F0) e das frações (F01 – F043)
obtidas no 4º fracionamento (através de coluna filtrante) de P. guajava. Fase móvel: hexano/diclorometano 30:70, revelação: anisaldeído.
p. 44
Figura 36 Análise por CCD das frações obtidas no 4º fracionamento de P. guajava, depois de agrupadas. Fase móvel: hexano/diclorometano 15:85, revelação: anisaldeído.
p. 45
Figura 37 Cromatograma da fração PG.(F2-3).(F6-F9).(F4).(F7), do 4º fracionamento de P.
guajava.
p. 45 Figura 38 Cromatograma GC-MS expandido de PG.(F2-3).(F6-F9).(F4).(F7), fração
proveniente do 4º fracionamento, Rt = 40 a 48min.
p. 46
Figura 39 Cromatograma da amostra PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4).(F7), obtido através da técnica de GC-Tof.
p. 47
Figura 40 Fragmentograma do pico com tR = 12,75, da amostra PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4).(F7). p. 47
Figura 41 Espectro de RMN-1H referente à fração enriquecida PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4).(F7). p. 48 Figura 42 Pata sem tumor (controle negativo) e com tumor sólido de Ehrlich (Silva et al.,
2004).
p. 50
Figura 43 Variação do volume do tumor sólido de Ehrlich para os grupos controle negativo (salina), positivo (doxorrubicina) e tratados com goiaba nas doses de 10, 30 e 50 mg/kg. Teste de Duncan, p<0,05 (ANOVA). * = Todos os grupos tratamento diferem do grupo salina (p<0,05); # = Todos os grupos tratamento exceto grupo doxorrubicina diferem do grupo salina (p<0,05).
p. 51
Figura 44 Variação do peso corporal nos diferentes grupos de camundongos com tumor sólido de Ehrlich, durante os 21 dias de experimento. * = Teste de Duncan, p<0,05 (ANOVA).
p. 52
Figura 45 Análises do peso relativo do tumor sólido de Ehrlich, avaliado ao final do experimento (D21) pela diferença entre o peso da pata com tumor (posterior direita) e a pata contralateral (posterior esquerda). * = Teste de Duncan, p<0,05 (ANOVA), ** = Teste de Duncan, p<0,01 (ANOVA), *** = Teste de Duncan, p<0,001 (ANOVA),
p. 53
Figura 46 Avaliação do peso do útero ao final do experimento (D21) do tumor sólido de Ehrlich. * = Teste de Duncan, p<0,05 (ANOVA).
p. 56
Figura 47 Semelhança estrutural química entre o princípio ativo isolado de P. guajava L. e o estradiol, possivelmente explicando a ação estrógeno-like observada sobre o útero.
p. 57
Figura 48 Mecanismo de ação do fármaco tamoxifeno, que apresenta ação anti-estrogênica sobre as células da câncer de mama (sendo, por isso, clinicalmente utilizado para terapia anticâncer), mas apresentando ação estrogênica sobre as células do útero (elevando o risco de câncer de endométrio). Fonte: adaptado de National Cancer Institute (NCI), USA (http://www.cancer.gov/).
p. 60
Figura 49 Variação do volume do tumor sólido de Ehrlich para os grupos controle negativo (salina), positivo (doxorrubicina) e tratados com a fração ativa de goiaba PG.(F2-F3).(F6-F9) nas doses de 10, 30 e 50 mg/kg. * = Teste de Duncan, p<0,05
xi
(ANOVA).
Figura 50 A ação dos SERMs tamoxifeno e raloxifeno em diferentes sítios alvos. As drogas quimioterápicas clinicamente em uso possuim um mecanismo de acionar ou deligar a ação estrogênica/anti-estrogênica sobre os receptores de estrógeno de forma sítio específica (adaptado de Jordan et al., 2006).
p. 64
Figura 51 Exemplo de ligante a ser avaliado por docking molecular in silico. As esferas representam átomos e as barras representam as ligações entre estes. Setas curvadas indicam os átomos rotacionáveis da molécula (Teodoro, 2001).
p. 66
Figura 52 Interações entre Guajadial (A/C) e Psidial A (B/D) e as isoformas do receptor de estrógeno ER-α/ER-β.
p. 69 Figura 53 Representação gráfica da interação molecular de Guajadial (A) e Psidial A (B) com
ER-α e Guajadial (C) e Psidial A (D) com ER-β. A cadeia principal da estrutura do receptor está representada em cinza com as cadeias laterais dos resíduos de interação evidenciados em verde. Ligante representado por modelo bola-bastão com carbonos em amarelo.
p. 70
Figura 54 Quantificação das células neoplásicas proliferantes, PCNA+, expressas em % células PCNA+/células totais. A) grupo salina, B) grupo doxorrubicina, C, D, E) grupos goiaba 10, 30 e 50mg/kg, respectivamente.
p. 72
Figura 55 Quantificação das áreas de necrose nas secções transversais do tumor sólido de Ehrlich, expressas por área necrótica/área total. A) grupo salina, B) grupo doxorrubicina, C, D, E) grupos goiaba 10, 30 e 50mg/kg, respectivamente.
p. 74
Tabela 1 Usos etnofarmacológicos de P. guajava (adapatado de Kamath et al., 2008). p. 3 Tabela 2 Relação das linhagens tumorais humanas utilizadas no teste in vitro para avaliação
da atividade anticâncer dos extratos brutos e frações.
p. 16
Tabela 3 Identificação por GC-MS dos constituintes do óleo essencial de folhas de P. guajava.
p. 27
Tabela 4 Valores de TGI (µg/mL) do óleo essencial de P. guajava. p. 29
Tabela 5 Rendimentos de extração do extrato bruto diclorometânico e etanólico de P. guajava.
p. 30
Tabela 6 Valores de TGI (µg/mL) dos extratos brutos de P. guajava. p. 32
Tabela 7 Valores de TGI (µg/mL) do EBD e das frações ativas de P. guajava. p. 43 Tabela 8 Análises por GC-MS dos compostos majoritários encontrados no cromatograma da
fração PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4).(F7), de Psidium guajava.
p. 46
Tabela 9 Dados de RMN-1H dos princípios ativos presentes na fração enriquecida PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4).(F7) (11 Tesla, CDCl3).
p. 49
Tabela 10 Percentual de redução tumoral para os animais tratados com goiaba em relação aos tratados com controle negativo (salina).
p. 54
xii
ÍNDICE
I. Introdução ... 01 – 10 II. Objetivos ... 11 III. Materiais e métodos ... 12 - 24
1. Metodologia fitoquímica
1.1 Coleta do material vegetal ... 12 1.2 Extração do óleo essencial ... 12 1.3 Extração e isolamento dos princípios ativos ... 12 - 14 1.4 Análises químicas dos princípios ativos ... 15 2. Metodologia farmacológica
2.1 Ensaios in vitro: Atividade anticâncer em cultura de células 15 – 19 2.2 Ensaios in vivo: Atividade anticâncer em animais de laboratório ... 19 – 20 3. Metodologia de docking molecular in silico ... 21 – 22 4. Metodologia imunohistoquímica
4.1 Avaliação da proliferação celular (PCNA) ... 22 – 23 4.2 Avaliação de apoptose (TUNEL in situ) ... 23 – 24 IV. Resultados e Discussão ... 26 – 77
1. Resultados fitoquímicos e farmacológicos in vitro
1.1 Óleo essencial das folhas de Psidium guajava ... 26 – 29 1.2 Teor de umidade da espécie vegetal ... 29 1.3 Obtenção dos extratos brutos ... 29 – 31 1.4 Fracionamento do extratos bruto ativo (EBD) ... 32 – 49 2. Resultados farmacológicos in vivo
2.1 Tumor sólido de Ehrlich ... 49 – 54 2.2 Alterações no útero ... 54 – 59 2.3 Comparação do efeito da fração ativa de goiaba com o tamoxifeno ... 60 – 64 3. Resultados de docking molecular in silico
3.1 Sobre os softwares empregados ... 64 – 65 3.2 Predição da afinidade dos princípios ativos ao receptor de estrógeno ... 65 – 69 4. Resultados imunohistoquímicos
4.1 Avaliação da proliferação celular (PCNA) ... 70 – 71 4.2 Avaliação da apoptose (TUNEL in situ) ... 72 – 76 V. Conclusões ... 77 – 79 VI. Referências bibliográficas ... 80 – 85 VII. Anexos ... 86 - 87
1
INTRODUÇÃO
Produtos naturais consistem em uma importante fonte para pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos (Buttler, 2008; Harvey, 2008; Cragg & Newman, 2009), sendo a natureza uma fonte rica de candidatos a compostos terapêuticos, devido à imensa diversidade química e biológica nela encontrada (da Rocha et al., 2001; Diwanay et al., 2004). Apesar do progresso científico e tecnológico alcançado pela síntese química, muitos agentes farmacêuticos foram descobertos através da busca em fontes naturais como plantas, organismos marinhos e microorganismos.
Para muitos organismos, essa diversidade química reflete o impacto da evolução na seleção e conservação de mecanismos de defesa que representam estratégias empregadas para repelir ou destruir possíveis predadores ou competidores (da Rocha et al., 2001). As plantas que apresentam a capacidade de se defender de potenciais predadores e de inibir plantas competidoras atingiram essas características através do tempo por seleção natural (da Rocha et al., 2001). Para sobreviver, desenvolveram sofisticados mecanismos de sinalização através de feromônios e também de defesa, incluindo um elaborado arsenal químico de substâncias tóxicas, como terpenos que inibem o crescimento de outras plantas e os alcalóides que as torna menos atrativas a predadores (Mans et al., 2000).
As florestas oferecem grandes oportunidades para a descoberta de drogas promissoras, consistindo numa fonte de riqueza química e biológica, sendo por isso denominada por muitos de farmácia vegetal. Uma vez isoladas, essas substâncias são avaliadas por testes de atividade farmacológica que podem levar à descoberta de um novo fármaco ou possivelmente a compostos que podem ser melhorados quimicamente (Mans et al., 2000).
O câncer, a segunda causa de morte mais comum no mundo (perdendo somente para as doenças cardiovasculares) (Reddy et al., 2003) tem se beneficiado dos estudos que se baseiam em pesquisas de fontes naturais (da Rocha et al., 2001). Das drogas utilizadas no tratamento do câncer, cerca de 60% são provenientes de produtos naturais ou diretamente derivados destes (Cragg & Newman, 2009) e como exemplo pode citar-se: taxol, doxorrubicina, vincristina, vimblastina, etoposídeos, entre outros.
É importante ressaltar a relevância do incentivo à expansão da investigação da natureza como fonte de novos compostos ativos que possivelmente servirão de base para a elaboração de drogas para as enfermidades humanas. Reitera-se o constante desafio de desenvolvimento de terapias que sejam
2 duplamente efetivas e com alta especificidade para as células cancerosas ou tecido tumoral (Newman & Cragg, 2007). Os possíveis compostos e princípios ativos devem, idealmente, ser seletivos para células cancerosas versus células normais, não causar toxicidade, ter efeitos colaterais mínimos ou inexistentes e não interferir em eventuais outras terapias utilizadas no tratamento (Diwanay et al., 2004).
A espécie vegetal eleita neste projeto, Psidium guajava L. (nome popular: goiabeira), faz parte do Projeto Fapesp-Bioprospecta (um projeto que visa a bioprospecção de compostos de interesse econômico em microrganismos, fungos macroscópicos, plantas, invertebrados (inclusive marinhos) e vertebrados no Estado de São Paulo) e foi selecionada baseada num levantamento prévio dos estudos etnofarmacológicos para atividade antiparasitária. Por apresentar potencial atividade anticâncer dos seus extratos brutos particularmente interessante e promissores in vitro, foi selecionada para dar continuidade aos estudos de biofracionamento e isolamento dos princípios ativos.
A goiabeira, pertencente à família Myrtaceae, é originária das regiões tropicais da América Central e do Sul, especialmente Brasil e Antilhas, sendo a espécie Psidium guajava L. a mais importante do gênero Psidium (Silva, 2001). Largamente espalhadas nas florestas brasileiras, muitas de suas espécies são cultivadas por conta de seus frutos comestíveis, com finalidade ornamental, fonte de madeira e lenha, ou como fonte de essências de valor comercial (Figura 1) (Lima et al., 2010). P.
guajava, por muitos aclamada „poor man‟s apple of the tropics‟, tem um longo uso na medicina tradicional
(Kamath et al., 2008). Alguns exemplos de usos etnofarmacológicos para a espécie encontram-se citados na Tabela 1.
3 Tabela 1: Usos etnofarmacológicos de P. guajava (adaptado de Kamath et al., 2008).
País
Uso popular
Amazônia Diarréia, disenteria, desordens menstruais, dor de estômago
Brasil Anorexia, cólera, diarréia, problemas digestivos, disenteria, insuficiência gástrica, laringite, problemas de pele, dor de garganta, úlceras, corrimento vaginal
Cuba Resfriados, disenteria
Ghana Tosse, diarréia, disenteria, dor de dente
Haiti Disenteria, diarréia, epilepsia, coceira, hemorróidas, sarna, dor de garganta, dor de estômago, feridas e como antiséptico e adstringente
Índia Anorexia, partos, convulsões, epilepsia, nefrite, icterícias
México Surdez, diarréia, coceira, hemorróidas, dor de estômago, inchaço, úlcera, parasitoses, feridas
Peru
Conjuntivite, tosse, diarréia, problemas digestivos, disenteria, gota, hemorragias, gastroenterite, gastrite, problemas respiratórios, corrimento vaginal, vertigem, vômitos, parasitoses
Filipinas Feridas e como adstringente
Trinidad Infecções bacterianas, diarréia, disenteria
A atividade biológica de P. guajava foi comprovada cientificamente para antidiarréia, antiproliferativa (Manosroi et al., 2006), antibacteriana, antimutagênica (Matsuo et al., 1996), antimicrobiana, antiinflamatória (Qadan et al., 2005), antioxidante (Hui-Yin et al., 2007), hipoglicêmica (Ojewole, 2005), hipotennsiva e hipocolesterolêmica (Singh et al., 1993). Análises fitoquímicas prévias de Sunttornusk, 2005 indicam que P. guajava é rica em taninos, fenóis, triterpenos, flavonóides, óleos essenciais, saponinas, carotenóides, lectinas, vitaminas, fibras e ácidos graxos, tanto nas folhas quanto nos frutos. Dos diversos compostos isolados de P. guajava descritos pela literatura, a quercetina é o constituinte considerado mais ativo para esta espécie vegetal. O flavonóide quercetina, encontrado tanto na folha quanto no fruto, possui atividade espasmolítica e antidiarréica, justificando o uso tradicional desta planta para disordens gastrointentinais (Uboh et al., 2010).
Diversas técnicas são utlizadas para avaliação de compostos com atividade biológica, e grandes avanços foram realizados nos últimos 20 anos no que concerne ensaios celulares e bioquímicos para avaliação de tais compostos de interesse. Os denominados high-throughput screenings (HTS) são ensaios, em sua maioria automatizados, que fazem uso de placas multiwell, ou seja, com 96, 384 ou até
4 1536 wells e que maximizam a escala de teste, economizando controles e reduzindo custo e tempo (Harvey & Cree, 2010).
Para a pesquisa de novas drogas anticâncer, o aprimoramento da metodologia de cultura de células permitiu o cultivo e manutenção de diversas linhagens celulares oriundas de diversos tumores humanos, possibilitando o desenvolvimento de metodologia para triagem in vitro. Uma vez que as células tumorais são caracterizadas, em parte, pela sua capacidade de proliferação desenfreada (Hanahan & Weinberg, 2000), um dos enfoques dos métodos de high-throuput screening é justamente a busca por compostos que reduzam a proliferação de células tumorais in vitro (Harvey & Cree, 2010).
O National Cancer Institute (NCI, Estados Unidos) mantém, com esse objetivo, um painel de células cancerígenas que conta com mais de 60 linhagens oriundas de oito tipos de tumores sólidos (pulmão, melanoma, mama, rim, cólon, próstata, ovário e cérebro) e do sistema hematopoiético (leucemia). Essa metodologia de ensaio de atividade antiproliferativa in vitro permite a avaliação de extratos e princípios ativos em diversas células neoplásicas e não neoplásicas, possibilitando a descoberta de drogas com maior especificidade. Conta ainda com a maior rapidez e eficiência do método, que avalia um número grande de drogas em curto período de tempo (Rubistein et al., 1990; Skehan et al., 1990).
Células em cultura, entretanto, encontram-se em um ambiente artificial (Halliwell, 2003), e geralmente proliferam de forma bem mais rápida do que o fariam in situ, de modo que uma das preocupações desse tipo de ensaios se refere à correlação dos resultados de ensaios proliferativos com aqueles provenientes de testes in vivo e também na habilidade de predizer a atividade das drogas em pacientes (Fernando et al., 2006). Assim, associado ao trabalho desenvolvido in vitro frente ao painel de linhagens tumorais, a etapa fundamental no desenvolvimento de uma nova droga anticâncer é a comprovação de sua atividade em modelos experimentais in vivo (etapa pré-clínica), que auxiliam na validação da atividade constatada e corroboram o prosseguimento em eventuais estudos clínicos (Carvalho, 2006).
Para tal, utilizou-se o modelo murino de tumor sólido de Ehrlich, uma neoplasia descrita por Paul Ehrlich em 1906 e consistindo de uma neoplasia de camundongos, transplantável, originária de um adenocarcinoma de mama (Ehrlich, 1906). As formas ascítica ou sólida de seu crescimento ocorrem conforme o local de sua inoculação (Wainstein, 1999). Quando inoculado na cavidade abdominal, as células tumorais crescem na sua forma ascítica, desenvolvendo uma carcinomatose peritoneal, com grande acúmulo de fluido no abdome (ascite). O tumor de Ehrlich na forma sólida, por sua vez,
5 apresenta-se como uma massa palpável e de consistência firme, sendo descrito morfologicamente pela presença de células com alto grau de atipias (anaplasia), caracterizadas por nucléolos evidentes e numerosos, cromatina condensada, mitoses atípicas ou aberrantes e relação núcleo/citoplasma maior que a das células normais (Dagli, 1989). Uma das vantagens da utilização deste modelo é a possibilidade da padronização do número de células a serem inoculadas em animais, tanto para o crescimento na forma ascítica como sólida, pois as células presentes no fluido ascítico podem ser facilmente quantificadas (Matsuzaki, 2004).
Por sua origem histopatológica proveniente de um adenocarcinoma de mama, há muito se discute a dependência hormonal do Tumor Sólido (e Ascítico) de Ehrlich, sendo esta questão ainda controversa na literatura, havendo evidências a favor e contra a hipótese desta neoplasia reter características hormônio-dependentes. Em se tratando do câncer de mama, a ação do hormônio esteroidal estrógeno sob o receptor de estrógeno (ER), nas suas isoformas suas isoformas ERα e ERβ é
tido como a principal responsável pela proliferação das células neoplásicas. Assim, o receptor de estrógeno (ER) consiste no principal alvo das terapias hormonais para tratamento e prevenção da doença (McDonnel, 2006).
A mama e o útero consistem nos órgãos mais afetados pela ação estrogênica, mas outros alvos também são atingidos pela ação do hormônio, como é o caso do cérebro, coração, fígado e ossos. Por atuar sobre sítios alvo diferentes, o estrógeno demonstra, paradoxalmente, efeitos benéficos e prejudiciais. Entre os benéticos, o hormônio dá estímulo reprodutivo para a mama e útero, controla a produção de colesterol pelo fígado, limita a formação de placas nas artérias coronarianas, e preserva a resistência óssea. Por outro lado, adicionalmente entre esses efeitos, o estrógeno também pode ser prejudicial, sobretudo por sua habilidade de estimular a proliferação de células da mama e do útero. Apesar de tal papel ser considerado “normal”, também acarreta num risco aumentado de desenvolver câncer de mama e endométrio (Figura 2) (http://www.cancer.gov/).
6 Figura 2: Tecidos alvo de atuação do estrógeno (a esquerda) e efeitos benéficos e prejudiciais deste hormônio no organism (a direita), que podem acarretar em aumento do risco de câncer. Fonte: adaptado de National Cancer Institute (NCI), USA (http://www.cancer.gov/).
Nas mulheres após a menopausa, a redução na produção de estrógeno. é parcialmente
compensada pela terapia de reposição hormonal (TRH), que previne sintomas da menopausa mas aumenta os riscos de doenças ligadas aos órgãos reprodutivos (Figura 2). Os compostos mais promissores para TRH consistem nos „modulares seletivos de receptores de estrógeno‟ (do inglês,
Selective Estrogen Receptor Modulator, SERMs), que agem de maneira tecido-específica, atuando como
agonistas em alguns tecidos-alvo e como antagonistas em outros (McDonnell, 2006).
Um dos SERMs mais conhecidos e utilizados na prática clínica é o tamoxifeno, fármaco sintético com ação anti-estrogênica utilizado em mulheres na menopausa de maneira profilática contra o câncer de mama e também para prevenção de recidivas e metástases deste tipo de câncer
(Kostoglou-7 Athanassiou et al., 1998). O mecanismo de ação do tamoxifeno não é completamente elucidado, mas acredita-se que ele bloqueie competitivamente os receptores de estrógeno, suprimindo a transcrição do genoma da célula do câncer de mama. No entanto, a ação deste fármaco é tida como “uma faca de dois gumes”, uma vez que apresenta forte ação antagonista do estrógeno na mama (terapia anticâncer) (Figura 3), mas também manifesta atividade agonista no útero (podendo levar a câncer de endométrio) (McDonnell, 2006).
Figura 3: Redução do número de casos de câncer de mama pelo tratamento com tamoxifeno em comparação com tratamento com placebo. Fonte: National Cancer Institute (NCI), USA (http://www.cancer.gov/).
Também fazem parte do grupo de SERMs os fitoestrógenos, substâncias derivadas de plantas estrutural e funcionalmente similares ao estrógeno, comumente encontradas em diversas espécies vegetais (Sharma et al., 2005, Ziegler, 2003) e que ocupam os receptores de estrógeno de forma seletiva, apresentando ação estrogênica e anti-estrogênica. Quando o nível de estrógeno do organismo é alto, o fitoestrógeno compete pelos receptores, enfraquecendo o efeito dos hormônios. Por outro lado, se o nível de estrógeno é baixo, o fitoestrógeno potencializa o efeito estrogênico. Assim, estes análogos do estrógeno agem de modo a balancear os efeitos estrogênicos, não alterando a quantidade de estrógeno ou de outros hormônios no organismo, mas interagindo com os receptores deste hormônio de modo a normalizar os efeitos estrogênicos (Passwater, 2007).
8 Uma vez que o tratamento do câncer tem como principais objetivos (1) a remoção do tumor primário, (2) a prevenção de metástases, (3) o aumento da sobrevida de pacientes e (4) a busca por drogas com efeitos colaterais (imunosupressão, citotoxicidade, etc) reduzidos, o uso de drogas quimioterápicas que atuem como adjuvantes das terapias atualmente utilizadas é cada vez mais empregado (Dahanukar e Thatte, 1997; Virk-Baker et al., 2010).
Considerando o potencial risco toxicológico de acrescentar uma nova droga quimioterápica ao tratamento, o foco das terapias adjuvantes é fazer uso de uma segunda droga que aumente o potencial anticâncer do primeiro quimioterápico, mas que reduza sua toxicidade (Virk-Baker et al., 2010). Neste contexto, os fitoestrógenos consistem em compostos de particular interesse para uso na terapia adjuvante, pois além de atuar como SERMs, também possuem papel de destaque em processos de inibição da inflamação, angiogênese e metástase (Virk-Baker et al., 2010). Assim, além das vantagens óbvias dos fitoestrógenos como modulares da ação sobre os receptores de estrógenos, estes desempenham outros papéis benéficos e de interesse para a terapia anticâncer.
Apesar das vantagens e conveniências de estudos in vitro, e da relevância dos estudos in vivo, ambos não revelam diretamente os possíveis mecanismos de ação de compostos ativos (Harvey & Cree, 2010). Desse modo, faz-se necessário o uso de técnicas adicionais para predizer ou confirmar o alvo de ação das moléculas de interesse.
A atividade de uma determinada droga é obtida através da interação molecular de uma molécula (ligante) ao sítio ativo de uma outra molécula (receptor), geralmente maior e que comumente consiste de uma proteína. Na interação conformacional, as moléculas devem apresentar complementaridade geométrica e química, sendo ambas essenciais para a completa atividade da droga. A ferramenta computacional de busca por um ligante capaz de ligar tanto geometricamente quando energeticamente em um sítio de ligação de uma proteína é denominada docking molecular (Teodoro et al., 2001).
A técnica de docking molecular tria diversas moléculas em relação à capacidade destas ligarem-se ligarem-seletiva e eficazmente em um sítio de ligação de uma proteína. De maneira geral, a técnica de docking molecular é utilizada para responder a duas perguntas: (1) Quais moléculas de minha coleção do banco de dados possuem encaixe (são ativas) no sítio de ligação do receptor de interesse e (2) A conformação do complexo formado pelo ligante-receptor (Figura 4).
9 Figura 4: Objetivos da técnica de docking molecular: predizer a possibilidade de interação de moléculas de um banco de dados a um receptor de interesse (A) e avaliar a força de formação dos complexos ligante-receptor (B). Fonte: adaptado da apresentação de Dr. Sander B. Nabuurs, Computational Drug Discovery group, Center for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud University Medical Centre, “Virtual screening and molecular docking”, disponível no endereço eletrônico http://swift.cmbi.ru.nl/teach/B1SEM/HTML/fleksy.pdf.
Tal técnica in silico se trata, portanto, de importante ferramenta para predição de compostos ativos promissores que podem ser utilizados tanto para obtenção de novas drogas como para otimização de drogas já existentes, podendo aumentar a eficácia de uma droga 10 a 1000 vezes (Irwin et al., 2002; Schoichet et al., 2002).
Reforça-se a necessidade de uma abordagem multidisciplinar para a descoberta e desenvolvimento de novas drogas, que envolva a criação de uma diversidade de novos compostos moleculares provenientes de produtos naturais, em combinação com metodologias sintéticas e semi-sintéticas. Tal abordagem com múltiplas frentes de pesquisa consiste na melhor solução para aumentar a
10 produtividade e a possibilidade de descoberta de novas drogas. O CPQBA, associado em trabalhos de colaboração com outros institutos da Unicamp, possibilita a estrutura organizacional necessária para viabilizar o caráter pluridisciplinar deste projeto, onde grande parte da pesquisa é realizada de maneira integrada, envolvendo diversas frentes de atuação.
Uma vez que a goiaba consiste em uma espécie vegetal com diversos usos tradicionais e atividades biológicas interessantes, mas cuja atividade anticâncer ainda não foi avaliada nem comprovada cientificamente, este projeto teve como escopo avaliar o potencial da espécie vegetal e dos princípios ativos dela isolados em cultura de células tumorais in vitro e também in vivo no modelo murino de tumor sólido de Ehrlich. A potencial atividade hormonal dos princípios ativos guajadial e psidial A também foram avaliados por docking molecular, de forma a predizer a possível interação destes compostos ao receptor de estrógeno, atuando, portanto, como fitoestrógenos.
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OBJETIVOS
Objetivo geral:
Avaliar a atividade anticâncer in vitro e in vivo de extratos brutos, frações ativas e princípios ativos obtidos a partir de folhas de Psidium guajava L. (goiabeira).
Objetivos específicos:
Coleta do material vegetal (folhas de P. guajava L.) e obtenção dos extratos brutos;
Fracionamento do extrato ativo por biomonitoramento;
Isolamento e identificação dos princípios ativos;
Avaliação da atividade antiproliferativa in vitro, em cultura de células tumorais humanas;
Avaliação da atividade anticâncer in vivo utilizando animais de laboratório;
Avaliação in silico da atividade hormonal dos princípios ativos isolados;
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MATERIAIS E MÉTODOS
1. Metodologia fitoquímica
1.1: Coleta do material vegetal
O material vegetal utilizado neste projeto – partes aéreas (folhas) de Psidium guajava L. (Myrtaceae), 4,5kg - foram obtidos no campo experimental do CPQBA - Unicamp, com o auxílio da Divisão de Agrotecnologia. A exsicata desta espécie vegetal encontra-se no Herbário do CPQBA - Unicamp sob CPMA (número de entrada na coleção) 1814 e número de exsicata 1335.
1.2: Extração do óleo essencial
Folhas da espécie P. guajava L. foram coletadas no campo experimental do CPQBA – Unicamp. Uma pequena alíquota deste material a fresco (75g) foi separada para extração do óleo essencial (OE), técnica realizada através de hidrodestilação em sistema Clevenger por 48h.
O método de obtenção de óleos essenciais por hidrodestilação é simples e consiste em um sistema onde a matéria prima é colocada juntamente com água. O balão contendo a mistura é ligado a um condensador por onde há fluxo de água para refrigeração. A mistura água e matéria prima são aquecidas diretamente por manta de aquecimento. O vapor produzido na destilação condensa-se no condensador e é recolhido. A separação se faz facilmente pelo fato do óleo e água não serem miscíveis.
1.3: Extração e isolamento de princípios ativos
O restante das folhas foram secas e moídas de modo a possibilitar o processo de extração com diferentes solventes orgânicos. O teor de umidade da espécie vegetal foi calculado através da secagem de uma alíquota das folhas em estufa da Divisão de Agronomia (CPQBA – Unicamp), a 105ºC por 24h, até ficarem em estado quebradiço. O material vegetal seco e moído das folhas de P. guajava foi extraído a quente pelo método Soxhlet, na proporção 1:5 (planta:solvente), com diclorometano (CH2CL2) e etanol
(EtOH) 95%, na Divisão de Fitoquímica do CPQBA - Unicamp.
O extrato bruto diclorometânico (EBD), extraído por 72h, foi recolhido e rotaevaporado, sob vácuo, a 40ºC até a completa eliminação do solvente. Os resíduos vegetais deste processo de extração foram utilizados para o processo de extração com etanol 95%, na mesma proporção por 72h. O extrato
13 bruto etanólico (EBE) foi liofilizado depois de rotaevaporado. Os rendimentos de extração foram calculados (massa de extrato obtida/massa de planta seca utilizada) e alíquotas de 10-20mg de cada extrato bruto obtido foram separadas para o teste in vitro em cultura de células tumorais humanas, realizado pela Divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA - Unicamp.
Do óleo essencial (OE) obtido das folhas frescas da P. guajava e dos dois extratos brutos obtidos a partir das folhas secas, apesar do EBE apresentar maior rendimento (%), o EBD apresentou melhor atividade anticâncer in vitro, sendo então escolhido para dar continuidade aos processos de fracionamento, utilizando-se diferentes técnicas fitoquímicas. As etapas de extração e isolamento do princípio ativo de P. guajava L. constam no fluxograma daFigura 5.
Figura 5: Fluxograma do processo de extração e isolamento de princípios ativos do material vegetal (folhas) de P. guajava L.
14 A extração a quente em aparelho Soxhlet é utilizada sobretudo para extrair componentes vegetais com solventes voláteis. Em cada ciclo de operação, o material vegetal entra em contato com o solvente renovado, uma vez que este passa pela amostra vegetal no extrator de Soxhlet e retorna ao balão em aquecimento, num sistema fechado. Desse modo, a técnica é altamente eficiente, empregando uma quantidade relativamente reduzida de solvente, em comparação com as quantidades necessárias nos outros processos extrativos, para se obter os mesmos resultados qualitativos e quantitativos (Simões
et al., 2007).
As técnicas cromatográficas empregadas na purificação dos extratos brutos consistiram de colunas filtrantes e clássicas (Figura 6). Tais procedimentos fitoquímicos tratam-se de métodos físico-químicos de separação, no qual os compostos presentes em uma amostra são distribuídos entre uma fase estacionária e uma fase móvel. A separação ocorre porque os compostos têm diferentes afinidades com a fase estacionária e com a fase móvel, de acordo com sua polaridade e, portanto, deslocam-se com diferentes velocidades na coluna.
Figura 6: Fotos dos processos fitoquímicos empregados para o fracionamento do extrato bruto, por coluna filtrante (a esquerda) e coluna clássica (a direita). Proporção amostra:sílica na coluna filtrante 1:3, na coluna clássica 1:30.
15
1.4: Análises químicas dos princípios ativos
Diversas técnicas químicas foram utilizadas para identificação e caracterização do princípio ativo isolado de P. guajava L., a saber: GC-MS, GC-Tof, RMN-1H, e rotação óptica. A técnica de GC-MS (Gas
Chromatography Mass Spectrometry) foi utilizada para identificação química dos compostos presentes
nas frações ativas (avaliadas em teste antiproliferativo in vitro) e também identificação dos princípios ativos. Alíquotasdas amostras de 10-20mg foram analisadas nas condições da Série AA (injetor: 250ºC; detector: 300ºC; coluna: 110ºC – 280ºC, elevando a temperatura em 5ºC/min, permanecendo em 280ºC por 26min, tempo de corrida 1h, gás de arraste He, fluxo de arraste 1ml/min), com uma Coluna Phenyl Methyl Siloxane HP-5MS 5% (30cm x 0,25mm x 0,25µm), realizados no LINST (Laboratório de Instrumentação) da Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica, do CPQBA – Unicamp.
A técnica de GC-TOF (Gas Chromatography Time of Flight Mass Spectrometry), RMN-1H (Ressonância Magnética Nuclear) e rotação óptica foram realizadas através de colaboração com o Laboratório ThoMSon, Instituto de Química (IQ), Unicamp. As análises de GC-Tof foram realizadas com uma coluna HP-5MS (30cm x 0,25mm x 0,25µm), volume de injeção 1µl, ti = 1min, 220oC, temperature 3oC a 300oC. Os dados de RMN-1H foram realizados num aparelho Bruker, sendo a amostra diluída em clorofórmio deuterado. A rotação óptica foi realizada através do equipamento Perkin-Elmer, Polarimeter 341, na concentração de 2.2700g/100ml.
2. Metodologia farmacológica
2.1: Ensaios in vitro:
Atividade anticâncer em cultura de células tumorais humanas
A avaliação da atividade anticâncer foi realizada frente a um painel de onze linhagens tumorais humanas, cedidas pelo National Cancer Institute (NCI, nos Estados Unidos), discriminadas na Tabela 2, Seguiu-se protocolo utilizado pelo NCI e descrito por Monks et al. (1991).
16 Tabela 2: Relação das linhagens tumorais humanas utilizadas no teste in vitro para avaliação da atividade anticâncer dos extratos brutos e frações.
Linhagem celular Origem histológica Tipo celular d.i. (células/ml)
1 MCF-7 Mama Tumoral 6 x 104
2 OVCAR-3 Ovário Tumoral 7 x 104
3 NCI-ADR Ovário resistente a múltiplas drogas Tumoral 5 x 104
4 PC-3 Próstata Tumoral 5 x 104
5 786-0 Rim Tumoral 4,5 x 104
6 UACC-62 Melanoma Tumoral 5 x 104
7 HT-29 Cólon Tumoral 4 x 104
8 NCI-460 Pulmão Tumoral 4 x 104
9 U-251 Glioma Tumoral 5 x 104
10 K562 Leucemia Tumoral 4 x 104
11 VERO Rim Normal 5 x 104
Obs: d.i. = densidade de inoculação das linhagens celulares.
A avaliação da atividade anticâncer in vitro foi feita através do plaqueamento de 100µl de células/compartimento em placas de 96 compartimentos, homogeneizadas em meio RPMI/SFB/PEN-STREP (meio RPMI acrescido de soro fetal bovino e os antibióticos penicilina e streptomicina), nas suas respectivas densidades de inoculação (Tabela 2), determinadas pela Divisão de Farmacologia e Toxicologia, CPQBA – Unicamp. Foram avaliadas cinco amostras distintas por placa tratada, sendo que cada placa contém apenas uma linhagem celular. A placa T0 contém as 11 linhagens celulares numa só
placa (Figura 7). Após o plaqueamento celular nas placas tratadas, estas foram incubadas em estufa por 24h a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 em ambiente úmido, para conseguinte adição das amostras a
serem testadas.
Figura 7: Esquema da placa T0,
utilizada como controle durante o teste antiproliferativo in vitro. As letras e números representam abreviaturas das linhagens celulares, a saber: 2 = U-251, U = UACC-62, M = MCF-7, A = NCI-ADR, 7 = 786-0, 4 = NCI-460, P = PC-3, O = OVCAR-3, H = HT-29, K = K562, V = VERO.
17 As amostras foram diluídas em dimetilsulfóxido de sódio (DMSO) na proporção 1:10 (1mg amostra: 10 µl DMSO). Para a adição na cultura de células, estas soluções foram diluídas pelo menos 400 vezes em RPMI/5%SFB/PEN-STREP, evitando-se assim a toxicidade do DMSO. A placa controle T0
foi fixada pela adição de 50 l/compartimento ácido tricloroacético 50% (TCA) para determinação da quantidade de proteínas 24hs após o plaqueamento das células (ou seja, no momento da adição das amostras).Nas placas tratadas, as amostras foram adicionadas nasconcentrações de 250; 25; 2,5 e 0,25
g/ml, em diluição seriada, com 100 l/compartimento e em triplicata (Figura 8), e a seguir incubadas por 48 horas.
Figura 8: Modelo de placa tratada com 5 amostras a serem testadas, em diluição seriada de 250; 25; 2,5 e 0,25 g/ml.
Como controle positivo utilizou-se o quimioterápico doxorrubicina, nas concentrações de 0,025; 0,25; 2,5 e 25 g/mL, 100 l/compartimento e em triplicata. Após este período, as células foram fixadas com 50 l de ácido tricloroacético (TCA) 50%. Para completar a fixação celular, as placas foram incubadas por 1 hora a 4ºC e, em seguida, submetidas a quatro lavagens consecutivas com água destilada, para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários. Após lavagem, as placas foram mantidas em temperatura ambiente até a secagem completa.
As placas foram então coradas pela adição de 50l/compartimento do corante protéico sulforrodamina B (SRB) (Sigma Chemical Co®, St. Louis, MO, USA) a 0,4% e incubadas por 30 minutos a
18 4ºC. Após esse período, as placas são lavadas por 4 vezes consecutivas com solução de ácido acético (CH3COOH) 1%. Após secagem à temperatura ambiente, as proteínas celulares ligadas ao corante SRB
foram solubilizadas com solução de Trizma Base (10M, pH 10,5), para realização da leitura das placas. A leitura espectofotométrica da absorbância foi realizada em 540 nm em leitor de microplacas (ELISA, Molecular Devices®, modelo Versa Max), pelo programa Soft Max Pro 4.0. A sobrevivência das células tumorais foi avaliada pela porcentagem de absorbância destas comparada à porcentagem de sobrevivência da placa controle (placa T0, não tratada). A sulforrodamina B é um corante protéico que se
liga aos aminoácidos básicos das proteínas de células que estavam viáveis no momento da fixação. Por isso, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao compartimento, menor a atividade citotóxica da amostra em teste (Skehan et al., 1990). A Figura 9 representa de forma esquematizada o método empregado para os testes in vitro das amostras obtidas a partir das espécies vegetais.
Figura 9: Fluxograma do método utilizado nos testes in vitro para avaliação da atividade anticâncer da espécie vegetal selecionada (Psidium guajava L.).
Com as porcentagens de crescimento calculadas, foram elaborados gráficos da porcentagem de crescimento ou morte celular versus concentração da amostra. O quimioterápico doxorrubicina foi utilizado como controle positivo. Os valores abaixo de 100 e acima de zero representam inibição de crescimento (atividade citostática), sendo que os valores que atingem o zero representam inibição total de crescimento (TGI = total growth inhibition). Os valores negativos (abaixo de zero) representam morte celular (atividade citotóxica), pois a quantidade de células (aferida pela absorbância no final do experimento), nesse caso, é menor do que aquela que iniciou o experimento (absorbância do T0).
Além disso, a partir gráficos de crescimento celular em função da concentração de amostra, calculou-se o TGI (total growth inhibition), utilizando-se o programa Origin 7.5. Os valores de TGI, expressos em µg amostra/ml, mantêm uma relação inversamente proporcional à seletividade da amostra
19 para determinada linhagem tumoral, uma vez que valores reduzidos de TGI indicam maior seletividade e poder de inibir totalmente o crescimento de determinada linhagem.
2.2: Ensaios in vivo:
Atividade anticâncer em animais de laboratório
Foram utilizados camundongos fêmeas das linhagens Balb/C, de 3 meses de idade, para realização do modelo murino do tumor sólido de Ehrlich, cujo protocolo experimental foi aceito pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA-Unicamp) sob número de protocolo 1810-1.
O tumor de Ehrlich foi mantido na forma ascítica através de repiques semanais em camundongos doadores. Semanalmente, o fluido ascítico era retirado de animais portadores desse tumor e imediatamente inoculado na cavidade peritoneal de animais receptores de mesma linhagem, para posteriormente atuarem como animais doadores das células de Ehrlich inoculadas na forma sólida (Figura 10). Após inoculação, os animais receptores eram mantidos em isoladores individuais devidamente identificados com água e ração ad libitum.
Figura 10: Manutenção das células do Tumor de Ehrlich, na forma ascítica, para posterior crescimento na forma sólida (adaptado de Ferreira, 2006).
O teste de tumor sólido de Ehrlich teve duração de 21 dias, com 7 animais (camundongos Balb/C fêmeas) por grupo, com as doses determinadas previamente a partir de testes de toxicidade. Foram inoculadas 2,5 x 106 células do Tumor Ehrlich no coxim plantar da pata posterior direita dos camundongos. O número de células tumorais para inoculação na forma sólida foi obtido através de contagem direta das células obtidas a partir do líquido ascítico, na câmara de Neubauer. O tratamento foi administrado por via intraperitoneal, a cada 3 dias, a partir do 3o dia após a inoculação das células.
20 Um grupo salina 0,9% foi utilizado como controle negativo (G1), um grupo doxorrubicina 3 mg/kg foi o controle positivo (G2), e outros 3 grupos foram tratados com a fração enriquecida de goiaba PG.(F2-F3).(F6-F9) nas doses de 10, 30 e 50mg/kg (G3, G4 e G5, respectivamente). No dia da inoculação das células (D0), a cada dia de tratamento (D3, D6, D9, D12, D15 e D18) e no dia do sacrifício (D21), foram analisados o peso dos animais e o volume do tumor (com auxílio de Pletismômetro Digital, WE7500, Panlab), assim como a taxa de sobrevivência de animais/grupo. Ao final do experimento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os órgãos coletados (cérebro, estômago, fígado, rim, coração, pulmão, baço, útero), assim como as patas afetadas pelo tumor, para avaliação macroscópica de sinais de toxicidade e avaliação de peso. A partir dos parâmetros avaliados durante os 21 dias de teste, foram feitas as seguintes avaliações: volume tumor/dia, peso bruto do tumor (peso animais/dia), peso relativo do tumor (peso tumor/peso animais). A variação de peso e diferenças no tamanho do tumor foram analisadas estatisticamente através do Teste de Duncan (p<0,05). A Figura 11 representa um esquema do modelo experimental seguido, com o dia de início do teste (D0), dias de tratamento (D3, D6, D9, D12, D15 e D18) e o dai de sacrifício (D21).
Figura 11: Esquema do modelo experimental in vivo utilizado no tumor sólido de Ehrlich.
Uma vez constatada a semelhança entre o efeito da fração ativa de goiaba PG.(F2-F3).(F6-F9) com o mecanismo de ação do tamoxifeno, repetiu-se o experimento de tumor sólido de Ehrlich, no mesmo esquema de tratamento apresentado na Figura 11, mas utilizando-se o tamoxifeno - além da doxorrubicina - como controle positivo. Estabeleceu-se os seguintes grupos experimentais: G1 = Controle negativo (veículo, salina), G2 = Controle positivo (doxorrubicina 3mg/kg), G3 = Controle positivo (tamoxifeno 10mg/kg), G4 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 10mg/kg, G5 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 30mg/kg, G6 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 10mg/kg + tamoxifeno, G7 = PG.(F2-F3).(F6-F9) 30mg/kg + tamoxifeno.
21
3. Metodologia de docking molecular in silico
Guajadial e psidial A foram utilizados como ligantes ao receptor de estrógeno α e β (ERα e ERβ,
respectivamente). A estrutura das moléculas de estradiol e do tamoxifeno foram obtidas a partir banco de dados Hetero-compound Information Centre Uppsala (Hic-up) e suas propriedades de ligação ao receptor foram utilizadas como controles para estudos in silico, uma vez que a interação destes com o receptor já é conhecida. A estrutura dos princípios ativos guajadial e psidial A foi obtida a partir do Cambrige
Crystallographic Data Centre (CCDC). Foram utilizadas as estruturas das isoformas ER-α e ER-β,
depositadas no Protein Data Bank (PDB), com código de acesso 2FJ9 e 3OLL, respectivamente.
O software Molegro Virtual Docker (MDV, Thosen and Christensen, 2006) foi empregado para as simulações de docking. Foi utilizado 0.30 Å como grid, 15 Å radius a partir do molde como sítio de ligação, MolDock SE as como algoritmo de busca. O processo foi repetido 10 vezes e o número máximo de interações ajustado para 1500. Após cada simulação de docking, minimização de energia e otimização de pontes de hidrogênio foram realizadas.
O algoritmo utilizado pelo MVD no docking molecular resulta em resultados cujos valores (scores) não são exatatamente os mesmos (Sivaprakasam et al., 2009). De maneira a aumentar a acurácia dos resultados, 10 simulações consecutivas foram conduzidas, e os maiores valores de score de cada simulação foram utilizados para calcular o score médio de cada ligante, em cada encaixe possível, sendo MolDock e Rerank tendo sido empregados para selecionar o melhor encaixe de cada ligante.
Para a análise da plausibilidade dos complexos gerados pelo MVD, estes foram submetidos a avaliação dos servidoresDrugScore (Velec et al., 2005) e PEARLS (Han et al, 2006). DrugScore avalia a distância interatômicas entre ligante-receptor e o score obtido é resultado da soma das interações entre o ligante e o receptor. PEARLS („Program for Energetic Analysis of Receptor-Ligand System‟) tem o cálculo baseado na energia de interação entre o ligante e o receptor considerando as ligações intermoleculares de Van der Walls, eletrostáticas e pontes de hidrogênio num campo de força AMBER. Os valores gerados por ambos os softwares foram utilizados para calcular a afinidade relativa. A energia de afinidade entre o estradiol e o receptor de estrógeno foi normalizada para 1 e os valores de score representam a afinidade de ligação predita para o composto em questão em relação ao estradiol, sendo um valor relativo e não absoluto.
Para todas as análises foram realizadas 10 corridas nos respectivos programas, e utilizou-se como score dos complexos a média entre tais corridas. O complexo ligante-receptor tido como correto foi
22 aquele que apresentava menor energia de formação, ou seja, de conformação mais favorável. A Figura 12 apresenta de forma esquematizada a técnica de docking molecular.
Figura 12: Representação esquemática da técnica de docking molecular. Moléculas provenientes de um banco de dados são testadas em determinado sítio de ligação, conformacional e configuralmente (sampling), e a força de interação dos complexos ligante-receptor avaliados (scoring). Fonte: adaptado da apresentação de Dr. Sander B. Nabuurs, Computational Drug Discovery group, Center for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud University Medical Centre, “Virtual screening and molecular docking”, disponível em http://swift.cmbi.ru.nl/teach/B1SEM/HTML/fleksy.pdf.
4. Metodologia imunohistoquímica
Com o intuito de avaliar os índices de proliferação celular e apoptose no tumor utilizado como modelo animal in vivo, secções transversais das patas com tumor sólido de Ehrlich e tratados com a fração ativa de P. guajava PG.(F2-F3).(F6-F9) foram avaliados por imunohistoquímica para reação de PCNA e TUNEL in situ,
4.1: Avaliação da proliferação celular (PCNA)
Três secções transversais/grupo das patas com tumor sólido de Ehrlich, fixadas em paraformoldeído 4% tamponado, incluídas em parafina e seccionadas com 5 µm de espessura foram
23 submetidas à técnica de detecção de PCNA (anticorpo monoclonal de camundongo, clone PC-10, Santa Cruz Biotechnology). Para reativação antigênica utilizou-se pré-tratamento com tampão citrato pH 6,0 a 95oC por 30min. Para bloqueio das reações inespecíficas e da peroxidase endógena foram utilizados o BSA 2% e a água oxigenada 3%, respectivamente. As secções histológicas foram incubadas com anticorpo primário overnight a 4oC, sendo a diluição 1:100. O sistema de revelação secundário utilizado foi o kit da Dakocytomation LSAB (anticorpo secundário de cabra conjugado com biotina e estreptavidina conjugada com peroxidase), sendo as marcações visualizadas com diaminobenzidina (DAB) e contra-coradas com hematoxilina. Para controle negativo, uma das lâminas não recebeu o anticorpo primário.
As células PCNA+ (de coloração acastanhada) foram quantificadas por uso de gratícula de área de 100 mm2, com 441 pontos eqüidistantes, acoplada a microscópio de luz, em 15 campos aleatórios/animal e ampliação de 40x, sendo os resultados apresentados como no total de células PCNA+/no total de célula (células marcadas + não marcadas), sempre contadas na intersecção dos 441 pontos (Figura 13).
4.2: Avaliação de apoptose (TUNEL in situ)
Com o intuito de verificação da presença de apoptose no tumor utilizado como modelo animal, utilizou-se secções transversais das mesmas amostras usadas na reação de detecção de PCNA. As secções transversais das patas com tumor sólido de Ehrlich (3 lâminas/grupo) foram submetidas à técnica de TUNEL in situ (do inglês, Terminal eoxynucleotidyl transferase Urydine Nick End Labeling –
Marcação de extremidade fragmentada do genoma pela enzima transferase terminal de deoxinucleotídeos) (Kit ApopTag®, Millipore) seguindo protocolo do fabricante para identificação da fragmentação do DNA das células em apoptose. Antes da reação, os cortes foram lavados em PBS e Figura 13: Gratícula utilizada para contagem das células PCNA+ em secções transversais do Tumor Sólido de Ehrlich. As cabeças de setas indicam exemplos de células marcadas nas intersecções dos 441 pontos da gratícula.
24 tratados com proteinase K (20 µg/ml) por 15 minutos e, posteriormente, com água oxigenadas 3% por 30 minutos para permeabilização e inativação da peroxidase endógena. As secções histológicas foram incubadas com mistura da enzima TdT (terminal deoxynucleotides transferase) e deoxinucleotídeos conjugados com digoxigenina em câmara úmida a 37oC por 1h. Posteriormente, os cortes receberam solução de anti-digoxigenina conjugada com peroxidase em câmara úmida a temperatura ambiente por 30 minutos. Após lavagem com tampão PBS, a reação da peroxidase foi revelada com diaminobenzidina (DAB) durante 6min à temperatura ambiente e os corte foram contra-corados com hematoxilina. Para controle-negativo, uma das lâminas não recebeu o tratamento com TdT e deoxinucleotídeos. As células apoptóticas que apresentaram reação TUNEL+ apresentam coloração acastanhada, sendo facilmente identificadas em meio às células TUNEL-. Para quantificação das áreas de necrose foram obtidas imagens digitais das lâminas das patas com tumor sólido de Ehrlich utilizando-se sistema de análise de imagens Image-Pro Plus Express e câmera Q Color 3-Olympus acoplada ao microscópio Olympus BX51. Cada lâmina foi dividida em 4 grandes campos, em aumento de 2,0x, de modo a abordar toda a área da secção transversal (Figura 14). Uma vez fotografados os campos, a porcentagem de área necrótica/área total (An/At) foi avaliada pelo programa Image Pro-Plus 4.0, através de análise dos pixels. Uma vez diferenciado por cores as diferentes áreas, calculou-se a relação de An/At, expresso em porcentagem. As áreas de necrose foram expressas em média e erro padrão e as médias foram comparadas através de análise de variância ANOVA, seguido de teste de Duncan, com p<0,05.
Figura 14: Programa Image Pro-Plus 4.0, utilizado para avaliação da porcentagem de An/At nas secções transver- sais de tumor sólido de Ehrlich, através da análise de pixels (Imagem proveniente do programa Image Pro-Plus 4.0).
