2.4.1 – Introdução
Artemia salina é um microcrustáceo da ordem Anostraca (sem carapaça) que vive em água salgada e é encontrado em várias regiões do mundo. A espécie é utilizada como alimento para peixes e outros crustáceos e seus ovos são facilmente encontrados em lojas para aquaristas. Os ovos não eclodidos são metabolicamente inativos e podem ser armazenados por longos períodos se mantidos desidratados (ANDRIOLLI et al., 2007). Após reidratação, os ovos de Artemia salina eclodem em cerca de 24 h, se em condições ambientais
Amostra Absorvância média sem adição de AChE Absorvância média após adição de AChE % Média de inibição *DP **CV Branco 0,419 1,006 - - - Eserina 0,345 0,385 94 1 1 SEHF 0,864 1,081 68 4 6 SECF 0,463 0,551 86 1 1 ECF 2,433 2,362 100 3 3 EAF 2,295 2,210 100 3 3 EMF 1,964 1,998 92 1 1 MR05 1,060 1,289 64 3 4 MR10 0,733 0,953 76 1 1 MR13 +MR14 1,646 1,648 94 1 1
adequadas, chegando à fase adulta com 20 a 30 dias de vida. O ciclo de vida curto favorece seu uso em testes de toxicidade aguda e crônica (ANDRIOLLI et al., 2007). O ensaio de toxicidade frente a Artemia salina é rápido, de baixo custo, simples e mostra correlação com atividade antitumoral (MEYER et al., 1982), sendo adequado para avaliação preliminar da atividade biológica de extratos vegetais (MCLAUGHLIN et al.,1993; SIQUEIRA et al., 2001).
Algumas espécies de Maytenus foram estudadas em relação à atividade antitumoral. A partir de M. diversifolia foram isolados maytansina e maytamprina, que apresentaram atividade contra células cancerígenas pulmonares A-549 (NIERO et al, 2011). Das cascas de raízes de M. chuchuhuasca foram isolados pristimerina, tingenona, 22-hidroxitingenona, celastrol, 6-oxopristimerol e 3-metil- 6-oxo-tingenol, ambos apresentaram atividade citotóxica e antitumoral que foram atribuídas à inibição da polimerização da tubulina (MORITA et al., 2008).
Extratos e um composto puro obtidos a partir das folhas de M. robusta foram submetidos à análise preliminar da atividade citotóxica através da avalição da atividade larvicida frente à Artemia salina.
2.4.2 – Método experimental, segundo Santos Pimenta e colaboradores (2003)
O teste foi realizado no Laboratório de Quimio e Biopropecção de Plantas do Cerrado (CerQBio), no Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais, sob a orientação da Professora Dra Lúcia Pinheiro Santos Pimenta. Para a realização dos testes preparou-se 1 L de solução salina, utilizando sal marinho sintético e água deionizada (38,0 g/L). Em 100 mL de solução salina foram adicionados cerca de 10 mg de ovos de Artemia salina e armazenou-se sob iluminação artificial a 28 ºC. A eclosão ocorreu após aproximadamente 24 horas. Preparou-se uma solução de lapachol, composto com comprovada ação citotóxica sobre Artemia salina, e soluções das amostras testadas (Tabela 21, pág. 129), utilizando DMSO como solvente. As amostras foram analisadas em 5 diferentes concentrações (µg/mL) e em triplicata (Tabela 22, pág. 129). Um grupo controle negativo foi preparado utilizando solução marinha contendo 1% de DMSO (v/v). As larvas no estágio Matanauplii (2º ínstar), foram adicionadas a tubos de ensaio contendo solução salina (38,0 g/L), utilizando pipeta automática. Foram
adicionadas aproximadamente dez larvas (250 µL) em cada tubo e, em seguida, adicionaram-se as amostras a serem testadas previamente solubilizadas em DMSO. O volume final nos tubos de ensaio foi 5 mL.
Tabela 21: Amostras submetidas ao ensaio de toxicidade frente à Artemia salina
Toda a bateria de ensaio foi mantida em local fresco durante 24 h. Após esse período fez-se a leitura, pela contagem de larvas sobreviventes e mortas, utilizando luz branca para visualização a olho nu. A determinação da DL50
com intervalo de confiança de 95% foi feita utilizando o método probitos de
análise. A média dos resultados obtidos para o lapachol nos ensaios foi DL50 = 56 µg/mL (46< DL50 <68).
Tabela 22: Concentração das amostras utilizadas no teste de toxicidade frente à Artemia salina
Amostra Composto
SECF Sólido do extrato clorofórmico das folhas
ECF Extrato clorofórmico das folhas
EAF Extrato acetato etílico das folhas
EMF Extrato metanólico das folhas
MR10 3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno Amostra Concentrações (µg/mL) SECF 1000 500 250 125 62,5 ECF 1000 500 250 125 62,5 EAF 1000 500 250 125 62,5 EMF 1000 500 250 125 62,5 MR10 500 250 125 62,5 31,25
2.4.3 – Resultados e discussão
De acordo com Meyer e colaboradores (1982), os extratos e as substâncias são considerados ativos quando a dose que mata 50% dos indivíduos (DL50) for menor do que 1000 µg/mL. MR10 (3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno), obtido a
partir do extrato hexânico das folhas de M. robusta, apresentou atividade larvicida sobre Artemia salina, a média dos resultados obtidos para essa substância nos ensaios foi DL50 = 529 µg/mL (288 < DL50 < 971). Para SECF, ECF, EAF e EMF, na maior concentração testada (1000 mg/mL), não houve mortalidade.
De acordo com Siqueira e colaboradores (1998), diversos trabalhos tentam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com atividades antifúngica, viruscida, antimicrobiana, parasiticida, tripanossomicida, entre outras. O que sugere que MR10 poderia ser submetida a outros tipos de ensaios biológicos.
Caso sejam obtidas substâncias puras em quantidades satisfatórias após o fracionamento de SECF, ECF, EAF e EMF, essas poderão ser submetidas ao teste de toxicidade frente a Artemia salina.
CONCLUSÃO
No estudo fitoquímico e da atividade biológica de constituintes das folhas de Maytenus robusta (Celastraceae) trabalhou-se com o extrato hexânico das folhas e com o sólido obtido durante a preparação desse extrato. Compostos foram isolados e tiveram sua estrutura química identificada utilizando métodos espectroscópicos tais como: infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono-13 (RMN de 13C, incluindo HMQC, HMBC, COSY, NOESY e DEPT). Testes de atividade biológica foram realizados utilizando os extratos e compostos isolados das folhas de M. robusta. Foram feitos testes de atividade antimicrobiana, de atividade de inibição da enzima acetilcolinesterase e de avaliação do potencial tóxico através da atividade larvicida sobre Artemia salina.
Realizou-se um fracionamento detalhado do extrato hexânico das folhas e do sólido obtido durante a preparação deste e foram isolados e identificados 14 compostos. Dentre eles, 3-oxofriedelano (MR01), 3β-hidroxifriedelano (MR02), a mistura de 3-oxo-11β-hidroxifriedelano e 3-oxo-29-hidroxifriedelano (MR03 e MR04), 3β,11β-di-hidroxifriedelano (MR05), a mistura de 3-oxofriedelano e 3-oxo- 21β-H-hop-22(29)-eno (MR01 e MR08), 3,4-seco-friedelan-3,11β-olídeo (MR09), 3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno (MR10), a mistura de ácido 3,4-seco-21β-H-hop- 22(29)-en-3-óico e ácido 3,4-seco-friedelan-3-óico (MR12 e MR13) e a mistura de ácido 3,4-seco-friedelan-3-óico e o esteróidesistosterol (MR13 e MR14). Dois desses compostos, 3β,11β-di-hidroxifriedelano (MR05) e 3,4-seco-friedelan-3,11β- olideo (MR09) são inéditos. Não foram encontrados na literatura dados de RMN de 13C para 3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno (MR10), 3-oxo-21β-H-hop-22(29)- eno (MR08), e para o ácido 3,4-seco-21β-H-hop-22(29)-en-3-óico (MR12), podendo tratar-se de compostos inéditos. Há relatos na literatura do isolamento de hop-22(29)-3-β-ol, mas não há dados de RMN de 13C para comparação. MR08 e MR12 foram isolados como misturas e não foi possível obter dados de RMN 2D para a elucidação inequívoca da estrutura química desses compostos.
Dos compostos isolados, apenas MR01 e MR02 (friedelina e friedelinol) haviam sido identificados em M. robusta. MR01 e MR02 foram isolados, ao todo, em quantidade expressiva (4,86 g), 13,5% do material obtido a partir da extração
com hexano (SEHF e EHF) e 0,6% da massa das folhas utilizadas (864,4 g). Há relatos na literatura da atividade anti-inflamatória, analgésica e antipirética da friedelina (MR01), assim, MR01 e MR02 poderão ser utilizados para posteriores transformações químicas e estudos da relação estrutura atividade.
O isolamento de triterpenos pentacíclicos está de acordo com o perfil químico de outras espécies do gênero Maytenus. Porém, triterpenos de esqueleto hopano não são comuns em membros da família Celastraceae e não há relatos para o gênero Maytenus. Portanto, 3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno (MR10) poderia ser utilizado como marcador químico para a identificação quimiotaxonômica de M. robusta.
Nos testes in vitro de atividade de inibição da enzima acetilcolinesterase, os resultados obtidos para MR05 e MR10 foram promissores, abrindo perspectivas para a realização de novos testes que possam ou não comprovar a atividade dessas substâncias frente à doença de Alzheimer. A quantidade de MR10 obtida (512,7 mg) possibilita a realização de semi-síntese buscando melhoria da atividade. Também, foram obtidos bons resultados para os extratos clorofórmico, acetato etílico e metanólico das folhas de M. robusta, os quais poderão ser fracionados e a atividade de inibição da AChE atribuída a uma determinada substância ou grupo de substâncias. O sólido obtido durante o preparo do extrato clorofórmico mostrou-se ativo frente a S. aureus, C. albicans e B. cereus. O extrato acetato etílico apresentou atividade frente a B. cereus, S. typhimurium, S. aureus e C. albicans e o sólido do extrato hexânico apresentou atividade frente a C. albicans. Após o fracionamento desses materiais, outros testes com micro-organismos poderão ser realizados.
Por fim, o estudo fitoquimico das folhas de M. robusta permitiu a identificação e a realização de testes biológicos com novos metabólitos secundários. Além disso, foi possível contribuir para o estudo quimiotaxonômico da família Celastraceae. Do extrato hexânico, foram isolados triterpenos de esqueleto hopano, que não são comuns em membros dessa família, e obteve-se uma quantidade expressiva de friedelina e friedelinol. Assim, a continuidade dos estudos com outros extratos das folhas e com outras partes da planta, aponta a possibilidade de identificar novos metabólitos secundários com atividade biológica.