A descoberta dos fármacos antimicrobianos trouxe inestimáveis benefícios para a humanidade. Muitas doenças consideradas incuráveis e letais no passado podem ser tratadas com o uso de medicamentos. Em 1927, o cientista Alemão Gerhard Domagk observou que uma tinta vermelha chamada Prontosil apresentara atividade germicida e, desde então, conheceu-se a atividade antimicrobiana de derivados da sulfa. Mais tarde, em 1938, uma equipe britânica liderada por A. J. Evans desenvolveu a sulfadiazina (World Health Organization- WHO, 2000). A descoberta de Alexander Fleming, em 1928, dos efeitos antibióticos de uma substância produzida por fungos, depois conhecida como penicilina, teve tamanha importância que a substância foi chamada pelos cientistas da época de “droga milagrosa”. Depois, foram descobertos a estreptomicina, quinolonas, antifúngicos, antiparasitários e antivirais, drogas conhecidas coletivamente como antimicrobianos e que salvaram milhões de vidas (WHO, 2000).
Um grande problema relacionado aos antimicrobianos é a seleção de micro- organismos resistentes que, embora possa ser minimizada com o uso racional, é inevitável (WEBER E COURVALIN, 2005). A resistência às drogas trata-se de um fenômeno evolutivo natural. Assim, a necessidade de novos antimicrobianos é constante (HARBARTH E SAMORE, 2005). No entanto, as grandes indústrias farmacêuticas têm preferido investir no desenvolvimento de fármacos para o tratamento de doenças crônicas, as quais são mais prevalentes entre os idosos. Medicamentos antimicrobianos são utilizados, geralmente, em tratamentos curtos e os fármacos recém-desenvolvidos costumam ser reservados para casos em que outros antimicrobianos falharam o que são desestímulos econômicos para a indústria (SPELLBERG et al., 2004; TALBOT et al., 2006). O baixo investimento para o desenvolvimento de novas classes de antimicrobianos pode causar sérias consequências no futuro. Corre-se o risco de não haver drogas disponíveis para o tratamento de doenças causadas por patógenos que tendem a se tornar naturalmente resistentes (SPELLBERG et al., 2004).
A resistência aos antimicrobianos e sua disseminação global foram o tema selecionado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para o Dia Mundial da Saúde (7 de abril) em 2011 (WHO, 2011). A agência alertou sobre a necessidade de ações para que a cura de doenças infecciosas seja possível no futuro. Dentre essas ações está a criação de incentivos para o desenvolvimento de novos antimicrobianos. A diminuição da diversidade de novos antibióticos foi relatada. A maioria dos antibacterianos que entraram no mercado nas últimas décadas foram frutos de modificações de moléculas existentes e não de novas classes de fármacos (SPELLBERG et al., 2004; WEBER E COURVALIN, 2005).
No Brasil, foi adotada recentemente uma importante medida na tentativa de coibir o uso indiscriminado de antimicrobianos e, consequentemente, diminuir a propagação da resistência a esses fármacos. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) emitiu a resolução RDC 44/2010 que foi substituída pela RDC 20/2011 que determina que a comercialização de alguns antimicrobianos em farmácias e drogarias seja feita com retenção da receita médica. Na RDC 20/2011 é descrita uma lista com 119 fármacos e os medicamentos que contêm algum deles devem ser comercializados com retenção da receita.
Buscando a identificação de novas substâncias com atividade antimicrobiana, extratos e compostos obtidos a partir de folhas de Maytenus robusta foram submetidos a testes frente a micro-organismos.
2.2.2 – Teste antimicrobiano
O teste foi realizado pelo grupo da Professora Drª Jacqueline Aparecida Takahashi no Laboratório Biotecnologia e Bioensaios, do Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais. Para a realização dos experimentos foram utilizadas culturas da bactéria Gram-negativa Salmonella typhimurium ATCC 13311, das bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Bacillus cereus ATCC 11778 e do fungo leveduriforme Candida albicans ATCC 18804.
2.2.2.1 – Avaliação da atividade antimicrobiana em ensaio de microplaca Os testes foram realizados em meio de cultura caldo BHI (Broth Heart Infusion) utilizando placas de microtitulação e um leitor de microplaca. Avaliou-se a inibição do crescimento dos micro-organismos desafiados comparando a turbidez do meio com aquela obtida no meio em que não houve adição dos compostos (controle positivo: inóculo + meio BHI). Utilizou-se uma única concentração de cada uma das amostras testadas. Fez-se uma triagem da atividade antimicrobiana de extratos, sólidos obtidos durante a remoção do solvente na preparação dos extratos, misturas de triterpenos pentacíclicos e de um composto puro.
2.2.2.2 – Metodologia
O sólido do extrato hexânico das folhas (SEHF), o sólido do extrato clorofórmico das folhas (SECF), o extrato clorofórmico das folhas (ECF), o extrato acetato etílico das folhas (EAF), o extrato metanólico das folhas (EMF), uma mistura de triterpenos isolada a partir de SEHF: 3-oxo-11β-hidroxifriedelano e 3-
oxo-29-hidroxifriedelano (MR03 e MR04), um triterpeno e duas misturas de triterpenos isolados a partir de EHF: 3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno (MR10),
mistura de ácido 3,4-seco-21β-H-hop-22(29)-en-3-óico e ácido 3,4-seco-friedelan-
3-óico (MR12 e MR13) e mistura de ácido 3,4-seco-friedelan-3-óico e sistosterol (MR13 e MR14) foram testados contra Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Candida albicans (Tabela 16, pág. 115).
As bactérias e a levedura foram mantidas em infuso de cérebro e coração (BHI), sob refrigeração a 7 ⁰C. Os micro-organismos foram reativados em BHI e um inóculo de cada um foi padronizado em espectrofotômetro para uma concentração final de 1,87x105 UFC/mL (3,75x104 UFC/poço). O bioensaio foi realizado em placas de microtitulação, para todos os compostos, em quintuplicata. Os compostos, exceto MR10, foram adicionados aos poços na concentração de 2000 µg/mL (em DMSO) (200 µg/poço) sendo a sua concentração final 1000 µg/mL, em BHI e, em seguida, 100 µL do inóculo bacteriano foram
DMSO) (50 µg/poço) sendo a sua concentração final 250 µg/mL, em BHI e, em seguida, 100 µL do inóculo bacteriano foram adicionados. As placas foram incubadas a 35 ºC por 24 e 48 h. Controles positivo (inóculo + meio BHI) e negativo (meio BHI) foram testados simultaneamente. A percentagem de inibição de crescimento bacteriano foi determinada utilizando um leitor de microplaca TP-reader (Thermoplate, Brasil).
Tabela 16: Amostras utilizadas no teste antimicrobiano
O grau de resistência ou sensibilidade das bactérias e da levedura frente às amostras testadas foi determinado pela presença ou ausência de inibição, quanto maior a inibição menor a turbidez do meio. Os resultados encontrados para as amostras testadas na primeira e segunda leitura, 24 e 48 h, estão apresentados na forma de Tabelas (Tabelas 17 a 18, pág. 116 e 117). Os testes foram realizados em quintuplicata e nas tabelas estão descritos as médias dos valores de % de inibição, o desvio padrão e o coeficiente de variação. A percentagem de inibição foi calculada a partir da comparação das médias de absorção das amostras com o branco.
2.2.2.3 – Resultados e discussão
As amostras SECF e EAF foram as mais promissoras frente aos micro- organismos testados. Nas leituras realizadas após 24 h, SECF apresentou alta
Amostra Composto Solubilidade
SEHF Sólido do extrato hexânico das folhas CHCl3
SECF Sólido do extrato clorofórmico das folhas CHCl3
ECF Extrato clorofórmico das folhas CHCl3 EAF Extrato acetato etílico das folhas CH3COOEt EMF Extrato metanólico das folhas MeOH
MR03 + MR04 3-oxo-11β-hidroxifriedelano + 3-oxo-29-hidroxifriedelano CHCl3
MR10 3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno CHCl3
MR12 + MR13 ácido 3,4-seco-21β-H-hop-22(29)-en-3-óico +
ácido 3,4-seco-friedelan-3-óico CHCl3
inibição frente a S. aureus (100% ± 8%), C. albicans (100% ± 6%) e B. cereus (75% ± 1%).EAF apresentou 61% ± 6% de inibição sobreB. cereus e 59% ± 4% de inibição frente a S. typhimurium (Tabela 17). SEHF apresentou 86% ± 7% de inibição sobre C. albicans.
As amostras SEHF, ECF, EMF, MR03 + MR04, MR10 e MR13 + MR14 não apresentaram inibição frente a S. aureus na concentração testada após 24 h de incubação
Tabela 17: Percentagens de inibição para cada micro-organismo na primeira leitura (24 h), seguidas do desvio padrão e coeficiente de variação
S. aureus B. cereus S. typhimurium C. albicans
Amos- tra % Inibi- ção DP* CV ** (%) % Inibi- ção DP* CV ** (%) % Inibi- ção DP* CV ** (%) % Inibi- ção DP* CV ** (%) SEHF 0 --- --- 19 4 19 0 --- 86 7 8 SECF 100 8 4 75 1 1 48 1 2 100 6 3 ECF 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- EAF 36 7 19 61 6 10 59 4 7 32 4 14 EMF 0 --- --- 34 3 9 19 5 25 0 --- --- MR03 + MR04 0 --- --- 26 2 6 3 2 8 0 --- --- MR10 0 --- --- 17 2 14 0 --- --- 0 --- --- MR12 + MR13 26 3 11 41 3 6 25 1 4 25 1 4 MR13 + MR14 0 --- --- 27 7 26 9,9 0,8 8,3 0 --- ---
*DP – Desvio Padrão, **CV – Coeficiente de Variação (DP/média x 100%).
Nas leituras realizadas após 48 h (Tabelas 18, pág. 117), SECF apresentou 100% inibição frente a S. aureus e 100% inibição frente a C. albicans. No entanto, SECF não apresentou inibição sobre o crescimento de B. cereus como ocorreu na leitura após 24 horas.
EAF apresentou 66% ± 6% de inibição frente a S. aureus, 65% ± 6% de inibição sobreB. cereus, 71% ± 3% de inibição frente a S. typhimurium e 63% ±
3% de inibição frente a C. albicans. Ocorreu aumento na atividade de inibição de EAF sobre os micro-organismos testados após 48 h.
Portanto, SECF e EAF foram as amostras mais promissoras na triagem em relação à atividade antimicrobiana. Futuramente, SECF e EAF poderão ser fracionados e há possibilidade da atividade de inibição do crescimento ser atribuída a uma substância específica ou a um grupo de substâncias.
Tabela 18: Percentagens de inibição para cada micro-organismo na segunda leitura (48 h), seguidas do desvio padrão e coeficiente de variação
S. aureus B. cereus S. typhimurium C. albicans
Amostra % Inibi- ção DP* CV ** (%) % Inibi- ção DP* CV ** (%) % Inibi- ção DP* CV ** (%) % Inibi- ção DP* CV ** (%) SEHF 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- SECF 100 8 7 0 --- --- 0 --- --- 100 6 5 ECF 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- EAF 66 6 10 65 6 10 71 3 5 63 3 5 EMF 0 --- --- 0 --- --- 12 2 12 0 --- --- MR03 + MR04 6 2 19 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- MR10 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- 0 --- --- MR12 + MR13 48 2 5 0 --- --- 43 5 11 44 2 4 MR13 + MR14 28 3 8 0 --- --- 24 3 11 19 4 25